Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Questo protocollo offre un comodo accesso su scala preparativa ai composti triterpenici per l'uso in studi a valle, come la caratterizzazione strutturale o la scadenza di attività biologica rilevante dal punto di vista medico. Il protocollo è rapido, scalabile e consente di utilizzare combinazioni di enzimi semplicemente mediante la co-infiltrazione di diversi ceppi di Agrobacterium, annullando la necessità di costruire grandi vettori multi-genici. Per iniziare, inoculare una piastra di agar LB selettiva con striature dei ceppi di Agrobacterium tumefaciens desiderati da colture stock di glicerolo.

Incubare la piastra per una notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice in piedi. Il giorno successivo, inoculare individualmente 50 millilitri di terreno LB selettivo con un campione di ciascun ceppo di Agrobacterium tumefaciens. Incubare la coltura per una notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 200 giri/min.

Trasferire individualmente le colture da 50 millilitri in 1.000 millilitri di terreno LB selettivo e incubare per una notte a 28 gradi Celsius nell'incubatore vibrante a 200 giri/min. Il giorno successivo, pellettare individualmente l'Agrobacterium tumefaciens dalle colture liquide mediante centrifugazione a 4.000 volte g. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere singolarmente i pellet in 50 millilitri di tampone MMA appena preparato.

Incubare i pellet risospesi a temperatura ambiente al buio per un'ora. Ora, determinare il volume appropriato di ciascuna sospensione di MMA di Agrobacterium tumefaciens per produrre un OD finale di almeno 0,2 in un volume finale totale di 10 litri. Combina i volumi determinati di ciascuna sospensione.

Ora, aggiungere ulteriore tampone MMA alle sospensioni combinate fino a un volume finale di un litro, da utilizzare immediatamente per l'infiltrazione nel vuoto. Trasferire un litro di sospensione per infiltrazione e un litro di tampone MMA 10x nel bagno di infiltrazione, seguiti da altri otto litri di acqua. Rimuovi le ali staccabili del portapiante su misura.

Inserisci quattro piante di cinque settimane che sono state coltivate come descritto nel protocollo di testo e riattacca le ali. La copertura dell'infiltrazione è compromessa se le foglie non sono completamente immerse nella sospensione di infiltrazione. Questo problema viene ridotto al minimo assicurandosi che il livello della sospensione raggiunga la superficie superiore del portapiante prima del trattamento sotto vuoto.

Capovolgere il supporto e posizionarlo sopra il bagno di infiltrazione in modo da immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione. Trasferire il bagno di infiltrazione con piante sommerse nella camera di infiltrazione e chiudere la porta. Assicurarsi che la valvola di aspirazione dell'aria sia chiusa sull'infiltratore.

Dopo aver acceso la pompa del vuoto, aprire la valvola di aspirazione del vuoto sulla camera di infiltrazione. Una volta che la pressione nella camera di infiltrazione si è ridotta di 880 millibar, chiudere la valvola di aspirazione del vuoto e aprire la valvola di aspirazione dell'aria. Al ritorno alla pressione atmosferica, aprire lo sportello e rimuovere il bagno di infiltrazione.

A questo punto, sollevare il portapiante fino a quando le piante non sono più immerse nella sospensione di infiltrazione. Quindi, agitare delicatamente il supporto per consentire alla sospensione in eccesso di defluire dalle foglie e tornare nel bagno di infiltrazione. Infine, riporta il supporto in posizione verticale, rimuovi le ali staccabili e rimuovi le piante.

Coltiva le piante infiltrate per cinque giorni a 25 gradi Celsius in 16 ore al giorno di luce con annaffiature quotidiane. Dopo cinque giorni di crescita, raccogli le foglie e poi asciugale come descritto nel protocollo di testo. Macina le foglie essiccate in una polvere grossolana con un metodo conveniente, come l'utilizzo di un robot da cucina domestico o la frantumazione manuale delle foglie contenute in un sacchetto.

Mescolare la polvere di foglie con la sabbia di quarzo in un contenitore adatto. Questo agisce come disperdente e migliora l'efficienza del processo di estrazione. Ora, prepara quattro celle di estrazione per il riempimento capovolgendole prima.

Quindi, inserire il filtro in fibra di vetro, seguito dalla fritta metallica e dal tappo di tenuta. Rimettere le celle di estrazione in posizione verticale e aggiungere uno strato di sabbia di quarzo profondo un centimetro. Riempire le celle di estrazione con la polvere di foglie preparata fino alla linea di riempimento.

Se necessario, comprimere delicatamente la polvere durante questo processo per facilitare l'aggiunta di una quantità maggiore in ogni cella di estrazione. Ora, aggiungi un piccolo strato di sabbia di quarzo sulla parte superiore della polvere imballata e inserisci il filtro di cellulosa superiore. Inserire le celle di estrazione impaccate nello strumento di estrazione con solvente pressurizzato ed eseguire il metodo desiderato.

Una volta completato il metodo, concentrare il bagno di estrazione combinato fino alla secchezza tramite evaporazione rotativa sotto vuoto, come descritto nel protocollo di testo. Verificare la produzione prevista di un impasto liquido verde scuro. Per rimuovere le clorofille, utilizzando la resina basica a scambio ionico, sciogliere prima l'estratto grezzo in un volume minimo di etanolo.

Aggiungere 50 millilitri di perle di resina basica a scambio ionico alla soluzione risultante. Quindi, agitare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere altri 50 millilitri di perle di resina a scambio ionico di base ogni 30 minuti fino al completamento della reazione.

All'inizio, le perle di resina a scambio ionico di base sono di colore rosa e la fase liquida è verde. Man mano che la reazione procede, le perle di resina diventano verdi e la fase liquida diventa arancione o di un colore marrone torbido a seconda della scala. Filtrare la miscela di reazione attraverso una breve colonna di farina fossile tramite una colonna per cromatografia flash in vetro, utilizzando un soffietto manuale per applicare pressione.

Sciacquare le perle di resina raccolte con etanolo, seguito da etanolo uno a uno in esano e infine con esano. Utilizzare un volume di risciacquo sufficiente a risospendere le perle sopra la colonna di farina fossile. Infine, unire il filtrato, i risciacqui e il concentrato all'essiccazione mediante evaporazione rotativa sotto vuoto.

Qui è mostrata un'immagine delle foglie di una pianta infiltrata con un costrutto di espressione per la proteina fluorescente GFP dopo cinque giorni di crescita post-infiltrazione. Ciò illustra l'entità della copertura di infiltrazione che ci si può aspettare. Le foglie sono disposte dall'alto a sinistra al basso a destra dell'immagine in ordine decrescente, rispetto alla loro altezza originale sulla pianta.

Questa immagine rappresenta 0,8 grammi di beta-amirina prodotta utilizzando questo protocollo, che è pura oltre il 98%. L'esperimento è stato condotto su una scala di 459 piante e rappresenta una resa isolata di 3,3 milligrammi per grammo di materiale fogliare secco. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare che solo le foglie infiltrate produrranno il composto di interesse.

È quindi vantaggioso raccogliere selettivamente queste foglie quando possibile per evitare la diluizione del campione con tessuto improduttivo. Le fasi post-raccolta del presente protocollo sono fornite a scopo illustrativo. Possono essere sostituite da altre tecniche di purificazione per l'estrazione di prodotti naturali, a seconda della disponibilità di competenze e/o strutture presso l'istituto.

Abbiamo scoperto che il trattamento di base con resina a scambio ionico presentato in questo protocollo è una comoda alternativa alla saponificazione più tradizionale seguita dalla suddivisione liquido/liquido per la rimozione delle clorofille su scala più ampia. Prima di seguire questo protocollo, è necessario familiarizzare con i dati di sicurezza dei materiali per tutte le sostanze utilizzate e adottare le opportune precauzioni di sicurezza. La legislazione locale relativa al lavoro con materiale transgenico deve essere controllata e osservata, anche seguendo adeguate procedure di contenimento.