Name: Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Scopri come quantificare proteine solubili e carboidrati digeribili nel tessuto vegetale utilizzando Zea mays. Questa metodologia precisa supporta la ricerca in fisiologia vegetale ed ecologia nutrizionale.

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Grazie a tutti i nostri collaboratori che hanno assistito con raccolte di campi di mais dolce, tra cui Dominic Reisig e Dan Mott alla North Carolina State University e Pat Porter alla Texas A & M University a Lubbock, TX. Grazie a Fiona Clissold per aiutare ad ottimizzare i protocolli e per fornire le modifiche apportate a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Texas A & M C. Everette Stancapiano Fellowship (Department of Entomology) e il programma di sovvenzione di valutazione biotecnologia rischio competitivo concedere no. 2015-33522-24099 dal dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti (assegnato a GAS e STB).

1. impianto di raccolta e elaborazione
<ol><li>Raccogliere ed elaborare i campioni di pianta<ol>
<li>Dopo aver raccolto campioni di piante, flash-congelare campioni immergendo il materiale vegetale in azoto liquido con forcipe e conservare a-80 ° C. Se i campioni di pianta raccolti sono troppo grandi per flash-freeze, raffreddare rapidamente i campioni utilizzando ghiaccio secco e il trasferimento di un congelatore a-80 ° C appena possibile. Il contenuto di macronutrienti di materiale vegetale può cambiare dopo tessuti sono separati dalla pianta, quindi è importante congelare i campioni di pianta più presto possibile dopo la raccolta. Attenzione: Azoto liquido può causare congelamento severo quando a contatto con la pelle. Si prega di assicurarsi che per il trasporto di azoto liquido in contenitori omologati e indossare adeguato PPE durante la sua movimentazione, tra cui cryo-guanti, occhio googles, visiera, grembiule e un camice da laboratorio.</li>
		<li>Lyophilize materiale vegetale con un liofilizzatore per garantire che i tessuti sono metabolicamente inattivi mentre acqua viene rimossa. A secco fino a quando la massa del campione si stabilizza per garantire tutta l'acqua è stata rimossa.</li>
		<li>Una volta i campioni sono asciutti, macinare in una polvere fine utilizzando una smerigliatrice o mulino. Conservare i campioni in un armadietto di inaridimento fino all'analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analisi della proteina solubile
<ol><li>Preparazione del campione<ol>
<li>Pesare campioni replicati di ogni tessuto, circa 20 mg ciascuno, in polistirolo per microcentrifuga da 1,5 mL e tubi di etichetta. Questi campioni saranno in seguito essere denominati campioni incogniti. Registrare la massa esatta di ciascun campione, come queste informazioni è necessario calcolare la % di proteine solubili in ogni campione sconosciuto. Utilizzare per microcentrifuga con coperchi di chiusura, come coperchi non di blocco possono aprire durante la fase di riscaldamento successivo, con conseguente perdita della soluzione campione.</li>
	</ol></li>
	<li>Solubilizzano e isolare proteine del campione sconosciuto<ol>
<li>Utilizzo di una micro-pipetta, aggiungere 500 µ l di 0.1 M NaOH in ogni provetta. Chiudere ermeticamente il coperchio e Sonicare per 30 minuti. Preriscaldare un acqua calda bagno 90 ° C. Attenzione: Idrossido di sodio è una base forte e possono provocare ustioni a contatto con la pelle. Anche se 0,1 M NaOH rappresenta una concentrazione bassa, indossare guanti protettivi per evitare irritazioni della pelle.</li>
		<li>Inserire le provette in una rastrelliera nel bagno di acqua calda per 15 minuti.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 minuti. Dispensare il liquido supernatante nei nuovi con etichetta microcentrifuga, utilizzando un nuovo puntale per ogni campione. Aggiungere 300 µ l di 0.1 M NaOH nella provetta contenente il pellet e centrifugare nuovamente a 15.000 x g per 10 minuti. Ancora una volta, raccogliere il supernatante e combinarlo con altri il sovranatante dallo stesso campione. Si tratta di un potenziale punto di sosta, e campioni possono essere conservati a 4 ° C durante la notte se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitare le proteine vegetali<ol>
<li>Neutralizzare il pH della soluzione supernatante aggiungendo 11 µ l di 5,8 M HCl. confermare un pH di 7 ~ immergendo tornasole in ogni soluzione di esempio. Attenzione: L'acido cloridrico è un acido forte corrosivo che possa causare ustioni a contatto con la pelle (applicazione cutanea o per inalazione). Si prega di indossare guanti per evitare irritazioni della pelle durante la manipolazione di HCl.</li>
		<li>Aggiungere 90 µ l di 100% acido tricloroacetico (TCA) in ogni provetta e incubare le provette in ghiaccio per 30 minuti. La precipitazione delle proteine si trasformerà la soluzione da trasparente ad opaco. Se questo non si verifica dopo 30 minuti, conservare le provette per 1 ora. Si tratta di un potenziale punto di sosta, e campioni possono essere conservati a 4 ° C durante la notte se necessario. Attenzione: Acido tricloroacetico è corrosivo. Indossare guanti durante la manipolazione per evitare il contatto con la pelle ed evitare l'inalazione.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 minuti a 4 ° C. Rimuovere con delicatezza TCA surnatante l'aspirazione mediante una linea del vuoto attaccata a una punta di una micropipetta di vetro fine (la stessa punta può essere utilizzata attraverso campioni). Non disturbare il pellet di proteine evitando aspirazione pesante e mantenere una distanza adeguata tra il puntale e il pellet.
</li>
		<li>Pellet di lavare rapidamente con 100 µ l di acetone da-20 ° C. Questo passaggio rimuove qualsiasi TCA rimanente dal pellet, che può interferire con l'analisi di Bradford successiva; Tuttavia, acetone inizierà a sciogliere il pellet di proteina se rimane a contatto troppo a lungo, in modo da acetone dovrebbe aggiungersi poi rapidamente Estratto dal pellet entro 5 secondi.</li>
		<li>Consentire l'acetone a evaporare mettendo tubi in una cappa aspirante o frigorifero. Quindi, dissolva la pallina di proteina aggiungendo 1 mL di NaOH M 0.1 a ciascuna provetta. Sciogliere completamente il pellet potrebbe richiedere diversi cicli di riscaldamento in un acqua calda vasca, Vortex e sonicating. Nota: Il più a lungo i tubi sedersi la cappa o frigorifero e secco il pellet fatti, tanto più difficile sarà ri-solubilizzare. Si consiglia di asciugare il pellet per 30 minuti, e quindi verificare la presenza di acetone ogni 10-15 minuti fino a quando è chiaro che l'acetone evaporato (nessun vapori di acetone sono rilevabili).</li>
	</ol></li>
	<li>Mescolare soluzioni standard, diluire soluzioni campione sconosciuto e quantificare il contenuto proteico totale dei campioni sconosciuti utilizzando l'analisi di Bradford.<ol>
<li>Preparare a bovino dell'immunoglobulina G (IgG) soluzioni standard secondo concentrazioni elencate in tabella 1 (liofilizzato o soluzione di riserva di IgG può essere miscelato con acqua deionizzata per ottenere ogni concentrazione). Conservare gli standard a 4 ° C. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 160 µ l di ciascuna soluzione standard di IgG in triplice copia a partire dalla posizione di A1 della piastra ben (0 µ g / µ l in A1, A2, A3 posizione, 0,0125 µ g / µ l in B1, B2, B3 posizioni, ecc.).</li>
		<li>Preparare una soluzione di NaOH diluita aggiungendo 50 µ l di NaOH M 0.1 a 950 µ l di acqua distillata. Come controllo negativo vuoto, aggiungere 60 µ l di questa soluzione alla piastra ben in triplice copia (G1, G2, G3 posizioni).</li>
		<li>Preparare le diluizioni dei campioni sconosciuti aggiungendo 50 µ l di ogni soluzione di campione a 950 µ l di acqua distillata in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 60 µ l di ciascun campione diluito alla piastra ben in triplice copia, a partire dalla posizione di H1. Per l'analisi di 25 campioni sconosciuti quando letti in triplice copia, 6 standard e 1 vuoto dovrebbe consentire una piastra a 96 pozzetti. Ogni piatto ben analizzato dovrebbe contenere propri campioni standard e vuoti di IgG.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di acqua distillata a tutti i pozzetti di campioni in bianco e sconosciuto. Ora ognuno bene deve contenere un totale di 160 µ l. utilizzando una pipetta multicanale (8 canali), aggiungere 40 µ l di proteina del G-250 di blu brillante Coomassie tintura ad ogni bene nella prima colonna della piastra bene. Mescolare la tintura con i campioni immergendo ripetutamente. Ripetere per tutte le altre colonne, sostituendo i puntali per evitare la contaminazione. Attenzione: G-250 di blu brillante Coomassie è un irritante e contatto con la pelle, gli occhi, o i polmoni dovrebbero essere evitati. Si prega di indossare guanti per evitare il contatto con la pelle. In caso di contatto con la pelle, questo prodotto si macchia.</li>
		<li>Utilizzare un ago per pop tutte le bolle presenti nei pozzetti, che potrebbero interferire con la lettura di spettrofotometro di micropiastre. Pulire l'ago per evitare la contaminazione tra pozzetti. Lasciate che la micropiastra Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
		<li>Utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre, registrare i valori di assorbanza di ciascun pozzetto a 595 nm.</li>
		<li>Annotare l'assorbanza media per tre pozzetti del bianco e sottrarre questo valore da ciascuna delle letture del campione standard e sconosciuta. Quindi, annotare l'assorbanza media per ciascun campione standard e sconosciuta. Nota: Per calcolare la quantità di proteine presenti in ciascun campione sconosciuto utilizzando la curva standard, è più facile a regredire l'assorbanza media di ogni standard contro la microgrammi di proteine presenti in ogni livello, ma uno può tracciare la concentrazione nella proteina (µ g / µ l) di ogni standard se auspicabile. I calcoli seguenti, tuttavia, fare riferimento a una curva standard basata su microgrammi, non le concentrazioni (µ g / µ l).</li>
		<li>Tracciare l'assorbanza media di ogni standard contro la quantità totale di proteine presenti in ogni standard ben (tabella 1). Montare una retta di regressione lineare a questi dati e utilizzare l'equazione per calcolare la quantità di proteina (µ g) in ciascun campione sconosciuto ben basato sull'assorbanza media (Figura 1a). Nota: Il coefficiente di correlazione (valorer ) di questa linea deve essere maggiore di 0,98 e ordinariamente vicino a 0,99. La regressione standard sarà specifica per ogni piatto, quindi pozzetti sconosciuto in ogni piatto devono essere analizzati separatamente.</li>
		<li>Una volta che la quantità media di proteina è calcolata per ciascun pozzetto campione sconosciuto, è possibile utilizzare la seguente equazione per calcolare la quantità totale di proteine (µ g) ogni campione originale: Mp = (((Wp60) x 1000) / 50) * 1000 Mp = µ g di proteina nel campione originale Wp = µ g di proteina nel campione sconosciuto ben<ol>
<li>Quindi, utilizzare la seguente equazione per determinare la percentuale di proteine in ogni campione: Pp = ((Mp/1000) /Mi) * 100 Pp = % proteina nel campione Mmi = massa iniziale del campione (mg) Nota: In alcuni casi, il campione può superare la soglia di assorbanza superiore. In questo caso, esempi di soluzioni possono richiedere un'ulteriore diluizione al punto 2.4.3. Ulteriori diluizioni devono quindi essere contabilizzati nei calcoli successivi. Alcune marche di lettore di micropiastre anche forniscono software per computer che calcola automaticamente la concentrazione di proteina medio di ogni campione sconosciuto sulla base dei dati di curva standard.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. digeribile di carboidrati Assay
<ol><li>Preparazione del campione<ol>
<li>Pesare campioni replicati di ogni tessuto, circa 20 mg, in vetro provette da 15 mL con tappo a vite gommati (100 mm di lunghezza). Queste campione verrà in seguito essere denominati campioni incogniti. Etichettare le provette con un pennarello impermeabile o con etichettatura nastro sui coperchi e registrare la massa esatta di ciascun campione, come queste informazioni è necessario calcolare la % di carboidrati in ogni campione sconosciuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre carboidrati digeribili da ogni campione sconosciuto.<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di 0,1 M H2così4 a ciascuna provetta e tappi a vite su tubi strettamente. Posto in un bagno di acqua bollente per 1 ora. Attenzione: L'acido solforico è molto corrosivo. Si prega di indossare guanti, occhio googles e un grembiule maneggiare H2così4 ed eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.</li>
		<li>Rinfrescarsi con tubi in bagno d'acqua tiepida. Versare filmato contenuto nel etichettati 1,5 mL microcentrifuga (non essere preoccupati se alcuni pianta resti materiali dei tubi di vetro).</li>
		<li>Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 minuti. Rimuovere il liquido supernatante con micro-pipettatore e mettere in nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta. Tubi possono essere refrigerati a questo punto durante la notte. Se continuando con l'analisi, fare riferimento al punto 3.3.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescolare soluzioni standard e quantificare il contenuto di carboidrati digeribili totale dei campioni sconosciuti.<ol>
<li>Preparare D(+) glucosio soluzioni standard con le concentrazioni elencate in tabella 2. Preparare sei provette di vetro con 400 µ l di ciascuna soluzione.</li>
		<li>Pipettare 15 µ l di ogni campione sconosciuto nella propria provetta e aggiungere 385 µ l di acqua distillata a ciascuna per un volume totale di 400 µ l in ogni provetta. In una cappa, aggiungere 400 µ l di fenolo al 5% per ogni provetta di campione standard e sconosciuta e quindi rapidamente Pipettare 2 mL di concentrato H2SO4 in ogni provetta. Non toccare il contenuto della provetta con il puntale della pipetta, basta aggiungere alla superficie di soluzione (una pipetta a ripetizione funziona meglio per questo).</li>
		<li>Lasciate che tubi Incubare per 10 minuti e poi accuratamente vortice i tubi per mescolare il contenuto. Incubare per altri 30 minuti. Attenzione: Fenolo e acido solforico sono sostanze irritanti corrosivi. Per proteggere dall'esposizione della pelle, occhi e inalazione, questo passaggio deve essere eseguito in una cappa chimica utilizzando il PPE adeguato, che comprende: faccia scudo o occhio occhiali di protezione, guanti di gomma, grembiule di laboratorio e stivali. Miscelazione fenolo con acido solforico anche risultati in una reazione esotermica, che si tradurrà nei tubi diventando caldo.</li>
		<li>Pipettare 800 µ l di campione da ciascuna provetta in ognuna delle 3 cuvette semimicro di polistirolo da 1,5 mL (3 tecniche ripetizioni per campione). Impostare lo spettrofotometro a leggere a 490 nm. Calibrazione di una provetta vuota contenente acqua distillata prima di leggere norme o campioni incogniti e ad intermittenza durante letture campione. Eseguire ogni provetta attraverso uno spettrofotometro e annotare l'assorbanza. Media in tecnico replica per ogni campione sconosciuto. Nota: In alcuni casi, i campioni possono superare la soglia di assorbanza superiore. In questo caso, i campioni devono essere diluiti al punto 3.2.3. Diluizioni devono essere contabilizzati anche nei calcoli successivi.</li>
		<li>Calcolare l'assorbanza media per ogni standard. Nota: Per calcolare la quantità di carboidrati digeribili totali presenti in ogni campione sconosciuto utilizzando la curva standard, è più facile a regredire l'assorbanza media di ogni standard contro la microgrammi di D (+) glucosio presente in ogni standard, ma si può anche tracciare la concentrazione di glucosio di D (+) (µ g / µ l) di ogni standard se auspicabile. I calcoli seguenti, tuttavia, fare riferimento a una curva standard basata su microgrammi, non le concentrazioni (µ g / µ l).</li>
		<li>Calcolare la curva standard tracciando l'assorbanza media contro la quantità totale di D (+) glucosio (µ g) in ogni soluzione standard. Forma una retta di regressione lineare a questi dati e quindi utilizzare la seguente equazione per calcolare la quantità totale di carboidrati (µ g) in ciascun campione sconosciuto: Mc = (((Ax -b)/m)/(15)) * 1000 Mc = µ g di carboidrati nel campione Ax = assorbanza media del campione sconosciuto b = intercetta (linea di regressione standard) m = pendenza (linea di regressione standard) Il coefficiente di correlazione di questa linea dovrebbe essere maggiore di 0,98 e ordinariamente vicino a 0,99. Quindi, utilizzare la seguente equazione per determinare la percentuale di carboidrati in ogni campione: Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100 Pc = % di carboidrati Mmi = massa iniziale del campione (mg)</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Cozzolino, D., Morón, A. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-agricultural-science/article/the-potential-of-near-infrared-reflectance-spectroscopy-to-analyse-soil-chemical-and-physical-characteristics/A65359EFC763568A27100D7D84CBBF6D">The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics.</a> The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).</li>
<li>Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibal+crickets+on+a+forced+march+for+protein+and+salt%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cannibal crickets on a forced march for protein and salt.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).</li>
<li>Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+ecology+beyond+the+individual%3A+a+conceptual+framework+for+integrating+nutrition+and+social+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions.</a> Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).</li>
<li>Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+affects+insect+susceptibility+to+Bt%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nutrition affects insect susceptibility to Bt.</a> Scientific Reports. 7, 39705(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Combinando analisi colorimetriche ben consolidate con protocolli efficace impianto specifico dell'estrazione, le analisi hanno dimostrate qui forniscono un metodo ragionevole e preciso per la misurazione della proteina solubile vegetale e contenuto di carboidrati digeribili. I nostri risultati utilizzando mais come exemplar illustra come questi protocolli possono essere utilizzati per ottenere misurazioni precise tra diverse scale spaziali biologicamente rilevanti. Ad esempio, siamo stati in grado di rilevare differenze ...

Biomassa vegetale costituisce la base di praticamente tutte le reti alimentari terrestri. Piante acquisiscono elementi nutritivi dal terreno tramite i loro sistemi di radici e utilizzano la luce solare nei loro tessuti fogliari di sintetizzare biomolecole. In particolare, carbonio e azoto vengono utilizzati per creare i carboidrati, proteine (composto da aminoacidi) e lipidi che sono necessari per costruire la biomassa vegetale (dovrebbe essere notato che in fisiologia che il termine "dei macronutrienti" spesso si riferisce a elementi del terreno, ad esempio N, vegetale P, K e S, tuttavia, in tutta questa carta questo termine farà riferimento a biomolecole, come proteine, carboidrati e lipidi). Quando erbivori consumano materiale vegetale, i macronutrienti contenuti nei tessuti vegetali sono suddivisi nelle loro parti costituenti e quindi utilizzati per guidare i processi fisiologici del consumatore. In questo modo, i macronutrienti pianta hanno una forte influenza sulla fisiologia dei consumatori con le implicazioni importanti per interazioni ecologiche di più alti ordine e cibo-web dinamiche.
In tutto il Regno animale, proteina solubile e carboidrati digeribili sono i macronutrienti più strettamente legati alla sopravvivenza, riproduzione e prestazioni1. Inoltre, la maggior parte degli animali regola attivamente la loro assunzione di questi due macronutrienti per soddisfare le loro esigenze fisiologiche1,2. Ciò è particolarmente vero per gli insetti erbivori che rilevano le concentrazioni di zuccheri e aminoacidi nei tessuti vegetali, che a sua volta indirizza il comportamento alimentare. Di conseguenza, pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili ha svolto un ruolo forte nell'evoluzione delle interazioni pianta-insetto.
Mentre i dati sulla pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili sono relativamente rari (ma Vedi6,7,8,9,10,11), c'è una preponderanza di dati disponibili sul contenuto elementare pianta (carbonio, azoto e fosforo). In gran parte questo è perché gli elementi svolgono un ruolo primario nella pianta nutrizione minerale3,4,5. Dove gli elementi sono misurati, le correlazioni sono state utilizzate per estrapolare la quantità di proteina solubile e carboidrati digeribili, ma calcoli accurati sono spesso difficili da ottenere. Per esempio, è Impossibile utilizzare il carbonio come un indicatore del contenuto di carboidrati digeribili pianta perché il carbonio è ubiquitariamente presente in tutti i composti organici. Esiste una relazione più forte tra azoto elementare e contenuto di proteina solubile di pianta, e fattori di conversione generalizzati azoto / proteine sono spesso utilizzati. Tuttavia, c'è forte evidenza che le conversioni di azoto / proteine sono altamente specie-12,13,14,15, rendendo probabile l'uso di conversione generalizzato imprecise. Per questo motivo, fattori di conversione dell'azoto / proteine spesso mancano di precisione, particolarmente per quanto è necessario per gli studi nutrizionali erbivori. Inoltre, la presenza di N-contenente pianta allelochemicals, come alcaloidi e glucosinolati che spesso sono tossici per gli erbivori, può confondere queste conversioni.
Qui, vi offriamo due analisi chimiche per misurare la concentrazione di proteine solubili e carboidrati digeribili nei tessuti vegetali. Queste analisi sono presentate separatamente, ma è suggerito che essi essere utilizzati contemporaneamente per analizzare i campioni di pianta stessa al fine di realizzare un'analisi più completa dei macronutrienti pianta. Entrambi utilizzano metodologie simili, costituito da una fase di estrazione, seguita da quantificazione tramite assorbanza. Preparazione di campioni di pianta anche è identico per entrambi i protocolli, che lo rende facile da eseguire entrambe le analisi in tandem. L'utilità di questi test non deriva da loro novità, come si affidano più anziani, (Bradford, Jones, Dubois) consolidata saggi colorimetrici16,17,18, ma qui abbiamo organizzato una chiara e facile da seguire protocollo che unisce questi metodi con più oscuri estrazione impianto specifiche tecniche17,19 al fine di rendere l'applicazione di questi saggi più accessibile a coloro nei campi rilevanti per la pianta.
Per entrambi i dosaggi, pianta macronutrienti prima vengono estratti fisicamente da congelamento, liofilizzazione e macinazione del materiale vegetale. Per il dosaggio di proteina solubile, ulteriore estrazione chimica è fatto17,19 attraverso diverse fasi di agitazione e riscaldamento campioni in soluzione di NaOH. L'analisi di Bradford ben noto, utilizzando G-250 di blu brillante Coomassie, viene quindi utilizzato per quantificare le proteine solubili e polipeptidi tra 3.000-5.000 Dalton16,17. Questo test ha un range tra 1-20 µ g di proteine totali per micropiastra bene o < 25 µ g/mL, ma non misura non acidi amminici liberi. La fase di estrazione del dosaggio dei carboidrati digeribili si basa sul metodo acido diluito di Smith et al. 20 e consente per l'isolamento di zuccheri solubili, amido e fructosan – ma carboidrati non strutturali. Un metodo di quantificazione di acido solforico fenolo è preso da Dubois et al. 18 e misura tutti i mono-, oligo- e polisaccaridi (nonché derivati metile). Questo test è in grado di quantificare gli zuccheri specifici, ma qui lo usiamo come un indicatore del contenuto totale di carboidrati digeribili (Vedi Smith et al. 20 per un'analisi più dettagliata). Insieme, questi saggi misurano i due macronutrienti che sono fortemente legati per prestazioni eco-fisiologia ed erbivoro, fornendo dati importanti sulla qualità della risorsa alla base delle catene alimentari terrestri delle piante. Presentando questi protocolli promuove la generazione dei DataSet dei macronutrienti pianta al fine di ottenere una comprensione più approfondita della fisiologia vegetale, ecologia nutrizionale erbivoro e interazioni pianta-erbivoro.

<table><tbody><tr><td>lettore di micropiastre (spettrofotometro)</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 680 XR</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Concentrato di colorante</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td>450mL</td></tr></tbody></table>

quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (zea mays) as an exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Dati elementari sono comunemente usati per dedurre la qualità della pianta come una risorsa per gli erbivori. Tuttavia, l'ubiquità del carbonio in biomolecole, la presenza di composti difensive vegetali contenenti azoto e variazione nelle specie-correlazioni tra pianta e azoto contenuto proteico tutti limitare l'accuratezza di queste illazioni. Inoltre, ricerca focalizzata sulla pianta e/o fisiologia erbivoro richiedono un livello di precisione che non viene raggiunto utilizzando generalizzato correlazioni. I metodi qui presentati offrono ai ricercatori un protocollo chiaro e rapido per misurare direttamente proteine solubili vegetali e carboidrati digeribili, i macronutrienti due pianta più strettamente legati alle prestazioni fisiologiche degli animali. I protocolli combinano analisi colorimetriche ben caratterizzate con passaggi ottimizzato specifico impianto digestione per fornire risultati precisi e riproducibili. Le nostre analisi di granturco dolce diverso tessuti mostrano che queste analisi hanno la sensibilità per rilevare la variazione nella pianta proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili attraverso più scale spaziali. Questi comprendono le differenze tra pianta attraverso varietà e specie vegetali o regioni in crescita, così come all'interno-pianta differenze nel tipo di tessuto e anche posizionali all'interno del tessuto stesso. Combinazione di proteina solubile e contenuto di carboidrati digeribili con dati elementari ha anche il potenziale per fornire nuove opportunità in biologia vegetale per collegare la nutrizione minerale delle piante con processi fisiologici delle piante. Queste analisi hanno anche contribuiscono a generare la proteina solubile e dati di carboidrati digeribili dovuti studiare ecologia nutrizionale, interazioni pianta-erbivoro e cibo-web dinamiche, che a sua volta migliorerà la fisiologia e ricerca ecologica.

Per mostrare l'utilità di questi metodi, abbiamo analizzato la proteina solubile e il contenuto di carboidrati digeribili di quattro differente campo e tessuti di granturco dolce che fungono da potenziali risorse nutrizionali distinte per gli insetti erbivori. Abbiamo raccolto spighe di grano da tre regioni agricole negli Stati Uniti (Minnesota, North Carolina e Texas), che comprende cinque diverse varietà di granoturco (cioè, genotipi) e una varietà di mais di campo come un outg...

I protocolli descritti nel presente documento forniscono una metodologia chiara e accessibile per la misurazione della proteina solubile e digeribile (non strutturali) carboidrati contenuti nei tessuti vegetali. La capacità di quantificare questi macronutrienti due pianta ha implicazioni significative per far progredire i campi di fisiologia vegetale, ecologia nutrizionale, interazioni pianta-erbivoro ed ecologia alimentare-web.

Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Questo metodo consente ai ricercatori nel campo delle scienze vegetali e dell'ecologia nutrizionale di misurare con precisione le concentrazioni di proteine solubili e carboidrati digeribili nei tessuti vegetali. Il vantaggio principale di queste tecniche è che offrono un metodo semplice e veloce per quantificare questi due macronutrienti incredibilmente importanti con un'elevata precisione. Queste tecniche hanno forti implicazioni per il campo dell'ecologia perché le proteine vegetali e i carboidrati costituiscono la base delle reti alimentari terrestri.In generale, le persone che non conoscono questa tecnica possono avere difficoltà perché ci sono diversi passaggi e alcune tecniche che non vengono comunemente eseguite in un laboratorio di uso generale. Per iniziare, pesare i campioni replicati di ciascun tessuto in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate. Quindi, registra la massa precisa di ciascun campione.Utilizzando un micropipettatore, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a ciascuna provetta. Chiudere bene i coperchi e scaldare i tubi per 30 minuti. Quindi, immergere i tubi in un bagno di acqua calda preriscaldata per 15 minuti.Succes

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Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione di carboidrati muro derivate.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

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Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel

Questo video descrive un metodo colorimetrico per quantificare il contenuto di proteine solubili nei tessuti vegetali. Il metodo utilizza il colorante Coomassie Brilliant Blue G-250, che interagisce con la proteina solubile per formare un complesso proteico-colorante stabile di colore blu, proporzionale al contenuto di proteine solubili nel tessuto.

Saggio delle proteine solubili per quantificare il contenuto di proteine solubili nei tessuti vegetali

Questo video descrive il metodo per quantificare i carboidrati digeribili presenti nei tessuti vegetali. Questo aiuta a raccogliere dati da vari tessuti vegetali per studiare l'ecologia nutrizionale, le interazioni pianta-erbivoro e le dinamiche della rete alimentare.

Saggio colorimetrico per la quantificazione di carboidrati non strutturali in tessuti vegetali

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Scopri come quantificare proteine solubili e carboidrati digeribili nel tessuto vegetale utilizzando Zea mays. Questa metodologia precisa supporta la ricerca in fisiologia vegetale ed ecologia nutrizionale.

Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar

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