Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo delle sottopopolazioni di neutrofili nell'immunologia dei tumori, in particolare sul coinvolgimento meccanico delle trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, nelle metastasi tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione delle interazioni adesive delle cellule tumorali con i NET intatti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro.

Poiché i NET derivati da specifici sottogruppi di neutrofili possono promuovere metastasi tumorali. A dimostrare la procedura sarà Junko Shoniohara del nostro laboratorio. Per acquisire i neutrofili, infondere prima un litro di soluzione fisiologica sterile normale immediatamente prima della chiusura della ferita direttamente nella cavità addominale di un paziente che ha appena subito un intervento chirurgico addominale a causa di un tumore maligno gastrointestinale e lavare ampiamente la cavità addominale per almeno un minuto.

Quindi mescolare la soluzione salina all'interno della cavità e recuperare 200 millilitri di liquido lavato con quattro siringhe da 50 millilitri. In laboratorio trasferire il liquido di lavaggio peritoneale attraverso un filtro di nylon da 100 micrometri in singole provette da 50 millilitri per la centrifugazione. Risospendere i pellet in 5 millilitri di PBS integrati con EDTA allo 0,02% e sovrapporre accuratamente ciascuna sospensione cellulare su tre millilitri di soluzione a gradiente di densità.

Dopo la separazione in gradiente di densità, prelevare da due a tre millilitri dello strato intermedio da ciascuna provetta e lavare i campioni di fluido peritoneale in 10 millilitri di PBS fresco più EDTA per provetta. Raggruppare i pellet in 10 millilitri di PBS fresco più EDTA per un ulteriore lavaggio e diluire le cellule a una volta da 10 a una settima cella per 60 microlitri di selezione cellulare attivata magneticamente, o MACS, concentrazione di tampone. Bloccare qualsiasi legame aspecifico con 20 microlitri di blocco Fc per 10 minuti a quattro gradi Celsius seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di perline magnetiche anti-CD66b.

Dopo 10 minuti a quattro gradi Celsius, lavare e risospendere le celle in 500 microlitri di tampone MACS e aggiungere le celle a una colonna magnetica di dimensioni adeguate all'interno del campo magnetico di un separatore magnetico adatto. Quando tutte le cellule CD66b negative hanno attraversato la colonna, aggiungere 15 millilitri di tampone MACS fresco al serbatoio della colonna e trasferire la colonna dal separatore magnetico in un nuovo tubo conico. Quindi immergere immediatamente la colonna per inserire il positivo CD66b marcato magneticamente nel tubo.

Dopo la centrifugazione, risospendere i neutrofili isolati a bassa densità a cinque volte 10 al sesto di cellule per millilitro di terreno RPMI1640 integrato con concentrazione di FBS e seminare 1 millilitro di neutrofili per pozzetto sulla piastra rivestita di poli-L-lisina a sei pozzetti. Dopo due ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, colorare le cellule di ciascun pozzetto con un colorante nucleare e cromosomico impermeabile a membrana fluorescente appropriato secondo le istruzioni del produttore e osservare immediatamente la morfologia dei NET mediante microscopia a fluorescenza. Per valutare l'adesione delle cellule tumorali ai NET, risospendere le cellule tumorali gastriche colorate con il colorante fluorescente di contrasto a una volta da 10 a un sesto per millilitro di RPMI1640 integrate con una concentrazione sierica di albumina bovina allo 0,1% e aggiungere un millilitro di cellule tumorali a ciascun pozzetto delle colture di neutrofili a bassa densità.

Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere il surnatante da ciascun pozzetto e lavare delicatamente le cellule due volte con 2 millilitri di RPMI1640 terreno preriscaldato integrato con BSA per lavaggio. Un'incubazione di cinque minuti è sufficiente per rilevare il legame specifico di NET. Aggiungere il terreno riscaldato sul lato di ogni pozzetto, agitare lentamente e delicatamente la piastra e rimuovere il surnatante con un aspiratore.

I NET e le cellule tumorali attaccate possono quindi essere osservati mediante microscopia a fluorescenza. Per un'analisi video in time lapse delle cellule tumorali intrappolate, la coltura e la colorazione dei neutrofili peritoneali a bassa densità in una piastra da 35 millimetri, rivestita di poli-L-lisina, come dimostrato, seguita da un breve lavaggio in due millilitri di BSA allo 0,1% più RPMI1640. Sostituire il terreno con una volta da 10 a una sesta cellula tumorale gastrica non colorata sospesa in due millilitri di RPMI integrata con BSA per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule in due millilitri di RPMI fresco integrato con BSA per cinque minuti a temperatura ambiente, seguito da un leggero roteamento per rimuovere eventuali cellule tumorali non attaccate. Quindi sostituire il surnatante con DMEM integrato con FBS e antibiotici e montare la capsula in un sistema di osservazione cellulare a vista intera per l'analisi time-lapse dell'intrappolamento delle cellule tumorali da parte dei NET. Dopo due ore di coltura, i neutrofili CD66b positivi a bassa densità derivati dal liquido di lavaggio peritoneale presentano strutture di stringa mediante colorazione nucleare e cromosomica fluorescente verde, mentre le cellule mononucleate CD66b negative non lo fanno.

Quando le colture di neutrofili a bassa densità vengono pretrattate con 100 unità per millilitro di DNAsi I, tuttavia, le strutture caratteristiche vengono distrutte, indicando che le strutture sono composte da DNA extracellulare espulso dai neutrofili. Quando i neutrofili a bassa densità vengono coltivati su piastre di plastica non rivestite, si possono osservare molti cluster di NET che galleggiano all'interno del terreno con pochi NET attaccati al fondo della capsula. Dopo cinque minuti di incubazione con una linea cellulare tumorale gastrica marcata in fluorescenza, molte cellule tumorali si attaccano ai neutrofili all'interno dei NET, un fenomeno che non si osserva dopo il pretrattamento con DNAsi I. Modelli di adesione simili si osservano anche per altre cellule tumorali.

OKUM-1 e NUGC-4. È interessante notare che, mentre i NET scompaiono gradualmente entro diverse ore dalla co-coltura estesa delle cellule tumorali, le cellule tumorali intrappolate dai NET iniziano a proliferare vigorosamente dopo il rilascio di NET. Durante questa procedura, è importante ricordare che, poiché i NET si attaccano debolmente alla piastra, i processi di lavaggio e trasferimento delle stoviglie devono essere eseguiti in modo particolarmente cauto.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori in vari campi della scienza biomedica per esplorare la relazione causale dei NET con varie malattie come la trombosi, la sindrome da risposta infiammatoria sistemica e le malattie autoimmuni.