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Ringraziamo Sig. ra J. Shinohara e I. Nieda per il lavoro di tecnico e di segreteria. Inoltre, ringraziamo la d. ssa Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi per la loro collaborazione per l'acquisizione del campione in sala operatoria. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell'istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone e della Japan Society per la promozione della scienza (17K 10606).

LDN sono stati ottenuti da pazienti arruolati in questo studio e sono stati approvati dalla istituzionale recensione Consiglio di Jichi Medical University.
1. isolamento di LDN dalla cavità addominale lavande e rilevamento netto
<ol><li>Acquisizione del campione<ol>
<li>Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale. Nota: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno subito una gastrectomia, colectomia o esofagectomia senza pregiudizi basati sull'età o sesso. Soluzione salina è stato trasferito in un contenitore e versato in tutto l'addome entro un minuto. Questo è effettuato ordinariamente come un lavaggio peritoneale postoperatorio senza significativi effetti sui pazienti.</li>
		<li>Lavaggio della cavità addominale estesamente per almeno 1 min. Nota: È consigliabile che il fluido infuso lentamente si agita con le mani del chirurgo affinché i campioni siano uniformi.</li>
		<li>Recuperare 200 mL di liquido di lavaggio con quattro siringhe da 50 mL. Nota: A volte un connettore di gomma è usato per prendere i fluidi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la purificazione di LDN peritoneale usando del granulocyte mAb specifici, CD66b16. Nota: Poiché lo strato intermedio dopo centrifugazione in gradiente di densità contiene molte cellule mononucleari, selezione positiva dei neutrofili polimorfo utilizzando CD66b mAb è stato effettuato.<ol>
<li>Trasferire il liquido di lavaggio peritoneale per un tubo da 50 mL. Nota: In questo passaggio, passare i fluidi attraverso un filtro di nylon 100 µm per rimuovere le impurità.</li>
		<li>Centrifugare il fluido peritoneale a 270 x g per 7 minuti a TA.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 5 mL di PBS con EDTA 0.02%.</li>
		<li>Sovrapposizione con attenzione i 5 mL di sospensione cellulare su una soluzione di gradienti di densità 3 mL.</li>
		<li>Centrifugare a 1.700 x g per 15 min a RT senza pause.</li>
		<li>Raccogliere i ~ 2-3 mL di soluzione contenente gli strati intermedi (Figura 1A) usando una pipetta e mescolare con 10 mL di PBS con EDTA 0.02%.</li>
		<li>Centrifugare il liquido peritoneale a 400 x g per 7 min a RT e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere un altro 10 mL di PBS con 0,02% EDTA e centrifugare a 270 x g per 7 min a RT. scartare il surnatante.</li>
		<li>Sciogliere il pellet cellulare (1 x 107) in 60 µ l di tampone per il kit di separazione magnetica delle cellule.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di blocco Fc per il pellet e incubare per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di anti-CD66b coniugato con microsfere e incubare per altri 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di MACS.</li>
		<li>Applicare la sospensione cellulare a una colonna magnetica del campo magnetico di un separatore magnetico adatto e raccogliere il flusso continuo contenenti CD66b(-) celle di colonna con 15 mL di tampone di lavaggio.</li>
		<li>Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e sciacquare immediatamente le cellule CD66b(+) magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Nota: La popolazione delle cellule di CD66b(+) consiste principalmente di neutrofili come determinato mediante analisi Citofluorimetrica indicando che > 95% della frazione CD66(+) sono positivi per CD11b, CD15 e CD16, ma la negazione per CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generazione di reti<ol>
<li>Dopo centrifugazione a 270 x g per 7 min a RT, Risospendere la LDN isolata (5 x 106) in 1 mL di RPMI1640 con 10% FCS.</li>
		<li>Cultura la LDN su un piatto rivestito di poli-L-lisina 6-pozzetti (6 cm di diametro) per 2 ore a 37 ° c 5% CO2.</li>
		<li>Aggiungere il colorante di contrasto fluorescente verde (un colorante membrana impermeabile per il nucleo e cromosomi) alla concentrazione finale di 5 µM.</li>
		<li>Immediatamente osservare la morfologia delle reti (i componenti del DNA extracellulare espulsi da LDN sotto microscopia a fluorescenza).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. colorazione delle cellule del tumore con tintura di Linker cella fluorescente rosso
<ol><li>Preparare il cancro umano linee cellulari MKN45, NUGC e OCUM-1.</li>
	<li>Lavare 1 x 107 cellule con PBS + 0,02% EDTA in una provetta da 15 mL e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a TA.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione per tintura di macchiatura per il pellet e pipettare delicatamente.</li>
	<li>Sciogliere 4 µ l di colorante rosso fluorescente cella Linker in 1 mL di soluzione per la macchiatura e mescolare con la sospensione cellulare dal punto 2.2.</li>
	<li>Incubare i pellet per 4 minuti a TA.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di DMEM (10% FBS) per interrompere la reazione di macchiatura.</li>
	<li>Centrifugare 270 x g per 7 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere due volte i passaggi 2.6 e 2.7.</li>
	<li>Controllare con un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm) che le cellule del tumore sono macchiate di rosso.</li>
</ol>3. analisi di adesione delle cellule del tumore ai NETs
<ol><li>Risospendere le cellule di tumore macchiato fluorescente rosso (1 x 106) in 1 mL di RPMI 1640 completati con 0.1% BSA.</li>
	<li>Aggiungere le cellule del tumore per la cultura LDN che ha prodotto le reti come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Incubare per 5 min a 37 ° c, che permette alle cellule del tumore di contattare le reti. Nota: Lunga incubazione induce adesione delle cellule del tumore per LDN o le piastre.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e lavare delicatamente i pozzetti aggiungendo 2 mL di media preriscaldata (0.1% BSA + RPMI 1640) e il piatto di turbine.</li>
	<li>Ripetere due volte la procedura di lavaggio al punto 3.4. Nota: Poiché le reti debolmente collegare alla piastra, lavaggio dovrebbe essere fatto nel modo più delicato possibile per evitare la rimozione delle reti stesse.</li>
	<li>Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi ad una concentrazione finale di 5 µ g/mL per la visualizzazione delle reti.</li>
	<li>Osservare le reti e attaccato le cellule del tumore usando i filtri appropriati (verde, eccitazione = 504 nm, che emettono = 523 nm; rosso, eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm).</li>
	<li>Unire le cifre per mostrare le cellule del tumore che sono intrappolate dai NETs. Nota: In alcuni esperimenti, enzima di degradazione del DNA è stato aggiunto alla cultura LDN (concentrazione finale di 100 U/mL) 5 min prima del co-incubazione per 5 min.</li>
</ol>4. time Lapse Video analisi delle cellule del tumore intrappolati
<ol><li>Cultura la LDN peritoneale in un 35 mm tondo piatto rivestito con poli-L-lisina come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi per visualizzare le reti come descritto al punto 1.3.</li>
	<li>Dopo 1 min di incubazione, rimuovere il supporto e aggiungere 2 mL di 0.1% BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e aggiungere non colorati 1 x 106 MKN45 cellule sospese in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubare per 5 min a RT.</li>
	<li>Rimuovere tutte le cellule del tumore non collegato lavando delicatamente come descritto al punto 3.4 e aggiungere DMEM con 10% FCS completati con 100 u/mL penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.</li>
	<li>Montare la piastra di coltura in un sistema di osservazione di tutta la vista cellulare e selezionare il campo appropriato nel quale tumore le cellule sono intrappolate dai NETs.</li>
	<li>Continuare a co-cultura per altri 2 giorni e scattare foto continue del campo ogni 6 min sotto luce normale e fluorescenza, che rileva le cellule MKN45 e reti, rispettivamente.</li>
	<li>Sovrapporre le immagini a ogni timepoint e costruire time-lapse video utilizzando il software Image Viewer.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Gli studi precedenti hanno segnalato che cellule tumorali circolanti possono essere intrappolati dal netto substrati in vivo10,11. Cellule di carcinoma mammario metastatico sono state indicate per stimolare i neutrofili e indurre la formazione di reti, che assiste nella crescita delle cellule del tumore nell' organo bersaglio17. Inoltre, abbiamo trovato che colture di breve durata di LDN dal fluido di lavaggio postoperatorio prodo...

Neutrofili nucleari polimorfo nel sangue circolante in genere sono separati dalle cellule mononucleari attraverso il metodo di preparazione gradienti di densità. Tuttavia, alcuni neutrofili conosciuti come i neutrofili a bassa densità (LDN), con i fenotipi di CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), sono co-purificati con cellule mononucleari. Il numero relativo di LDN aumenta significativamente in varie condizioni patologiche tra cui malattie autoimmuni1,2, sepsi3e cancro4,5. Gli studi precedenti hanno dimostrato che LDN sono una classe fenotipico e funzionalmente distinta di neutrofili6. Dovrebbe essere notato che LDN nel sangue circolante sono più probabilità di produrre trappole extracellulari del neutrofilo (reti) di densità normale neutrofili2,7. Le reti sono web-come strutture composte di acidi nucleici, istoni, proteasi e proteine citosoliche e granulare, e in modo efficiente possono intrappolare e distruggere gli agenti patogeni8.
Recentemente, le reti hanno dimostrate di catturare non solo i microbi, ma anche le piastrine e cellule tumorali che possono assistere all'embolo formazione9 e tumore metastasi10,11circolanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari dietro le interazioni adesive tra reti e piastrine o le cellule del tumore sono ancora poco chiari. Più recentemente, un'analisi di adesione in vitro hanno rivelato che le cellule di leucemia mieloide (K56212) e cellule di carcinoma del polmone (A54913) alleghino alle reti tramite le integrine β1 e β3. Gli autori hanno usato stock netto isolato dai neutrofili e attivato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) come il substrato di adesione14. Anche se questo test permette di individuare i reali interazioni con componenti netti in assenza di neutrofili, è discutibile se il "cell-free stock netto" isolato mediante centrifugazione ad alta velocità mantiene la struttura molecolare identica ai NETs prodotto in vivo. Recentemente, abbiamo trovato quel liquido di lavaggio peritoneale dopo chirurgia addominale conteneva molti LDN maturo, che generò massicce reti e attaccato alle cellule del tumore che causano metastasi peritoneali15. In questo studio, abbiamo esaminato con successo l'adesione delle cellule del tumore ai NETs intatto senza alcuna manipolazione fisica. Qui, indichiamo i dettagli di una tecnica per rilevare interazioni adesive tra le reti e le cellule del tumore libero.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SVEZIA</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightDa&commercio; Microsfere CD66b di sangue intero</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione madre MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Separatore magnetico MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione 5mM per colorante di acido nucleico verde SYTOX in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td> Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso <td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 per l'etichettatura generale della membrana cellulare</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluente C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Glucosio medio-alto (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5mol/l-EDTA Soluzione (pH 8,0)</td><td>nacalai tesque, Giappone</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate dall'USDA</td><td>gibco da life technologies, Messico</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina liofilizzata in polvere, &ge; 96% (elettroforesi su gel di agarosio)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Life Technologies Giappone</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophyttic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>MICROPIASTRA rivestita di poli-L-lisina 6Well</td><td>IWAKI, Giappone</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>MICROPIASTRA rivestita in poli-L-lisina 24 pozzetti</td><td>IWAKI, Giappone</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscopio a fluoresceina</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Giappone</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di osservazione cellulare a vista intera</td><td>Nikon, Kanagawa, Giappone</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 linea cellulare per cancro gastrico umano</td><td>Riken, Tukuba Giappone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di cancro gastrico umano NUGC-4</td><td>Riken, Tukuba Giappone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 linea cellulare di cancro gastrico umano</td><td>Osaka City University, Giappone</td><td>N/A</td><td>Regalo dal Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Attiva i neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), che possono catturare e distruggere i microbi. Studi recenti suggeriscono che le reti siano coinvolti nei vari processi di malattia, quali le metastasi del tumore, la trombosi e la malattia autoimmune. Qui, ci mostra una tecnica dettagliata in vitro per rilevare attività netto durante l'intrappolamento delle cellule del tumore libero, che si sviluppano dopo allegato ai NETs. In primo luogo, abbiamo raccolto i neutrofili a bassa densità (LDN) dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatorio da pazienti sottoposti a laparotomie. Coltura a breve termine di LDN provocato dalla massiccia formazione netta che è stato visualizzato con verde fluorescente nucleare e colorante di contrasto del cromosoma. Dopo co-incubazione di linee cellulari di cancro gastrico umano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 con le reti, molte cellule del tumore erano intrappolate dai NETs. Successivamente, l'allegato completamente è stata abrogata dal degrado delle reti con dnasi I. Time-lapse video ha rivelato che le cellule del tumore intrappolate dalle reti non è morto ma invece è cresciuta vigorosamente in una cultura di continua. Questi metodi possono essere applicati alla rilevazione di interazioni adesive tra reti e vari tipi di cellule e materiali.

Nella cultura 2 ore, LDN CD66b(+) derivata da lavaggio peritoneale fluido stringa ha mostrato strutture colorate con colorante verde fluorescente per nucleare e cromosoma (Figura 1B), mentre CD66b(-) cellule mononucleari non ha fatto (Figura 1). Tuttavia, quando le culture LDN sono state pretrattate con 100 U/mL dnasi I, la caratteristica struttura è stato distrutta (Figura 1), che indica che sono st...

Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo delle sottopopolazioni di neutrofili nell'immunologia dei tumori, in particolare sul coinvolgimento meccanico delle trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, nelle metastasi tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione delle interazioni adesive delle cellule tumorali con i NET intatti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro.Poiché i NET derivati da specifici sottogruppi di neutrofili possono promuovere metastasi tumorali. A dimostrare la procedura sarà Junko Shoniohara del nostro laboratorio. Per acquisire i neutrofili, infondere prima un litro di soluzione fisiologica sterile normale immediatamente prima della chiusura della ferita direttamente nella cavità addominale di un paziente che ha appena subito un intervento chirurgico addominale a causa di un tumore maligno gastrointestinale e lavare ampiamente la cavità addominale per almeno un minuto.Quindi mescolare la soluzione salina all'interno della cavità e recuperare 200 millilitri di liquido lavato con quattro siringhe da 50 millilitri. In laboratorio trasferire il liquido di lavaggio p

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

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Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

In questo video, descriviamo la procedura per isolare i neutrofili a bassa densità, o LDN, dal liquido di lavaggio peritoneale di un paziente umano postoperatorio. Le LDN così ottenute possono essere utilizzate in ulteriori esperimenti a valle per comprendere il loro ruolo nella crescita e nella progressione tumorale.

Isolamento peritoneale dei neutrofili a bassa densità: una tecnica per ottenere neutrofili a bassa densità dal liquido di lavaggio peritoneale utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

Questo video dimostra la colorazione fluorescente delle trappole extracellulari dei neutrofili (NET), i componenti del DNA extracellulare espulsi dai neutrofili. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET.

Microscopia a fluorescenza di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per osservare l'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET

In questo video, analizziamo il comportamento post-adesione delle cellule tumorali intrappolate in trappole extracellulari di neutrofili (NET) mediante la co-coltura di neutrofili a bassa densità e cellule tumorali gastriche. L'analisi video time-lapse aiuta a monitorare vari eventi cellulari e a studiare il ruolo dei NET in condizioni patologiche.

Microscopia a fluorescenza time-lapse di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per analizzare l'interazione post-adesione tra cellule tumorali e NET

Questo video dimostra una tecnica in vitro per generare e isolare trappole extracellulari (NET) di neutrofili. I neutrofili vengono isolati dal sangue periferico e stimolati con forbolo miristato acetato (PMA) per produrre NET. Durante l'incubazione, i neutrofili subiscono un processo di morte cellulare (NETosi) per rilasciare NET che comprendono cromatina decondensata mescolata con proteine citoplasmatiche granulari.

Una tecnica in vitro per generare trappole extracellulari per neutrofili umani

In questo video, dimostriamo un test che utilizza la microscopia a fluorescenza per rilevare l'adesione delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Nei pozzetti di prova, c'è un notevole aumento del numero di cellule tumorali marcate in fluorescenza che aderiscono ai NET, mentre i pozzetti trattati con DNasi mostrano una ridotta adesione delle cellule tumorali ai NET.

Saggio di adesione in vitro per rilevare l'aderenza delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Scopri come isolare neutrofili a bassa densità dal liquido di lavaggio peritoneale per studiare le trappole extracellulari del neutrofilo (NETs) e la loro interazione con le cellule tumorali. Questa tecnica consente di visualizzare l'adesione delle cellule tumorali alle NETs, offrendo nuove prospettive per la comprensione della metastasi e per potenziali strategie terapeutiche nel trattamento del cancro.

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali (Video) | JoVE Journal

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

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