Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar
6 agosto 2018
I protocolli descritti nel presente documento forniscono una metodologia chiara e accessibile per la misurazione della proteina solubile e digeribile (non strutturali) carboidrati contenuti nei tessuti vegetali. La capacità di quantificare questi macronutrienti due pianta ha implicazioni significative per far progredire i campi di fisiologia vegetale, ecologia nutrizionale, interazioni pianta-erbivoro ed ecologia alimentare-web.
Questo metodo consente ai ricercatori nel campo delle scienze vegetali e dell'ecologia nutrizionale di misurare con precisione le concentrazioni di proteine solubili e carboidrati digeribili nei tessuti vegetali. Il vantaggio principale di queste tecniche è che offrono un metodo semplice e veloce per quantificare questi due macronutrienti incredibilmente importanti con un'elevata precisione. Queste tecniche hanno forti implicazioni per il campo dell'ecologia perché le proteine vegetali e i carboidrati costituiscono la base delle reti alimentari terrestri.
In generale, le persone che non conoscono questa tecnica possono avere difficoltà perché ci sono diversi passaggi e alcune tecniche che non vengono comunemente eseguite in un laboratorio di uso generale. Per iniziare, pesare i campioni replicati di ciascun tessuto in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate. Quindi, registra la massa precisa di ciascun campione.
Utilizzando un micropipettatore, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a ciascuna provetta. Chiudere bene i coperchi e scaldare i tubi per 30 minuti. Quindi, immergere i tubi in un bagno di acqua calda preriscaldata per 15 minuti.
Successivamente, centrifugare le provette a 15.000 G per 10 minuti. Pipettare il surnatante in nuove provette per microcentrifuga etichettate, utilizzando un nuovo puntale per pipetta per ogni campione. Aggiungere 300 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 al pellet e ripetere la centrifugazione per 10 minuti.
Successivamente, rimuovere il surnatante e trasferirlo nelle provette contenenti il surnatante della prima centrifugazione. Per neutralizzare il pH del surnatante, aggiungere 11 microlitri di acido cloridrico molare 5,8 molare. Usa la cartina di tornasole per confermare che il pH è di circa sette.
Quindi, aggiungere 90 microlitri di acido tricloroacetico al 100% in ogni tubo. Quindi incubare le provette su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i campioni a 13.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Utilizzare con cautela una linea per il vuoto e una punta per micropipetta in vetro per rimuovere l'acido tricloroacetico. Fare molta attenzione a non disturbare il pellet con la punta di aspirazione. Successivamente, lavare il pellet con 100 microlitri di acetone raffreddato a 20 gradi Celsius, quindi lasciare evaporare l'acetone in una cappa aspirante.
Sciogliere il pellet proteico con un millilitro di idrossido di sodio. Potrebbero essere necessari ulteriori cicli di riscaldamento, vortice e riscaldamento sonico. Aggiungere 160 microlitri di ciascuna soluzione standard IGG a una piastra a 96 pozzetti in triplice copia, iniziando dalla posizione A1 Successivamente, in una nuova provetta da 1,5 millilitri, aggiungere 50 microlitri di ciascuna soluzione campione a 950 microlitri di acqua distillata.
Quindi aggiungere 60 microlitri di ciascun campione diluito alla piastra a pozzetti in triplice copia, iniziando dalla posizione H1. Aggiungere 100 microlitri di acqua distillata a tutti i pozzetti del campione vuoti e sconosciuti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di colorante proteico Coomassie Brilliant Blue G-250 a ciascun pozzetto della piastra.
Usando un ago, fai scoppiare le bolle presenti nei pozzetti. Successivamente, lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per registrare i valori di assorbanza per ciascun pozzetto a 595 nanometri.
Innanzitutto, pesare le repliche di ciascun campione di tessuto in provette di vetro da 15 millilitri. Etichettare le provette e registrare la massa esatta di ciascun campione. Quindi, aggiungere un millilitro di acido solforico molare 0,1 a ciascuna provetta e chiudere bene i tappi.
Quindi immergere i tubi in un bagno di acqua bollente per un'ora. Trasferire i tubi a bagnomaria tiepido per raffreddarli. Quindi versare il contenuto delle provette in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate.
Dopo questo centrifugare le provette a 15, 000 G per 10 minuti. Utilizzare una micropipetta per trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 millilitri etichettate. Utilizzando una pipetta, trasferire 15 microlitri di ogni campione sconosciuto nella propria provetta.
Quindi aggiungere 385 microlitri di acqua distillata in ogni tubo. In una cappa aspirante aggiungere 400 microlitri di fenolo al 5% a ogni provetta campione standard e sconosciuto. Subito dopo aggiungere due millilitri di acido solforico a ciascun tubo.
Assicurati di aggiungere l'acido solforico sulla superficie della soluzione. Dopo aver incubato le provette per 10 minuti, agitare le provette. Quindi incubare la provetta per altri 30 minuti.
Trasferire 800 microlitri da ciascuna provetta del campione a tre semi-microcuvette di polistirene da 1,5 millilitri. Quindi impostare lo spettrofotometro in modo che legga a 490 nanometri e calibrarlo con una cuvetta vuota. Infine, far passare ogni cuvetta attraverso lo spettrofotometro e registrare l'assorbanza.
Utilizzando questo protocollo, sono state analizzate le proteine solubili e il contenuto di carboidrati digeribili di quattro diversi tessuti di campo e di mais dolce provenienti da tre regioni geografiche. Sono state osservate differenze significative nel contenuto di proteine solubili tra le regioni, rendendo quindi necessarie analisi separate per ciascuna regione. Tra le regioni c'erano diverse differenze nel contenuto di proteine solubili e carboidrati digeribili tra i tessuti.
In Minnesota, i tessuti variavano solo nel contenuto di proteine solubili, mentre i tessuti della Carolina del Nord variavano sia nelle proteine solubili che nei carboidrati digeribili. La variabilità del contenuto di macronutrienti tissutali in Texas dipendeva dalla varietà. Questa tecnica consentirà ai ricercatori nel campo delle scienze vegetali e dell'ecologia nutrizionale di misurare con precisione le proteine vegetali solubili e i carboidrati digeribili, piuttosto che estrapolare da misure elementari.
Non dimenticare che lavorare con azoto liquido, acidi concentrati e basi, può essere estremamente pericoloso. Quindi usa sempre precauzioni come guanti, occhiali di sicurezza, grembiuli e scarpe chiuse ogni volta che lavori con queste sostanze chimiche.
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Panoramica
Questo articolo presenta metodologie per la misurazione di proteine solubili e carboidrati digeribili nei tessuti vegetali. Queste tecniche sono fondamentali per comprendere la fisiologia vegetale e le interazioni ecologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Scienze vegetali
- Ecologia nutrizionale
- Ecologia
Sfondo
- La quantificazione dei macronutrienti è essenziale per lo studio delle reti trofiche.
- Le proteine e i carboidrati solubili sono alla base degli ecosistemi terrestri.
- I ricercatori alle prime armi potrebbero trovare le tecniche difficili a causa della complessità.
- Una misurazione accurata è fondamentale per la ricerca ecologica.
Scopo dello studio
- Fornire una metodologia chiara per la misurazione dei macronutrienti vegetali.
- Migliorare la comprensione delle interazioni tra piante ed erbivori.
- Sostenere la ricerca in fisiologia ed ecologia vegetale.
Metodi Utilizzati
- Pesare campioni replicati di tessuto vegetale.
- Utilizzare provette microcentrifuga etichettate per la conservazione dei campioni.
- Registrare la massa precisa di ciascun campione.
- Seguire protocolli specifici per una misurazione accurata.
Risultati principali
- Le tecniche forniscono un'elevata accuratezza nella misurazione dei macronutrienti.
- I metodi sono rapidi e semplici una volta acquisiti.
- I risultati hanno implicazioni significative per gli studi ecologici.
- Permette una migliore comprensione del contenuto nutrizionale delle piante.
Conclusioni
- È possibile effettuare una misurazione accurata delle proteine e dei carboidrati solubili.
- Questi metodi possono far progredire la ricerca in diversi settori ecologici.
- Comprendere i macronutrienti vegetali è fondamentale per la dinamica delle reti trofiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
La quantificazione accurata dei macronutrienti vegetali supporta la validazione degli obiettivi in ecologia nutrizionale e la riduzione del rischio meccanicistico nei modelli di interazione pianta-erbivoro. La misurazione diretta di proteine solubili e carboidrati digeribili migliora l'affidabilità predittiva negli studi sulla dinamica delle reti trofiche, riducendo la dipendenza da correlazioni elementari estrapolate. Ciò consente una scoperta più affidabile di biomarcatori traslazionali e lo sviluppo di modelli preclinici nella ricerca basata sulle piante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi nutrizionali fornendo dati precisi su proteine solubili e carboidrati per la validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la quantificazione riproducibile di macronutrienti vegetali chiave in diversi tipi di tessuto e aree di coltivazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce output standardizzati e quantitativi per saggi di proteine solubili e carboidrati digeribili, facilitando la prontezza e la scalabilità dei saggi.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso passaggi di digestione ottimizzati e rilevamento colorimetrico, consentendo una valutazione affidabile dei composti nei flussi di lavoro di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la nutrizione minerale delle piante ai processi fisiologici, sostenendo una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Valore operativo: Fornisce dati di sistema pertinenti alle malattie per studi di ecologia nutrizionale, migliorando le decisioni di avanzamento corrette per il rischio nella ricerca basata sulle piante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta fornendo dati quantitativi sui macronutrienti che orientano la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei modelli di interazione pianta-erbivoro.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico mediante la misurazione accurata di proteine solubili e carboidrati digeribili.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso letture colorimetriche quantitative del contenuto di proteine solubili e carboidrati.
- Analisi: Genera misurazioni spettrofotometriche precise a 595 nm (proteine) e 490 nm (carboidrati) per confrontare le condizioni tra diversi tessuti e regioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il contenuto nutrizionale delle piante a risultati ecologici, supportando l'allineamento di biomarcatori negli studi sulle dinamiche delle reti trofiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la quantificazione di macronutrienti applicabile a diverse specie vegetali e contesti di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nei saggi nutrizionali delle piante, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella modellizzazione ecologica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della quantificazione di proteine e carboidrati solubili.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o abbandono nella validazione degli obiettivi, efficienza del capitale nello sviluppo dei saggi, riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei modelli preclinici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio degli obiettivi basati su piante, in base a profili di macronutrienti validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel trattamento dei tessuti vegetali, nei saggi colorimetrici e nell'analisi spettrofotometrica.
- Necessita di strumentazione come microcentrifughe, bagni termostatici, vortex e spettrofotometri per micropiastre.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i passaggi di digestione, neutralizzazione e precipitazione al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comprende considerazioni di adattamento relative a diversi tessuti vegetali, specie e origini geografiche.
- Presenta limitazioni pratiche, come la manipolazione di reagenti pericolosi (NaOH, HCl, TCA, fenolo, acido solforico), che richiede rigorosi protocolli di sicurezza.
