Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.
7 novembre 2018
Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.
Questo metodo fornisce una piattaforma ad alta produttività per lo screening di Salmonella e Shigella. Il vantaggio principale di questa tecnica è la ripetizione, la specificità, la sensibilità e l'elevata produttività. Questa tecnica combina il metodo e la coltura veloci NAAT in cui è stato applicato prima lo screening PCR in tempo reale, e poi quelli positivi sono stati inviati per la coltura e l'identificazione dei batteri.
Sebbene questo metodo si concentri sullo screening di Salmonella e Shigella, può anche essere applicato ad altri agenti patogeni come Vibrios, Staphylococcus, E.Coli ed eccetera. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la selezione della colonia corretta è difficile a causa della flora di fondo nei campioni. Per iniziare, aggiungere tre millilitri di brodo nutriente a ciascun campione.
Quindi, incubare i campioni a 36 gradi Celsius per sei ore. Successivamente, centrifugare la coltura pre-arricchimento a 800 g per due minuti. Quindi, trasferire il supernatante su un nuovo tubo e centrifugarlo di nuovo per cinque minuti a 12.000 g.
Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere 100 microlitri della soluzione di estrazione del DNA al pellet. Quindi, vortice il tubo per un minuto. Quindi, riscaldare il campione a 1.000 gradi Celsius nel bagno secco.
Dopo aver ripetuto la centrifugazione, raccogliere il supernatante in un nuovo tubo. Innanzitutto, creare la miscela di reazione e impostare il programma di ciclismo in base al protocollo di testo. Quindi, eseguire PCR in tempo reale su una macchina PCR fluorescente in tempo reale.
In primo luogo, aggiungere 100 microlitri della coltura pre-arricchimento a cinque millilitri di mezzo cristallino di selenite. Quindi, incubare la coltura a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Quindi, raccogli un anello della cultura e diffondilo su un piatto.
Quindi, incubare il piatto a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, selezionare colonie sospette e trasferirle su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.
Quindi, identificare la colonia sospetta utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'O-antigene, aggiungete una goccia dei sieri polivalenti dell'O-antigene a una diapositiva pulita. Trasferire un anello della colonia nello scivolo e macinarlo nella sieri.
Se i batteri sembrano sabbia che scorre, ripetere il trattamento precedente con sieri monovalenti O-antigen fino a quando l'antigene non è caratterizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'antigene H, aggiungere una goccia di sieri polivalenti ad antigene H a una diapositiva pulita. Quindi, raccogli un loopful della colonia e griglialo nella sera.
Utilizzare sieri monovalenti ad antigene H per ripetere il trattamento fino a quando non viene caratterizzato lo specifico antigene H. Per separare la coltura, raccogliere un anello della coltura pre-arricchimento e stenderlo su un piatto. Quindi, incubare il luogo a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.
Dopo l'incubazione, raccogli una colonia dall'aspetto sospetto su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 17-24 ore. Quindi, sottosostire la colonia all'identificazione biochimica utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato.
Quindi, applicare una goccia di sieri polivalenti della specie Shigella su uno scivolo pulito. Quindi, usa un micro-loop per raccogliere alcuni dei batteri e macinarli nei sieri. Infine, se i sieri assomigliano alla sabbia che scorre, utilizzare sieri monovalenti della specie Shigella per caratterizzare ulteriormente i batteri.
Utilizzando questo protocollo, campioni di feci provenienti da pazienti sono stati vengono vengono vengono vengono Utilizzando la PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale HEX, indicando che il campione era positivo per le specie di Salmonella. Un'ulteriore PCR in tempo reale ha indicato che il secondo campione era positivo per la Salmonella ed è stato scelto per la coltura guidata delle specie di Salmonella.
Nella coltura guidata delle specie di Salmonella, le colonie rosa e viola sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati hanno indicato che le colonie del secondo campione erano Salmonella paratyphi B.Utilizzando PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale FAM, indicando che il campione era positivo per le specie di Shigella. Ulteriori PCR in tempo reale indicavano che il campione 10 era positivo per Shigella ed è stato scelto per la cultura guidata.
Nella cultura guidata delle specie shigella, le colonie rosa-rosse e incolori sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati indicavano che il campione 10 conteneva batteri shigella sonnei di fase II. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la limitazione del metodo dovuta alla variazione della sequenza.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le impostazioni cultura dirette, al fine di evitare risultati PCR falsi negativi in tempo reale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del rilevamento di Salmonella e Shigella, poiché il nuovo protocollo potrebbe aumentare il tasso positivo di due volte e ridurre significativamente il carico di lavoro e il TAT. Non dimenticare che lavorare con Salmonella e Shigella può essere estremamente pericoloso e i dispositivi di protezione individuale, DPI, dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta una piattaforma ad alto rendimento per lo screening di Salmonella spp. e Shigella spp. mediante PCR in tempo reale abbinata a coltura guidata. Il metodo enfatizza specificità, sensibilità ed efficienza nella rilevazione dei patogeni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Rilevamento di patogeni
- Screening ad alto rendimento
Sfondo
- Salmonella e Shigella sono cause significative di diarrea.
- Metodi di rilevamento accurati e rapidi sono fondamentali per la salute pubblica.
- I metodi tradizionali possono essere lenti e meno specifici.
- Questo studio presenta un nuovo approccio che combina tecniche di amplificazione acido nucleico (NAAT) e coltura.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di screening ad alto rendimento per Salmonella e Shigella.
- Migliorare la specificità e la sensibilità nella rilevazione dei patogeni.
- Fornire una dimostrazione visiva del metodo per una migliore selezione delle colonie.
Metodi Utilizzati
- Applicazione del test di screening PCR in tempo reale ai campioni.
- Invio dei campioni positivi per coltura batterica e identificazione.
- Utilizzo di brodo nutriente per la preparazione dei campioni.
- Valutazione visiva per selezionare le colonie corrette tra la flora di fondo.
Risultati principali
- Il metodo ha dimostrato un'elevata specificità e sensibilità.
- Può essere adattato per altri patogeni come Vibrios ed E. coli.
- La guida visiva ha migliorato l'accuratezza nella selezione delle colonie.
- È stata confermata la capacità di alto rendimento.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per il rilevamento di Salmonella e Shigella.
- Offre un'alternativa affidabile ai metodi tradizionali di rilevamento.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri batteri patogeni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento rapido e specifico di patogeni enterici come Salmonella e Shigella è fondamentale per la sorveglianza sanitaria pubblica e la risposta alle epidemie. Questa piattaforma ad alto rendimento combina il screening mediante PCR in tempo reale con una coltura guidata, migliorando la sensibilità e riducendo il tempo necessario per ottenere i risultati rispetto ai metodi tradizionali di coltura. L'approccio consente una validazione precoce degli obiettivi nella ricerca sulle malattie infettive, permettendo un'identificazione affidabile dei patogeni a partire da campioni clinici complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche confermando la presenza di agenti patogeni in modelli preclinici di infezione.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio mediante l'identificazione specifica di sierotipi di Salmonella e Shigella.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella riduzione del rischio del bersaglio riducendo i falsi negativi nei flussi di lavoro di rilevamento degli agenti patogeni.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening dell'efficacia antimicrobica o vaccinale in fasi successive.
- Valore operativo: Standardizza l'elaborazione dei campioni mediante pre-enriccimento, estrazione del DNA e PCR in tempo reale per ottenere risultati riproducibili.
- Scalabilità: Consente lo screening ad alto rendimento di campioni clinici o ambientali con riduzione del tempo di manipolazione manuale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo campioni confermati per patogeni per studi di efficacia.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette il rilevamento di marcatori di virulenza mediante caratterizzazione biochimica e sierologica post-coltura.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione confermando la presenza del patogeno prima di investire in candidati terapeutici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la verifica di ipotesi in modelli di infezione e consentendo un rilevamento affidabile dei patogeni prima delle attività di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta Facilita la chiarificazione del percorso confermando Salmonella o Shigella come agenti eziologici nei modelli di malattia.
- Screening: Fornisce campioni pronti per il saggio con carica patogena quantificata mediante valori Ct di PCR in tempo reale per analisi comparativa.
- Analitica: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (valori Ct, conteggi di colonie) che consentono il confronto tra condizioni e la selezione di risultati significativi.
- Ricerca traslazionale Garantisce l'utilizzo di sistemi pertinenti alla malattia mediante la verifica della presenza del patogeno nei modelli prima dei test terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di screening riutilizzabile, applicabile a numerosi patogeni oltre a Salmonella e Shigella.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica confermando l'identità del patogeno mediante PCR ortogonale e conferma colturale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di pre-arricchimento, centrifugazione ed estrazione del DNA.
- Valore strategico: Aumenta l'efficienza del capitale riducendo il carico di lavoro e i tempi di analisi, consentendo un maggiore numero di campioni analizzati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio fornendo dati affidabili sulla rilevazione dei patogeni per decisioni di avanzamento o interruzione.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze specialistiche in microbiologia molecolare e progettazione di saggi di PCR in tempo reale.
- È subordinato all'accesso a macchinari per PCR in tempo reale con rilevamento fluorescente e a sistemi automatizzati di identificazione microbica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di gestione dei campioni e i criteri di selezione delle colonie.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si estenda ad altri patogeni, a causa delle variazioni nei terreni di arricchimento e nei reagenti sierologici.
- Comprende limitazioni pratiche, come la variabilità delle sequenze che può influenzare il legame degli inneschi (primer) e la necessità di utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) nella manipolazione di patogeni di Livello di Sicurezza Biologica 2.
