Name: Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri la produzione transitoria di triterpeni su scala preparativa in foglie di Nicotiana benthamiana mediante espressione di enzimi biosintetici. Questo metodo rapido e scalabile consente di deviare il 2,3-ossidosqualene verso composti ad alto valore.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da un Norwich Research Park Studentship (JR), l'ingegneria congiunta e Physical Sciences Research Consiglio/biotecnologici e Biological Sciences Research Council BBSRC-finanziato centro ricerca biologia sintetica OpenPlant concedere (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); un scambio di conoscenze di John Innes Centre e commercializzazione concedere (BB/KEC1740/1) (B.B.); e la concessione del programma strategico di BBSRC Istituto 'Molecole dalla natura' (BB/P012523/1) e la Fondazione di John Innes (A.O.). Vorremmo ringraziare George Lomonossoff per fornire i vettori pEAQ e Andrew Davis per la fotografia.

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Alto-attraverso-ha messo sottovuoto infiltrazione permette questo protocollo essere utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per la produzione di preparativa del triterpene composti di interesse per varie applicazioni a valle. L'apparecchiatura di infiltrazione vuoto qui descritta è facilmente replicato. Aggiunta del serbatoio vuoto è consigliabile ridurre il tempo necessario per tirare il vuoto necessario, tuttavia è possibile riutilizzare semplicemente un forno sottovuoto non modificato come camera di infiltrazione. Proteggere la pompa del vuoto tramite aggiunta di un condensatore adatto è teoricamente sensata, ma nel nostro laboratorio abbiamo trovato questo per essere inutili.
Copertura di infiltrazione è compromessa se le foglie non sono completamente immersi nella sospensione di infiltrazione. Questo problema è ridotto al minimo, garantendo che il livello della sospensione raggiunge la superficie superiore del titolare all'impianto, e che il titolare di impianto è una misura stretta per il bagno di infiltrazione. Notare dalla Figura 2 che la superficie superiore del titolare pianta viene incassata al bagno infiltrazione quando in luogo. Questo avviene mediante pannelli sui bordi centrali del titolare che formano il punto di ancoraggio con la parte superiore del bagno infiltrazione. La sospensione di infiltrazione richiederà aggiunte periodiche per mantenere il livello di sospensione. Ciò si ottiene tramite l'aggiunta di sospensione di infiltrazione in eccesso per evitare riduzione graduale del OD600 nel corso di una grande infiltrazione batch-wise. Tuttavia, nelle nostre mani, sostituzione per acqua non sembra avere un effetto notevole sui rendimenti attesi su scala preparativa, anche se questo non è stato studiato quantità. Quante piante possono essere infiltrati da un lotto di sospensione di infiltrazione è ancora una questione aperta. Abbiamo ordinariamente infiltrarsi tra 100 e 200 piante con un unico batch di sospensione di infiltrazione. Inoltre, è normale per alcuni terreni a lisciviare nella sospensione infiltrazione nel corso del processo di infiltrazione. Questo non è stato trovato per avere un effetto notevole sull'efficacia di infiltrazione.
Durante la vendemmia è consigliabile (ma non critico) per raccogliere solo le foglie che si sono infiltrate (alcune foglie saranno cresciuta post-infiltrazione). Vendemmia selettiva impedisce la diluizione con tessuto improduttivo, che altrimenti sarebbe aumentare il rapporto di endogeno impurità rispetto al composto di interesse. Questo ha un impatto nominale sulla facilità di purificazione a valle e aumenta la scala di questi processi. Quando si utilizza tHMGR per aumentare la fornitura di precursore, un fenotipo necrosed è osservato spesso a sviluppare durante il periodo di crescita post-infiltrazione. Questo è normale e aiuta effettivamente la raccolta selettiva e il processo di essiccazione a valle. La polvere di foglia secca solitamente può essere conservata in un contenitore sigillato in un luogo fresco, asciutto e buio, ma idealmente in un essiccatore sotto vuoto. Questo dipende dalla stabilità del composto di interessati. Prestare attenzione se si sceglie di memorizzare in un congelatore a-80 ° C. Garantire che le secche foglie sono in un contenitore a tenuta stagna e il ritiro dall'ammasso, permetterà questo contenitore a temperatura ambiente prima dell'apertura. In caso contrario si comporterà Riumidificatore delle foglie, che ostacolano l'elaborazione a valle.
I passaggi di post-raccolta in questo protocollo sono forniti a scopo esemplificativo, e per aiutare quei ricercatori che hanno una limitata chimica pratica esperienza. Possono essere sostituiti per molte altre tecniche di estrazione/purificazione del prodotto naturale. Come spiegato nell'introduzione, PSE ha molti vantaggi, tuttavia la capitale costo dell'apparato PSE commercialmente disponibile può essere proibitivo, e non è essenziale. Il trattamento base di scambio ionico della resina è un metodo molto conveniente per sostituire la tradizionale saponificazione seguita da liquido/liquido di partizionamento. Tuttavia, non è adatto per prodotti contenenti gruppi carbossilici o gruppi funzionali che sarebbe essere idrolizzati in condizioni di base, come gli esteri. Questi prodotti dovrebbe essere mantenuto sulla resina base di scambio ionico. Tuttavia, esiste la possibilità di sfruttare questo per una cattura e rilascio procedura (non documentato qui). Dove saponificazione tradizionale sarebbe appropriato, trattamento di resina di scambio ionico base serve come una comoda alternativa. Il metodo di cromatografia descritto nel passaggio 9, è stato trovato per essere generalizzabile per i composti descritti nella Figura 3. Tuttavia, composti di maggiore polarità possono richiedere un lungo periodo di eluizione 100% acetato di etile. Con riferimento al punto 9.2, purificazione bene a valle è interamente composto specifico e dipende anche dalla scala. Ripetuti cicli di cromatografia flash su scala ridotta con gradienti ottimizzati, è solitamente sufficiente per raggiungere una purezza appropriata per analisi NMR. Su scala più ampia, la cristallizzazione è spesso una comoda alternativa. In casi difficili, preparativa o semi-preparatorio ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) può essere impiegata a seconda la quantità desiderata di composto isolato. Esempi di processi di depurazione a valle per una gamma di composti rappresentante possono essere trovati altrove8.
Il protocollo attuale, come presentato qui, è usato ordinariamente nel nostro laboratorio e ha dimostrato l'utilità. Tuttavia, c'è ancora un ampio margine per un'ulteriore ottimizzazione della piattaforma espressione. Lavoro è in corso nel nostro laboratorio per studiare come ulteriore ingegneria via e controllo differenziale dei livelli di espressione della proteina potrebbe migliorare triterpene produzione ulteriormente, mentre la mediazione della tossicità per le cellule dell'ospite. C'è anche il potenziale per indagare la manipolazione del trasporto intracellulare sistemi20,21e la direzione di enzimi diversi compartimenti cellulari22,23, viali che potrebbero migliorare l'efficienza di più eventi di ossidazione. Potenziali benefici per modificare la morfologia sottostante degli organelli chiave potrebbero anche essere esplorati. Ad esempio, la sovraespressione del dominio della membrana di Arabidopsis thaliana HMGR è stata osservata per indurre l'ipertrofia del reticolo endoplasmico in piante24; un sito chiave per attività di CYP450. Questo protocollo è ideale per la produzione di milligrammo per quantitativi di grammo-scala di prodotti triterpenici e possa essere impiegato in un ambiente di ricerca per accedere composti per studio a valle (ad esempio, l'esplorazione sistematica di struttura-attività le relazioni e le indagini preliminari alle proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche di composti di interesse clinico guida). Tuttavia, la piattaforma è linearmente e scalabile in modo affidabile semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate e la praticità di espressione transitoria tramite agroinfiltrazione è stata dimostrata su scala industriale per la produzione di proteine farmaceutici 14, così ci è potenziale per questa piattaforma essere esteso per la produzione commerciale di alto valore triterpeni. In alternativa, è anche possibile prevedere la produzione di trasformanti stabile portando via biosintetica multigenica del desiderio finalizzato, che permette la coltivazione di massa e continuo 'agricoltura' di transgenici benthamiana N. ceppi produzione di mescole differenti di valore commerciale.

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Nonostante la loro diversità immensa, tutti i prodotti naturali del triterpene sono creduti per essere derivato dalla stessa lineare precursore 2,3-oxidosqualene, un prodotto della via del mevalonate nelle piante. Ciclizzazione di 2,3-oxidosqualene è avviato e controllato da una famiglia di enzimi chiamati oxidosqualene ciclasi (OSSC). Questo passaggio di ciclizzazione rappresenta il primo livello di diversificazione, con centinaia di diversi triterpene impalcature che sono segnalate da natura1. Queste impalcature sono ulteriormente diversificate di sartoria enzimi tra cui, ma non limitato a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tali vie biosintetiche possono portare a immensa complessità, a volte con conseguente prodotti finali che sono a malapena riconoscibili dal triterpene del padre. Ad esempio, la complessa struttura del potente insetticida e antifeedant Limonoide azadiractina è creduta per derivare da un triterpene tetraciclico del tirucallane tipo3.
Molti prodotti naturali derivati triterpenici, anche quelli con impalcature padre relativamente invariato, hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti4,5,6,7. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell'accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l'esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica.
L'espressione transitoria degli enzimi biosintetici del triterpene da altre specie di piante a foglie N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici (Figura 1). Questo processo può essere utilizzato per caratterizzare funzionalmente enzimi candidato e ricostruire le vie biosintetiche dei metaboliti importanti naturale. Ugualmente, può anche essere sfruttato negli approcci combinatoriali biosintetici di produrre prodotti di romanzo del triterpene, una strategia che può provocare nelle librerie di analoghi strutturalmente correlate, consentendo l'esplorazione sistematica delle relazioni struttura-attività 8,9i composti di piombo biologicamente attivo.
Agroinfiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana foglie. Il processo prevede l'infiltrazione di foglie con una sospensione di a. tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione binaria di interesse. Questo risultato è ottenuto tramite l'applicazione di pressione che costringe il liquido attraverso gli stomi, spostando l'aria nello spazio intercellulare e la sua sostituzione con la sospensione di a. tumefaciens . I batteri trasferire i rispettivi T-DNA all'interno delle cellule della pianta, con conseguente espressione della proteina localizzata e transitori in tessuto fogliare infiltrate.
Mentre qualsiasi vettore binario adatto per generazione di piante transgeniche possono essere impiegate per l'espressione transitoria, utilizziamo la Cowpea Mosaic Virus CPMV-derivato Hypertranslational (HT) proteina espressione sistema10, 11. in questo sistema il gene di interesse è fiancheggiato da regioni non tradotte (UTR) da CPMV RNA-2. 5' UTR contiene modifiche risultanti a livelli molto elevati di traduzione della proteina con nessun affidamento sulla replicazione virale12. Questa tecnica è stata sviluppata in serie di vettore binario di facile e rapido (pEAQ) che comprende la clonazione protocollo compatibile con costrutti (pEAQ -HT- DEST)10,11site-specific di ricombinazione. La maggior parte pEAQ vettori contengono anche un pomodoro bushy stunt virus-derivato P19 silenziamento suppressor gene13 all'interno della parte di T-DNA della cassetta di espressione, che aggira la necessità di coinfiltrate un ceppo P19-trasportare separato e offre molto espressione di proteine ad alto livello nell'ospite pianta cella10,11.
Uso di N. benthamiana come un host di espressione ha particolari vantaggi quando si lavora con vie biosintetiche pianta. L'architettura cellulare supporta intrinsecamente appropriato mRNA e proteina elaborazione e compartimentalizzazione corretta, oltre a possedere le necessari co-enzimi, riduttasi (per CYP450s) e precursori metabolici. Fonte di carbonio è la fotosintesi; così, piante possono essere coltivate semplicemente in compost di qualità buona, che richiedono solo acqua, CO2 (dall'aria) e luce del sole come input. La piattaforma è anche estremamente conveniente per la co-espressione di diverse combinazioni di proteine, come questo può essere raggiunto facilely per co-infiltrazione di diversi ceppi di a. tumefaciens, negando la necessità di costruire grandi espressione multigenica cassette. Inoltre, il processo può essere linearmente e affidabile scalato semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell'esperimento.
Lavoro precedente nel nostro laboratorio ha dimostrato l'utilità di questa piattaforma per esperimenti su scala preparativa. Questo incluso la preparazione di triterpeni romanzo per uso in saggi di bioattività e scala fino a raggiungere la quantità di grammi di prodotto isolato. Inoltre, può essere aumentato accumulo di prodotti eterogenei triterpene molteplice di co-espressione di una forma N-terminal-troncato, feedback-insensibile di 3-idrossi, 3-methyglutary-coenzima A reduttasi (tHMGR), una limitazione della velocità a Monte enzima in mevalonate pathway8.
Chiave per tali esperimenti preparativo-scala è la capacità di up-scala convenientemente il processo di infiltrazione. In un tipico esperimento, decine o centinaia di piante possono essere necessaria per raggiungere la quantità di destinazione del prodotto isolato. Le singole foglie di infiltrazione a mano (usando una siringa inutile) è funzionalmente esigente e spesso costi proibitivi che richiede tempo, rendendo questo metodo poco pratico per scale-up routine. Infiltrazione vuoto offre vantaggi rispetto l'infiltrazione di mano, poiché non è dipenda dal livello di abilità dell'operatore e consente l'infiltrazione di una maggiore area della superficie fogliare. Questa procedura è usata commercialmente per la produzione su larga scala di proteine farmaceutici14. Questo protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che può essere costruito da parti commercialmente disponibili. Questo consente l'infiltrazione simultanea di fino a 4 piante, offrendo l'infiltrazione batch-wise rapido e pratico di centinaia di piante in un breve periodo di tempo (Figura 2a -2b). L'apparato di infiltrazione vuoto è costituito da un forno sotto vuoto che forma la camera di infiltrazione (Figura 2f). Il forno è collegato ad una pompa tramite un serbatoio a vuoto. Questo riduce notevolmente il tempo necessario per ottenere il vuoto desiderato nella camera di infiltrazione. Le piante sono fissate in un supporto su misura e invertite in un bagno di 10 L d'acqua in acciaio inox riempito con sospensione a. tumefaciens (Figura 2a -2C). Completa immersione delle parti aeree delle piante è importante per l'infiltrazione efficace. Bagno d'acqua viene poi collocato all'interno della camera di infiltrazione (figura 2d -2e) e il vuoto applicato per disegnare l'aria fuori gli spazi interstiziali di foglia. Una volta che la pressione è stata ridotta da 880 mbar (un processo che dura circa 1 min) la camera di infiltrazione è portata rapidamente indietro a pressione atmosferica oltre 20-30 s aprendo la valvola di aspirazione del forno, dopo di che l'infiltrazione è completa.
Cinque giorni dopo l'infiltrazione di materiale vegetale è pronto per la raccolta e la successiva estrazione e l'isolamento del prodotto desiderato. Da questo punto il processo è semplicemente uno dei prodotto naturale estrazione e purificazione da materiale del foglio, un flusso di lavoro che è familiare a qualsiasi chimico prodotto naturale. Molti metodi diversi per l'iniziale estrazione e purificazione successiva esistono15. La scelta più appropriata di metodi e le condizioni esatte utilizzate dipende fortemente le particolari proprietà chimiche del composto di interesse, oltre alla disponibilità di competenze e/o attrezzature. Non è possibile includere in questo protocollo un metodo completamente generalizzabile, passo-passo per l'elaborazione a valle del materiale raccolto pianta foglia isolato prodotto che potrebbe essere seguito ciecamente per qualsiasi prodotto del triterpene di interesse, né sarebbe appropriato per tentare di farlo. Tuttavia, questo protocollo fornirà una panoramica del flusso di lavoro base utilizzato nel nostro laboratorio e alcuni metodi per le fasi iniziali del processo, che nella nostra esperienza si sono rivelati generalizzabile per prodotti di triterpene aglicone più ossigenati. Questo include due tecniche relativamente rari, vale a dire, estrazione pressurizzata di solvente (PSE) e un metodo conveniente fase eterogenea per la rimozione di clorofilla utilizzando una resina a scambio ionico fortemente basico.
PSE è una tecnica altamente efficiente per l'estrazione di piccole molecole organiche da matrici solide. Le estrazioni vengono eseguite sotto pressione (ca. 100-200 bar), scegliere il vantaggio principale è la possibilità di utilizzare alleviò le temperature che superano il punto di ebollizione del solvente di estrazione. Questo può ridurre significativamente il tempo e la quantità di solvente necessario per ottenere un'estrazione esaustiva, rispetto ad altre tecniche di solvente caldi come semplice riflusso o Soxhlet estrazioni16. Strumenti commerciali di PSE banco sono disponibili, che utilizzano cellule di estrazione intercambiabili e solvente automatizzati movimentazione, riscaldamento e monitoraggio. Questo rende questa tecnica estremamente conveniente. È anche probabilmente meno pericoloso, in particolare per gli operatori con esperienza di chimica pratica limitata.
Saponificazione di estratti grezzi foglia sotto riflusso seguita da liquido/liquido partizionamento è una tecnica comune per la rimozione di massa delle clorofille prima purificazione successiva o analisi. Tuttavia, questo può spesso essere operativamente esigenti su scala più ampia. Inoltre, la rilevazione dell'interfaccia, o della perdita del prodotto dovuta alla formazione di emulsioni può essere problematico. L'uso di resine scambiatrici di ioni fortemente basico per eseguire idrolisi in fase eterogenea può servire come una comoda alternativa. La parte pigmentata della clorofilla idrolizzata rimane aderita alla resina e può essere semplicemente rimossi per filtrazione. Questo protocollo utilizza un adattamento di scala preparativa di un procedimento analitico precedentemente segnalati17 che si avvale di una resina a scambio ionico base disponibili in commercio.
Qui di seguito descriviamo un protocollo dettagliato e rapido per la produzione su scala preparativa di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Questo protocollo viene utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per preparare decine o centinaia di milligrammi del triterpene isolato prodotto per applicazioni tale caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), e/o ulteriore studio in funzionale saggi.

<table><tbody><tr><td>Strumento GC-MS</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore adatto all'esecuzione di reazioni di PCR</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette a spostamento d'aria regolabili (Dimensioni : 1000 e micro; L, 200 & micro; L, 100 & micro; L, 20 & micro; L, 10 & micro; L, e 2 &micro; L )</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ampio supporto di azoto liquido superiore (dimensioni: 2 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco (Capacità: 24 x 1,5/2 mL, Velocità massima: =/> 15000 giri/min)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco (Capacità: 20 x 50 mL, Velocità massima: =/> 4000 giri/min)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da pavimento grande (Capacità: 4 x 1 L, Velocità massima: =/> 4000 giri/min)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice in piedi</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a scuotimento (Dimensioni del morsetto per pallone: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi da centrifuga (1 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio di infiltrazione sottovuoto</td><td>su misura</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm vasi per piante</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio di liofilizzazione (=/> capacità del condensatore da 8 litri)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 con celle di estrazione da 120 mL (strumento PSE)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per evaporatore rotante</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Palloni di evaporazione (Dimensioni: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie Duran (Dimensioni: 1 L, 10 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Palloni conici (dimensioni 100 mL, 2 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatole (dimensioni assortite)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica (5 figure)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia (2 figure)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cilindri graduati (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 congelatore</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Strumento Isolera con rack di raccolta da 250 mL e flaconi (strumento di cromatografia flash automatizzata</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di sicurezza</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td> Camice da laboratorio qualsiasi n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette (Taglie: 1000 & micro; L, 200 & micro; L, 100 & micro; L, 20 & micro; L, 10 & micro; L, e 2 &micro; L )</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (Dimensioni: 2 mL)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga (Dimensioni: 15 mL, 50 mL)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso (dimensioni 2 mL)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (Dimensioni: 100 mL)</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100 g cartucce flash</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>Fiale HPLC (1 mL), inserti e tappi</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Guanti monouso in nitrile viola</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superiore per E-914, cellulosa</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Filtro inferiore per E-916 / 914, fibra di vetro</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><forte> Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabbia di quarzo, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (terra di diatomee)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Gel di silice 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morfolino)-acido etansolfonico</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-dimetossi-4'-acetofenone (acetosiringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 idrossido (resina basica a scambio ionico)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q acqua</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (kit di purificazione dei plasmidi).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Competente E. coli</td><td>Fornitore New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vettore</td><td>Laboratorio Lomonossoff John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASI(tm) II ENZYME MIX (protocollo di clonazione a ricombinazione sito-specifica)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protocollo di clonazione a ricombinazione sito-specifica)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Sistema di sintesi a primo filamento</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana semi</td><td>qualsiasi fornitore rispettabile</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione transiente in nicotiana benthamiana lascia per produzione del triterpene su scala preparativa

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Molti derivati triterpenici hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell'accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l'esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica. Nonostante la loro diversità immensa, triterpeni sono tutti derivati da un singolo precursore lineare, 2,3-oxidosqualene. L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti di alto valore triterpene che non sono prodotte naturalmente da questo host. Agro-infiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana. Il processo prevede l'infiltrazione delle foglie delle piante con una sospensione di Agrobacterium tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione di interesse. Co-infiltrazione di un ulteriore a. tumefaciens ceppo che trasportano un costrutto di espressione codifica un enzima che aumenta il rifornimento di precursore significativamente aumenta produce. Dopo un periodo di cinque giorni, il materiale infiltrato foglia possa essere raccolti ed elaborato per estrarre e isolare i prodotti triterpene risultante. Si tratta di un processo che è scalabile in modo lineare e affidabile, semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell'esperimento. Qui è descritto un protocollo per produzione rapida di preparativo-scala di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Il protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che permette l'infiltrazione simultanea di fino a quattro impianti, consentendo l'infiltrazione batch-wise di centinaia di piante in un breve periodo di tempo.

Rendimenti tipici isolati dipendono dalla combinazione enzima/enzima sotto inchiesta, la stabilità chimica del composto di destinazione e come contestare il processo di purificazione è stato. Precedentemente abbiamo segnalato isolati rendimenti di β-amirina derivati dai nostri esperimenti di biosintesi combinatoria che vanno da 0,12 a 3,87 mg per grammo di N. benthamiana foglia polvere secca. Questi composti hanno variato ampiamente nel livello di ossidazione e incluso innaturale combinazioni di enzimi (Figura 3)8. Questo protocollo è utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per produrre decine o centinaia di milligrammi di prodotto purificato per la caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia NMR e saggi funzionali a valle. Abbiamo anche dimostrato l'utilità preparativa di questa piattaforma producendo 0,8 g del triterpene impalcatura β-amirina una purezza superiore al 98%. Questo esperimento 459 piante usate e rappresenta un rendimento isolato di 3,3 mg per grammo di a secco N. benthamiana foglia polvere8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: riepilogo schematico. Rappresentazione schematica del processo sfruttando l'espressione transitoria degli enzimi biosintetici in foglia N. benthamiana per deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione preparativa di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: vuoto infiltrator costruzione e processo. un) Bespoke pianta titolare un'ala distaccata. b) Bespoke ali di titolare pianta attaccate. c) inversione e sommersione delle piante. d) inserimento del bagno infiltrazione. bagno e) infiltrazione nel posto all'interno della camera di infiltrazione. f) Complete infiltrator vuoto: pompa per vuoto (1) (2) collegamento dalla pompa alla valvola d'isolamento serbatoio serbatoio a vuoto vuoto (3) (4) collegamento tra serbatoio a vuoto e la valvola di aspirazione (5) manometro (6) aria di infiltrazione camera (7) Serbatoio vuoto di infiltrazione camera (8). g) rappresentante foglie da una pianta infiltrata con un costrutto di espressione per la proteina fluorescente verde (GFP) dopo la crescita post-infiltrazione di cinque giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: precedentemente segnalati risultati rappresentativi per la preparativa produzione di β-amirina derivati utilizzando questo protocollo8. Questa tabella è ordinata da rendimenti isolati. Colonne sono formattate in modo condizionale con indicazione di colore del valore relativo. Rosso = alto, verde = basso (anche se intermedio giallo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Questo protocollo offre un comodo accesso su scala preparativa ai composti triterpenici per l'uso in studi a valle, come la caratterizzazione strutturale o la scadenza di attività biologica rilevante dal punto di vista medico. Il protocollo è rapido, scalabile e consente di utilizzare combinazioni di enzimi semplicemente mediante la co-infiltrazione di diversi ceppi di Agrobacterium, annullando la necessità di costruire grandi vettori multi-genici. Per iniziare, inoculare una piastra di agar LB selettiva con striature dei ceppi di Agrobacterium tumefaciens desiderati da colture stock di glicerolo.Incubare la piastra per una notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice in piedi. Il giorno successivo, inoculare individualmente 50 millilitri di terreno LB selettivo con un campione di ciascun ceppo di Agrobacterium tumefaciens. Incubare la coltura per una notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 200 giri/min.Trasferire individualmente le colture da 50 millilitri in 1.000 millilitri di terreno LB selettivo e incubare per una notte a 28 gradi Celsius nell'incubatore vibrante a 200 giri/min. Il giorno successivo, pellettare individualmente l'Agrobacterium tumefaciens dalle colture liquide mediante centrifugazione a 4.000 volte g. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere singolarmente i pellet in 50 millilitri di tampone MMA appena preparato.Incubare i pellet risospesi a temperatura ambiente al buio per un'ora. Ora, determinare il volume appropriato di ciascuna sospensione di MMA di Agrobacterium tumefaciens per produrre un OD finale di almeno 0,2 in un volume finale totale di 10 litri. Combina i volumi determinati di ciascuna sospensione.Ora, aggiungere ulteriore tampone MMA alle sospensioni combinate fino a un volume finale di un litro, da utilizzare immediatamente per l'infiltrazione nel vuoto. Trasferire un litro di sospensione per infiltrazione e un litro di tampone MMA 10x nel bagno di infiltrazione, seguiti da altri otto litri di acqua. Rimuovi le ali staccabili del portapiante su misura.Inserisci quattro piante di cinque settimane che sono state coltivate come descritto nel protocollo di testo e riattacca le ali. La copertura dell'infiltrazione è compromessa se le foglie non sono completamente immerse nella sospensione di infiltrazione. Questo problema viene ridotto al minimo assicurandosi che il livello della sospensione raggiunga la superficie superiore del portapiante prima del trattamento sotto vuoto.Capovolgere il supporto e posizionarlo sopra il bagno di infiltrazione in modo da immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione. Trasferire il bagno di infiltrazione con piante sommerse nella camera di infiltrazione e chiudere la porta. Assicurarsi che la valvola di aspirazione dell'aria sia chiusa sull'infiltratore.Dopo aver acceso la pompa del vuoto, aprire la valvola di aspirazione del vuoto sulla camera di infiltrazione. Una volta che la pressione nella camera di infiltrazione si è ridotta di 880 millibar, chiudere la valvola di aspirazione del vuoto e aprire la valvola di aspirazione dell'aria. Al ritorno alla pressione atmosferica, aprire lo sportello e rimuovere il bagno di infiltrazione.A questo punto, sollevare il portapiante fino a quando le piante non sono più immerse nella sospensione di infiltrazione. Quindi, agitare delicatamente il supporto per consentire alla sospensione in eccesso di defluire dalle foglie e tornare nel bagno di infiltrazione. Infine, riporta il supporto in posizione verticale, rimuovi le ali staccabili e rimuovi le piante.Coltiva le piante infiltrate per cinque giorni a 25 gradi Celsius in 16 ore al giorno di luce con annaffiature quotidiane. Dopo cinque giorni di crescita, raccogli le foglie e poi asciugale come descritto nel protocollo di testo. Macina le foglie essiccate in una polvere grossolana con un metodo conveniente, come l'utilizzo di un robot da cucina domestico o la frantumazione manuale delle foglie contenute in un sacchetto.Mescolare la polvere di foglie con la sabbia di quarzo in un contenitore adatto. Questo agisce come disperdente e migliora l'efficienza del processo di estrazione. Ora, prepara quattro celle di estrazione per il riempimento capovolgendole prima.Quindi, inserire il filtro in fibra di vetro, seguito dalla fritta metallica e dal tappo di tenuta. Rimettere le celle di estrazione in posizione verticale e aggiungere uno strato di sabbia di quarzo profondo un centimetro. Riempire le celle di estrazione con la polvere di foglie preparata fino alla linea di riempimento.Se necessario, comprimere delicatamente la polvere durante questo processo per facilitare l'aggiunta di una quantità maggiore in ogni cella di estrazione. Ora, aggiungi un piccolo strato di sabbia di quarzo sulla parte superiore della polvere imballata e inserisci il filtro di cellulosa superiore. Inserire le celle di estrazione impaccate nello strumento di estrazione con solvente pressurizzato ed eseguire il metodo desiderato.Una volta completato il metodo, concentrare il bagno di estrazione combinato fino alla secchezza tramite evaporazione rotativa sotto vuoto, come descritto nel protocollo di testo. Verificare la produzione prevista di un impasto liquido verde scuro. Per rimuovere le clorofille, utilizzando la resina basica a scambio ionico, sciogliere prima l'estratto grezzo in un volume minimo di etanolo.Aggiungere 50 millilitri di perle di resina basica a scambio ionico alla soluzione risultante. Quindi, agitare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere altri 50 millilitri di perle di resina a scambio ionico di base ogni 30 minuti fino al completamento della reazione.All'inizio, le perle di resina a scambio ionico di base sono di colore rosa e la fase liquida è verde. Man mano che la reazione procede, le perle di resina diventano verdi e la fase liquida diventa arancione o di un colore marrone torbido a seconda della scala. Filtrare la miscela di reazione attraverso una breve colonna di farina fossile tramite una colonna per cromatografia flash in vetro, utilizzando un soffietto manuale per applicare pressione.Sciacquare le perle di resina raccolte con etanolo, seguito da etanolo uno a uno in esano e infine con esano. Utilizzare un volume di risciacquo sufficiente a risospendere le perle sopra la colonna di farina fossile. Infine, unire il filtrato, i risciacqui e il concentrato all'essiccazione mediante evaporazione rotativa sotto vuoto.Qui è mostrata un'immagine delle foglie di una pianta infiltrata con un costrutto di espressione per la proteina fluorescente GFP dopo cinque giorni di crescita post-infiltrazione. Ciò illustra l'entità della copertura di infiltrazione che ci si può aspettare. Le foglie sono disposte dall'alto a sinistra al basso a destra dell'immagine in ordine decrescente, rispetto alla loro altezza originale sulla pianta.Questa immagine rappresenta 0,8 grammi di beta-amirina prodotta utilizzando questo protocollo, che è pura oltre il 98%. L'esperimento è stato condotto su una scala di 459 piante e rappresenta una resa isolata di 3,3 milligrammi per grammo di materiale fogliare secco. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare che solo le foglie infiltrate produrranno il composto di interesse.È quindi vantaggioso raccogliere selettivamente queste foglie quando possibile per evitare la diluizione del campione con tessuto improduttivo. Le fasi post-raccolta del presente protocollo sono fornite a scopo illustrativo. Possono essere sostituite da altre tecniche di purificazione per l'estrazione di prodotti naturali, a seconda della disponibilità di competenze e/o strutture presso l'istituto.Abbiamo scoperto che il trattamento di base con resina a scambio ionico presentato in questo protocollo è una comoda alternativa alla saponificazione più tradizionale seguita dalla suddivisione liquido/liquido per la rimozione delle clorofille su scala più ampia. Prima di seguire questo protocollo, è necessario familiarizzare con i dati di sicurezza dei materiali per tutte le sostanze utilizzate e adottare le opportune precauzioni di sicurezza. La legislazione locale relativa al lavoro con materiale transgenico deve essere controllata e osservata, anche seguendo adeguate procedure di contenimento.

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Descriviamo un disegno di esperimenti approccio che può essere utilizzato per determinare e modellare l'influenza del transgene elementi regolatori, parametri di crescita e sviluppo delle piante, e condizioni di incubazione sulla espressione transiente di anticorpi monoclonali e proteine ​​reporter nelle piante.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Qui presentiamo protocolli facili da usare per la produzione e la purificazione di metaboliti diterpenoidi attraverso l'espressione combinatoria di enzimi biosintetici in Escherichia coli o Nicotiana benthamiana, seguita da prodotto cromatografico Purificazione. I metaboliti risultanti sono adatti per vari studi, tra cui la caratterizzazione della struttura molecolare, gli studi funzionali degli enzimi e i saggi di bioattività.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Scopri la produzione transitoria di triterpeni su scala preparativa in foglie di Nicotiana benthamiana mediante espressione di enzimi biosintetici. Questo metodo rapido e scalabile consente di deviare il 2,3-ossidosqualene verso composti ad alto valore.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Esplora altri video