Name: PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Scopri la PCR quantitativa per enumerare il batteriofago T7 con precisione e rapidità. Questo metodo supporta esperimenti di biopanning e diagnostica virologica avanzata.

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Questo lavoro è stato supportato da PhRMA Foundation Research Grant Starter e cuore nazionale, polmone e sangue Institute of National Institutes of Health concedere sotto numero premio R01HL138251.

1. primer Design e analisi di DNA Genomic di fago T7
<ol><li>Disegno primer per l'amplificazione del DNA genomico di fago T7. Nota: F (in avanti) e R (retromarcia) primer (Vedi Tabella materiali) amplificano la sequenza del DNA T7 situato a Monte della regione variabile libreria (Figura 1).</li>
	<li>Scegliere un analizzatore di primer appropriato per valutare i parametri degli iniettori, compreso temperatura di fusione (Tm), contenuto percentuale di GC (GC %), dimeri dell'iniettore, tornante formazione e idoneità PCR (Figura 1).</li>
	<li>Ordinare gli oligonucleotidi primer (oligos) e all'arrivo, risospendere i oligos liofilizzato in dnasi e RNasi gratis acqua ultra-pura per fare le concentrazioni stock di 100 µM in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C per diversi mesi.</li>
	<li>Fare diverse aliquote (circa 50 µ l in ogni provetta da 1,5 mL) dello stock primer 100 µM. Nota: Questo passaggio viene utilizzato per evitare cicli di gelo-disgelo frequenti.</li>
</ol>2. preparare gli standard per la quantificazione del DNA genomico di fago T7
<ol><li>Diluire in serie riferimento 0,1 µ g / µ l (1.0 x 108 fg / µ l) del DNA del fago T7 (acquistato; a una concentrazione nota di 0,1 µ g / µ l, vedi materiali) 10 volte da 1.0 x 106 a 1,0 x 100 fg / µ l con ultra-puro di H2O in provette per PCR 0,2 mL. Preparare ciascuna concentrazione in un volume totale di 20 µ l (Figura 2).</li>
	<li>Vortice della PCR provette per garantire la miscelazione accurata in ogni fase di diluizione. Inoltre, modificare suggerimenti quando si aggiunge il campione di DNA per la diluizione seguente. Nota: Si consiglia di preparare la nuova soluzione di campioni di DNA per una curva standard per ogni batch dell'esperimento qPCR.</li>
	<li>Utilizzare l'equazione 1 (sotto) per convertire per riferimento fago T7 concentrazioni nel DNA da fg / µ l in copie del genoma (gc) /µL (Figura 2).</li>
	<li>Concentrazione di DNA fago T7 in gc / µ l = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) Nota: bp: coppia di basi; riferimento del DNA di genomic T7 è 37314 bp.</li>
</ol>3. pre-trattamento dei campioni prima di fago qPCR reazione preparazione
<ol><li>
(Opzione 1) Pipettare 20 µ l di un clone di T7 (fago) selezionati da biopanning contro in vitro la fibrosi cistica (CF)-come modello di muco in provette per centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1,25 unità di dnasi I (0,5 µ l) per ogni 20 µ l di campione. Nota: Libreria di T7 dei fagi cisteina eptapeptide vincolata (CX7C) era biopanned contro muco CF-come rivestito su inserti di membrana 24-pozzo (Vedi Tabella materiali) per 15 min. Ulteriori dettagli sono forniti nella sezione risultati. Un clone di T7 è stato scelto per la preparazione del campione di qPCR dall'eluato.<ol>
<li>Opzione 2: Dispensare 200 µ l di T7 clonare in un provette da 1,5 mL e aggiungere 5 unità della dnasi I (2 µ l) per ciascun campione. Nota: Il volume del campione dei fagi selezionato in questa fase dipende dal volume raccolto da biopanning. Mentre l'obiettivo del protocollo è la qPCR di biopanned dei fagi, i passaggi per biopanning sono dettagliate nel protocollo utente del fago T7 kit (Vedi Tabella materiali)13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tappare le provette dei campioni fago T7 (punto 3.1) e li Incubare a 37 ° C per 10 min in un bagno secco riscaldato (vale a dire, blocco di calore).</li>
	<li>Incubare le provette (dal punto 3.2) a 100 ° C per 15 min in un bagno secco riscaldato (Figura 3A). Attenzione: Poiché l'evaporazione e la condensazione si verificano durante la fase di riscaldamento, assicurarsi che le provette da 1,5 mL sono limitate completamente.</li>
	<li>Girare i fagi trattato termicamente dal punto 3.3 a 18.534 x g per 10 s. Mix i fagi inserendo il tubo su un Vortex insieme alle modalità di attivazione touch per 10 s e spin a 18.534 x g per 10 s di nuovo. Nota: Il ciclo di spin-mix-spin è per assicurarsi che i campioni dei fagi riscaldata sono ben miscelati.</li>
	<li>Raffreddare le provette a temperatura ambiente (TA) lasciandoli sul banco di esperimento o conservare a 4 ° C in frigorifero durante la notte. Nota: Esperimento può essere messo in pausa in questa fase.</li>
</ol>4. preparare qPCR reazioni
Nota: Una reazione di PCR è per un campione. Ogni reazione di PCR contiene 5 µ l di qPCR master mix (Vedi materiali), 1 µ l di miscela di coppia 5 µM primer, 2 µ l di H2O e 2 µ l di campione di fago T7 trattato termicamente. Per le reazioni di PCR multiple, tutti i reagenti tranne campione dei fagi sono premiscelati in una provetta da 1,5 mL. Il volume di ciascun reagente in premix dipende dal numero di campioni dei fagi per qPCR.
<ol><li>Preparare la premiscela qPCR per 10 biopanned dei fagi campioni di concentrazione sconosciuta e 7 campioni di concentrazioni standard in triplice copia. Di conseguenza, ci sono 51 campioni totali e quindi, 51 qPCR reazioni (cioè, una reazione per campione). Per 51 reazioni, preparare una premiscela di 255 µ l di mix master qPCR (51 x 5 µ l), 51 µ l di primer (51 x 1 µ l) e 102 µ l di H2O (51 x 2 µ l). Nota: Si consiglia di preparare alcune reazioni di PCR extra per compensare la perdita di volume durante Aliquotare il mix di PCR in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti qPCR.</li>
	<li>Aliquotare 8 µ l di premiscela PCR in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti qPCR per un totale di 51 pozzi (cioè, 51 qPCR reazioni). Non c'è nessuna necessità di cambiare suggerimenti durante aliquotare.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di campioni di fago T7 trattato termicamente (punto 3.4) o riferimento di fago T7 DNA (punto 2.1) ad ogni pozzetto (Figura 3B); cambiare suggerimenti quando si aggiungono diversi campioni di DNA al pozzo per evitare la contaminazione incrociata. Inoltre, dispensare i campioni di DNA µ l 2 sotto la superficie di qPCR premix (cioè, nella premiscela PCR 8 µ l).</li>
	<li>Sigillare la piastra qPCR con pellicola adesiva. Nota: Questo passaggio è fondamentale, indipendentemente dal tipo di piastra qPCR. Utilizzare il kit consigliato per sigillare la piastra completamente; in caso contrario, qualsiasi regione non sealed nella piastra causerà la perdita di volume durante la PCR in bicicletta.</li>
	<li>Avvolgere la piastra qPCR con foglio di alluminio per ridurre al minimo la fluorescenza photobleaching e procedere per eseguirlo sulle attrezzature qPCR.</li>
</ol>5. qPCR condizioni di escursioni in bicicletta
Nota: qPCR ciclismo condizioni sono state istituite sulle attrezzature specifiche qPCR (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Eseguire la piastra 96 pozzetti qPCR sull'apparecchiatura qPCR. Sulle attrezzature, selezionare impostazioni dal menu per impostare le seguenti condizioni sperimentali (Figura 3).</li>
	<li>Impostare condizioni come segue per un volume di campione di 10 µ l di ciclismo: un ciclo a 50 ° C per 2 min, un ciclo a 95 ° C per 2 min, seguiti da 40 cicli di (95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 min). Dopo, eseguire le impostazioni della curva di fusione: un ciclo di 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 min e 95 ° C 15 s.</li>
	<li>Procedere per analizzare i dati come descritto nel passaggio 6.</li>
</ol>6. analizzare la qPCR dati grezzi e convertire da qPCR Ct valore in gc / µ l per i batteriofagi T7
<ol><li>Analizzare i dati raw qPCR e valutare la qualità dei dati analizzando i grafici caratteristici dei dati grezzi (Figura 4). Nota: Amplificazione trama, trama multicomponente e trama di curva di fusione sono che la caratteristica chiave trame convalidare la qualità dei dati di qPCR.</li>
	<li>
Calcolare i valori di soglia media ciclo (Ct) dai campioni triplici a ciascuna concentrazione della curva standard (punto 2.1).
	<ol>
<li>Trama media Ct (Y) contro log (gc / µ l) (X) per ottenere la curva lineare Y = kX + b (k è la pendenza della curva lineare, b è l'intercetta).</li>
		<li>Calcolare il coefficiente lineare14 R2 (R2 deve essere &gt; 0,99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la curva standard Y = kX + b per calcolare il numero di T7 fagi nei campioni biopanning (cioè, fagi selezionati contro CF-come muco) in gc / µ l (Figura 5). Nota: k è la pendenza della curva standard.</li>
	<li>Calcolare l'efficienza di amplificazione dalla seguente equazione <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) Nota: k è la pendenza della curva standard generata da qPCR di DNA di riferimento. La gamma ideale di efficienza di amplificazione è 90 – 110%.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
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<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
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<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo sviluppato metodi di qPCR per quantificazione di DNA genomico dei fagi5, e qui abbiamo descritto e adattato un metodo qPCR per enumerare T7 fagi selezionati contro una barriera di CF-come muco. Informazioni minime per le linee guida di pubblicazione di quantitativa Real-Time PCR esperimenti (MIQE) sono stati adattati per sviluppare e validare il metodo qPCR per l'enumerazione di T7 fagi15. Il protocollo che abbiamo sviluppato per quantificare i fagi da esperimenti d...

Tecnologia di visualizzazione del batteriofago (fago), sviluppata da George Smith nel 1985, è un approccio potente, ad alta produttività per identificare ligandi del peptide o della proteina contro bersagli o recettori dalla membrana cellulare, gli antigeni malattia, organelli cellulari o specifici organi e tessuti in passato due decenni1,2. Qui, librerie casuale di polipeptidi o singola catena anticorpi vengono visualizzate sulle proteine cappotto di fagi (in genere M13 o T7) e ligandi specifici possono essere identificati da panning contro proteine immobilizzate in vitro o in vivo sistemi biologici attraverso un processo di selezione iterativi. Quindi, ligandi possono essere accoppiati con agenti terapeutici o di imaging per la diagnosi ed il trattamento di malattie3,4. È fondamentale per enumerare accuratamente fagi durante più passaggi di biopanning: (1) per quantificare i fagi che si legano al substrato e (2) quantificare fagi per determinare se c'è l'arricchimento con ogni turno di selezione (arricchimento dei fagi indica biopanned affinità dei fagi per la destinazione). Il gold standard attuale per la quantificazione, saggio della placca doppio strato, presenta sfide multiple; è noioso, ingombrante e potenzialmente non accurati per un gran numero di campioni. Di conseguenza, il nostro gruppo ha sviluppato un metodo di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa sensibile, riproducibile, preciso e rapido per enumerare le particelle dei fagi M13 e T7 da biopanning5.
qPCR è un metodo attraente e fattibile quantificare con precisione T7 e M13 fagi. Poiché ogni particella individuale dei fagi può contenere solo una copia del DNA genomico (dsDNA o ssDNA), uno dei fagi genoma è equivalente a una particella fago; quantificando il numero di genomi dei fagi, è fattibile quantificare il numero di fagi. Durante qPCR, reporter fluorescente tinture legano il DNA genomico dei fagi non specifico o in particolare attraverso gli iniettori sequenza-specifici durante l'amplificazione di PCR e la fluorescenza segnale aumenta con ogni ciclo di amplificazione. Quando il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia, che turno/ciclo di amplificazione è noto come il ciclo di soglia (Ct). Le concentrazioni note di fago riferimento DNA vengono confrontate con i valori di Ct per stabilire una curva standard. Utilizzando la curva standard con i valori di Ct di campioni di DNA, le concentrazioni di fagi possono essere interpolate.
Mentre numerose strategie sviluppate in precedenza e ampiamente utilizzate per quantificare i fagi da biopanning, ognuno di loro ha specifiche sfide. Il metodo più popolare e convenzionale è saggio della placca doppio strato. Qui, alcuni batteri sono infettati con fagi preparati alle diluizioni seriali, sono placcati su un substrato solido agar e sono overlaid con agar; fagi vengono enumerate con il numero delle placche formate (cioè, unità di formazione di placca o pfu) sulla piastra di agar. Saggio della placca è sensibile ma noioso, che richiede tempo e imprecise, soprattutto per i numerosi campioni e con alte concentrazioni di5. Inoltre, analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) sono state adattate per enumerare M13 e T7 fago particelle6,7,8. Qui, fagi a varie diluizioni sono vincolati e catturato su un substrato solido (cioè, una micropiastra), sondato con gli anticorpi dei fagi-specific e rilevato utilizzando reporter (ad es., substrati cromogeni sensibili enzima, fluorofori) per determinare il numero di particelle fagiche presenti. Letture (ad es., fluorescenza, assorbanza) dei campioni possono essere utilizzate per quantificare le concentrazioni sconosciute contro gli standard dei fagi a concentrazioni note. Sono state sviluppate diverse basati su fagi ELISAs ma hanno limitazioni potenziali. Un gruppo ha sviluppato un panino cartacei ELISA con una gamma di quantificazione che durò sette ordini di grandezza (2-10 109 pfu/mL); Tuttavia, questo metodo necessari più passaggi di rivestimento dell'anticorpo ed ha preso per un'intera giornata per il dosaggio di8. Anche il nostro gruppo ha sviluppato un metodo per quantificare le particelle dei fagi M13 ma aveva una gamma meno sensibile di rilevazione di 106 a 1011 pfu/mL5. Commutabile lantanidi fluorescenza sonde sono state sviluppate per enumerare M13 e quantificazione dati potrebbero essere ottenuti entro 20 min; Tuttavia, questo test ha una gamma dinamica stretta di 109 al 1012 pfu/mL9. Un gruppo ha usato Microscopia a forza atomica per enumerare le particelle dei fagi M13 in soluzione, ma questo richiede la microscopia elettronica avanzata e funzionava solo all'interno di una ristretta gamma di concentrazioni10. Un altro studio ha utilizzato monodispersi emulsioni per intrappolare fagi reporter fluorescente M13 e T4 e contare i fagi per il numero di goccioline fluorescente; Tuttavia, questo approccio inoltre hanno esibito una gamma stretta quantificazione da 102 106 pfu/mL11. Mentre gocciolina che digitale PCR è stato utilizzato per quantificare i fagi M13, questo approccio è in grado di distinguere tra il numero di malattie infettive e non infettive dei fagi particelle12.
Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato metodi qPCR per enumerare T7 e M13 fagi identificati da biopanning contro un modello di cellulare della barriera emato - encefalica utilizzando due diversi reporter fluorescente tinture5. Rispetto ai metodi di quantificazione di cui sopra, i metodi di qPCR abbiamo sviluppato erano ad alta velocità e tempo efficiente per quantificare numerosi campioni e in grado di distinguere tra fagi infettive e non infettive con dnasi I pre-trattamento della campioni dei fagi. Cosa importante, questo approccio può riproducibile e accuratamente quantificare batteriofagi M13 e T7 da campioni di biopanning. Per guidare i ricercatori alle prime armi nella zona di fago qPCR, qui descriviamo un metodo qPCR dettagliate per enumerare le particelle dei fagi T7 da una libreria di cisteina-vincolato (CX7C) stroncate contro una barriera muco in vitro della fibrosi cistica (CF). Da questo lavoro, qPCR metodo può essere esteso per quantificare le particelle dei fagi da altri tipi di biopanning e da altre fonti, tra cui acqua, il suolo e fluidi corporei.

<table><tbody><tr><td>Materiali e reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer per DNA genomico T7 IDT</td><td></td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Seleziona il controllo dell'imballaggio DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp piastra di reazione ottica a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td><td>Applied biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pellicole adesive ottiche MicroAmp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 Kit di clonazione</td><td>EMD Millipore</td><td>70015</td><td>Protocolli utente : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>Soluzione DNasi I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Piastra transwell a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNasi/RNase-Free H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Sistema di PCR in tempo reale con blocco rapido a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore a vortice digitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC Riscaldatore Multi-Blok</td><td>ThermoFisher Scientific Modello</td><td>: 2001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Centrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Micropiastra Rotore a secchio oscillante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Software per PCR in tempo reale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Progettazione di primer qPCR in tempo reale</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pcr quantitativa del batteriofago t7 da biopanning

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Questo protocollo descrive l'uso della PCR quantitativa (qPCR) per enumerare T7 fagi da esperimenti di selezione dei fagi (cioè, "biopanning"). qPCR è un approccio basato su fluorescenza per quantificare il DNA, e qui, è adattato a quantificare i genomi dei fagi come un proxy per particelle dei fagi. In questo protocollo, un metodo di preparazione del DNA dei fagi facile è descritto mediante riscaldamento ad alta temperatura senza ulteriore purificazione del DNA. Il metodo deve solo piccoli volumi di fagi trattato termicamente e piccoli volumi di reazione qPCR. qPCR è alto-rendimento e veloce, in grado di elaborare e ottenere dati da una piastra a 96 pozzetti delle reazioni in 2 – 4 h. rispetto ad altri metodi di enumerazione dei fagi, qPCR è più efficiente in termini di tempo. Qui, qPCR viene utilizzato per enumerare T7 fagi identificati da biopanning contro il modello in vitro fibrosi cistica-come muco. Il metodo di qPCR può essere esteso per quantificare T7 fagi da altri esperimenti, compresi altri tipi di biopanning (ad es., screening di fagi immobilizzato il legame con le proteine, in vivo ) e da altre fonti (ad esempio, sistemi di acqua o fluidi corporei). In sintesi, questo protocollo può essere modificato per quantificare eventuali virus DNA-incapsulato.

Strumenti di progettazione di differenti dell'iniettore possono essere utilizzati per disegnare primers qPCR. In genere, disegno dell'iniettore di programmi hanno i propri algoritmi incorporati per calcolare e convalidare i parametri chiave del primer, per esempio GC %, Tm, dimero di primer o formazione di tornante, ecc. in generale, i criteri principali sono simili in diverse strumenti di progettazione di primer e primer può essere progettato seguendo le loro istruzioni...

Un tempo, accurato e riproducibile efficiente quantitativa PCR (qPCR) metodo per enumerare fago T7 è descritto qui. Il protocollo descrive chiaramente la preparazione di DNA genomico dei fagi, preparazione di reazione di PCR, qPCR ciclismo condizioni e analisi dei dati di qPCR.

PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere ai problemi chiave nei campi della virologia e della microbiologia relativi all'enumerazione di batteriofagi da campioni complessi e diagnostica e terapie basate su batteriofagi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione efficiente in termini di tempo e accurata di un gran numero di campioni provenienti da esperimenti di biopanning di visualizzazione del fago non fattibili con saggi tradizionali. A dimostrare la procedura saranno Rashmi Mohanty e Jasmim Leal, studenti laureati del mio laboratorio.Dopo aver progettato i primer e aver creato una concentrazione di stock, ottenere il DNA del fago T7 di riferimento ad una concentrazione di 0,1 microgrammi per microlitro. Utilizzando acqua ultrapura, diluire serialmente questo DNA dieci volte, da un milione di femtogrammi per microlitro a un femtogramma per microlitro in tubi PCR da 0,2 millilitri. Preparare 20 microlitri di ogni concentrazione, assicurandosi di cambiare le punte delle pipette e vortice i tubi tra ogni fase della diluizione.Quindi convertire la concentrazione di DNA di riferimento del fago T7 da femtogrammi per microlitro in copie del genoma per microlitro. In primo luogo, pipetta 200 microlitri del campione T7 phage clone in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri per ciascuno dei 10 campioni desiderati. Aggiungere due microlitri di DNasi uno a ciascun tubo.Limitare i tubi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno secco riscaldato. Quindi incubare a 100 gradi Celsius per 15 minuti in un bagno secco riscaldato. Centrifugare i tubi contenenti i fagi trattati termicamente a 18,534 volte g per 10 secondi.Posizionare i tubi centrifugati su un mixer a vortice impostato in modalità di attivazione touch per 10 secondi per mescolare i fagi. Gira di nuovo a 18.534 volte g per 10 secondi. Successivamente, lasciare i campioni sul banco di laboratorio circa un'ora per raffreddarli a temperatura ambiente.Preparare la premiscura qPCR per 10 campioni di fago biopanato di concentrazione sconosciuta e sette campioni di concentrazioni standard in triplice copia. Risultando in una premiscele per 51 campioni contenenti 255 microlitri di mix master qPCR, 51 microlitri di primer e 102 microlitri di acqua. Aliquota otto microlitri della miscela PCR preparata in 51 pozzali di una piastra qPCR da 96 porri.Aggiungere quindi due microlitri di campioni di fago T7 trattati termicamente a ciascuno di questi pozzi, erogarli sotto la superficie della premisce qPCR. Utilizzando pellicola adesiva, sigillare la piastra. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per ridurre al minimo lo sbiancamento fotografico a fluorescenza e quindi procedere a far funzionare la piastra sull'apparecchiatura qPCR.Impostate le condizioni di ciclo e le impostazioni della curva di fusione come delineato nel protocollo di testo. Dopo l'esecuzione del qPCR, il plottaggio di amplificazione, il plottaggio della curva di fusione e il plottaggio multicomponente vengono analizzati dai dati grezzi. Il grafico di amplificazione indica se l'amplificazione PCR di ogni campione ha esito positivo o meno.Il plot multicomponente rappresenta l'amplificazione e il decadimento del segnale fluorescente durante i cicli di amplificazione. Mentre il grafico della curva di fusione viene utilizzato per convalidare la specificità dei primer, poiché ogni prodotto PCR ha una temperatura di fusione unica. La curva standard viene quindi generata dal DNA di riferimento.Qui l'efficienza di amplificazione è calcolata come 92,4%I dati rappresentativi di uno studio qPCR vengono quindi confrontati con lo stesso fago che sono stati quantificati da un saggio di placca a doppio strato nell'intervallo testato da 10 a 10 milioni di copie del genoma per microlitro. Come si vede qui, il numero di fagi nella quantitazione qPCR è più alto che nel saggio della placca. La ripetibilità del metodo qPCR rappresentato dal coefficiente di varianza ha valori che vanno dal 2,85 al 27,2%Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ci sono numerose considerazioni nello sviluppo e nell'uso di qPCR per quantificare accuratamente i fagi, incluso un attento trattamento e preparazione dei campioni e la calibrazione delle apparecchiature pertinenti.Seguendo questo metodo, altre tecniche possono essere eseguite al fine di enumerare le particelle di fago in una varietà di applicazioni incluse nella biopanning in vivo, nella preparazione del DNA della libreria di fago e nel sequenziamento e nel rilevamento del fago di nuova generazione in campioni ambientali complessi. Non dimenticare che i fagi sono considerati pericoli biologici in laboratorio e precauzioni come dispositivi di protezione individuale, compresi guanti e camici da laboratorio, dovrebbero sempre essere indossati durante l'esecuzione della procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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