Name: Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro linfezione di epatite B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri un protocollo sensibile e conveniente per rilevare l'integrazione del DNA dell'epatite B nel genoma ospite con risoluzione a singola coppia di basi. Questo metodo supporta studi virologici e genomici.

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Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal centro tedesco per ricerca di infezione (DZIF), TTU epatite progetti 5.807 e 5.704, la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15) e il centro australiano per la ricerca di virologia di epatite e HIV.
Siamo debitori al Professor William Mason per la sua parte nello sviluppo del metodo originale di invPCR e che dimostrano a noi. Vorremmo ringraziare i dottori Yi Ni e Florian A. Lempp per reagenti (linee cellulari ed inoculo HBV). Riconosciamo Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt e Dr. Katrin Schöneweis per l'assistenza tecnica. Siamo grati di Miriam Kleinig per correzione di bozze e di professori Nicholas Shackel e Ralf Bartenschlager per il continuo supporto.

1. infezione ed estrazione del DNA delle cellule
<ol><li>Mantenere coltivate Huh7-NTCP cellule8,9 dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale di v/v, 1 x penicillina/streptomicina e 2 mM L-glutammina. Nota: Questo precedentemente è stato segnalato in dettaglio40.</li>
	<li>Cellule Huh7-NTCP di seme 2 x 105 cellule/mL in una piastra 12-pozzetti con 1 mL di DMEM.</li>
	<li>Se il test trattamenti con le cellule (per esempio, inibitori HBV), applicarle al surnatante della cultura 4 h dopo la semina (1 giorno prima dell'infezione da HBV). Per un controllo negativo, applicare 200 nM Myrcludex B (un potente HBV voce inibitore41).</li>
	<li>Utilizzare il surnatante42 eparina-colonna purificato da HepAD3843 come un inoculo di infettare le cellule alle 1.000 VGE/cella in 500 µ l di terreno di coltura (DMEM completate con siero bovino fetale 10% v/v, 1 penicillina/streptomicina, 2 mM L-Glutammina e 2,5% v/v DMSO), contenente 4% w/v polietilenglicole 8000 [disciolto in 1x tampone fosfato salino (PBS)].</li>
	<li>Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C (fissato al 5% di CO2 e 90% di umidità).</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS 1X sterile a post-infezione 16 – 24 h.</li>
	<li>Sostituire il supporto di cultura ogni 2 giorni dopo l'infezione di HBV fino alla raccolta.</li>
	<li>A post-infezione giorno 3, trattare le cellule con 5 µM Tenofovir disoproxil e 10 µM lamivudina per limitare la produzione di intermedi replicativi HBV che sono amplificabile da invPCR.</li>
	<li>A post-infezione giorno 5, tripsinizzano le cellule con 200 µ l di tripsina-EDTA e li risospendere in 2 mL di DMEM (completato con siero bovino fetale 10% v/v, 1 x penicillina/streptomicina e 2 mM L-Glutammina), anche contenente 5 µM Tenofovir disoproxil e 10 µM Lamivudina.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni delle cellule a una piastra a 6 pozzetti per indurre un round di mitosi (che sono stata segnalata per indurre la perdita di HBV cccDNA44 e altri intermedi di HBV DNA sono amplificabile da invPCR).</li>
	<li>post-All'infezione giorno 7, tripsinizzano cellule espanse in 400 µ l di tripsina-EDTA e risospendere la miscela in 1 mL di DMEM. Posizionare la sospensione in una provetta da 1,5 mL, agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min ed eliminare il surnatante tramite aspirazione.</li>
	<li>(Opzionale) Conservare il pellet di cellule a-20 ° C fino a quando non sono pronti per l'estrazione del DNA.</li>
	<li>Estrarre il DNA dal pellet cellulare utilizzando un kit di estrazione del DNA, secondo le istruzioni del produttore. Stimare la concentrazione finale di DNA mediante densitometria ottica. Nota: La resa di DNA in un volume di eluizione 100 μL è generalmente ~ 250-400 ng/μL.</li>
</ol>2. inversione del DNA
<ol><li>~1.5–2.5 aliquota μg di DNA totale estratto dal passaggio 1 in una provetta PCR 200 μL. Aggiungere la quantità appropriata di enzima di restrizione master-mix per provocare un volume di reazione 40 μL contenente 1x tampone di reazione del digest (ad es., CutSmart buffer) e 10 U NcoHF.</li>
	<li>Mescolare accuratamente le reazioni e rotazione verso il basso in una centrifuga di piccolo tubo. Incubare la reazione dell'enzima di limitazione in una macchina PCR a 37 ° C per 1 h per efficienza ottimale digestione.</li>
	<li>Inattivare l'enzima di restrizione incubando a 80 ° C per 20 min.</li>
	<li>Trasferire la reazione degli enzimi di limitazione intero in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 400 μL di 1x buffer di T4 DNA ligasi e 500 U di T4 DNA ligasi e mescolare accuratamente. Il volume di reazione grandi incoraggia intra-molecolare (al contrario di inter-molecolari) legatura dei frammenti del DNA digeriti.</li>
	<li>Incubare la reazione di legatura a temperatura ambiente per 2 h garantire completa legatura.</li>
	<li>Inattivare la ligasi del DNA T4 a 70 ° C per 20 min.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di laurilsolfato di sodio p/v di 10% per garantire la completa inattivazione della ligasi T4.</li>
	<li>Mescolare i tubi nel Vortex impulso e brevemente rotazione verso il basso la miscela di reazione. Aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 100 mM e destrano (35 – 45 kDa) ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Mescolare i tubi nel Vortex impulso e brevemente rotazione verso il basso la miscela di reazione.</li>
	<li>Aggiungere 900 μL di etanolo al 100% e mescolare capovolgendo. Precipitare il DNA a-20 ° C durante la notte.</li>
	<li>Pellet il DNA precipitato mediante centrifugazione a 14.000 x g per 15 min. eliminare il surnatante tramite aspirazione con una pipetta P200. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo al 70% v/v e centrifugazione a 14.000 x g per 15 min.</li>
	<li>Eliminare l'etanolo tramite aspirazione con una pipetta P200. Asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Dissolva la pallina in 20 μL di H2O. aggiungere 20 μL di un enzima di restrizione master-mix per provocare un volume di reazione 40 μL contenente 1x tampone di reazione del digest, 5 U di BsiHKAI e 5 U di Sph-HF Incubare la reazione dell'enzima di limitazione in un calore-blocco a 37 ° C (la temperatura ottimale per Sph-HF) per 1 h.</li>
	<li>Brevemente rotazione verso il basso la miscela di reazione. Incubare la reazione dell'enzima di limitazione in un blocco di calore a 65 ° C (la temperatura ottimale per BsiHKAI) per 1 h.</li>
	<li>Brevemente rotazione verso il basso la miscela di reazione.</li>
	<li>Conservare il DNA invertito a-20 ° C fino al passaggio successivo.</li>
</ol>3. nested PCR
<ol><li>Rimuovere potenziali sequenze amplificate da una guarnizione in silicone riutilizzabile stuoia utilizzando una soluzione di degradazione del DNA, risciacquare il tappetino accuratamente con acqua priva di DNA e asciugare all'aria e a temperatura ambiente mentre si prepara la miscela PCR.</li>
	<li>Preparare 1 mL di un 1 mix di x PCR contenente l'attaccante esterno (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') e inversa (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') primer ad una concentrazione di 0,5 µM.</li>
	<li>Aggiungere 170 μL del 1 x PCR mix nei pozzetti A1 ed E1 in una piastra PCR a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 120 μL del mix x PCR 1 pozzetti B1 per H1.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di DNA invertito dal passaggio 2 nei pozzetti A1 ed E1 (2 diversi invertiti campioni possono essere analizzati nello stesso piatto di PCR). Mix la reazione di ogni pozzetto pipettando delicatamente ogni circa 10 volte utilizzando un P1000 impostato a 100 μL.</li>
	<li>Campioni diluiti in serie da pozzetti A1 a D1 con un rapporto di 1:3 trasferendo 60 μL in ogni fase. Mescolare i pozzetti ad ogni passo pipettando delicatamente circa 10 volte utilizzando un P1000 impostato a 100 μL. Evitare la formazione di bollicine. Ripetere il passaggio 3.6 per ben E1, diluire fino a ben H1.</li>
	<li>Aliquotare 10 μL di miscela di reazione, utilizzando una pipetta multicanale da pozzetti A1-H1 in pozzetti A2-H2, A3-H3, e così via fino a raggiungere A12-H12 di pozzetti della piastra 96 pozzetti. Coprire la piastra PCR con il tappetino in silicone asciutto dal punto 3.1, premendo con forza.</li>
	<li>Posizionare la piastra in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma: 10 min a 95 ° C; 35 cicli di 15 s a 95 ° C, 15 s a 54 ° C e 3 min a 72 ° C; 7 min a 72 ° C; quindi, tenere la piastra a temperatura ambiente.</li>
	<li>I perni di un replicatore di 96-pin al rovente con un becco Bunsen di calore e quindi raffreddare per almeno 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Riempire i pozzetti di una piastra PCR secondo con 10 μL di 1 mix di x PCR (contenente un tampone di carico-ready gel) e l'inoltra interiore (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') e inversa (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') a 0,5 µM.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il tappetino di silicone dalla piastra PCR della piastra 96 pozzetti da PCR il primo turno ed evitare la contaminazione incrociata tra pozzetti.</li>
	<li>Utilizzare il replicatore raffreddato per trasferire i prodotti di PCR della piastra 96 pozzetti dal primo turno PCR per il neo-aliquotato piastra a 96 pozzetti. Eseguire la PCR annidata utilizzando le stesse condizioni come descritto al punto 3.8, tranne che per cambiare il punto di denaturazione iniziale a 95 ° C da 10 min a 2 min.</li>
</ol>4. PCR prodotto isolamento ed estrazione del Gel
<ol><li>Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi in gel utilizzando un 96 pozzetti con gel di agarosio al 1,3% w/v. Per un gel di agarosio di 100ml, eseguito a 200 V per 10 – 15 min.</li>
	<li>Asportare le bande di DNA da gel di agarosio utilizzando cannucce monouso. Per ogni prodotto PCR, inserire la cannuccia e gel di agarosio presa in una provetta da 1,5 mL e tagliare la paglia a misura con le forbici. Nota: È sufficiente isolare bande solo da tali diluizioni in cui i singoli prodotti di PCR possono essere risolti.</li>
	<li>(Opzionale) Conservare le provette a-20 ° C per l'estrazione successiva.</li>
	<li>Espellere le spine dell'agarosi in ogni provetta premendo sull'estremità del frammento della paglia. Aggiungere 300 μL di tampone di estrazione del gel e 5 μL di liquami di gel estrazione vetro perlina in ogni provetta.</li>
	<li>Estrarre i prodotti di PCR come da istruzioni del produttore per il kit di estrazione del gel (tranne per i passaggi di lavaggio si utilizza metà-volumi) ed eluire il DNA da perline con 30 µ l di acqua.</li>
	<li>Presentare il DNA purificato per Sanger sequenziamento (secondo le istruzioni del fornitore) con il primer Forward usato nel secondo-round nested PCR.</li>
</ol>5. l'analisi di sequenza
<ol><li>Confermare giunzioni di DNA del virus-cellula eseguendo analisi BLAST nucleotide (utilizzando le impostazioni predefinite allineamento alla raccolta intera del nucleotide). Nota: I risultati rappresentativi sono dettagliati nella Figura 3 riportata di seguito.<ol>
<li>Se solo si osserva un parziale allineamento della sequenza, tagliare il sequenza del DNA di HBV da 5' prima di eseguire nuovamente un'analisi BLAST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare criteri di selezione rigorosi per determinare se una data sequenza rappresenta un incrocio di vera integrazione come segue:<ol>
<li>Includere solo sequenze contenenti > 20 bp di una sequenza di cellulare per mappatura fiducioso al genoma cellulare.</li>
		<li>Ignorare tutte le sequenze che contengono siti di restrizione di qualsiasi enzimi utilizzati all'interno di 10 bp della giunzione integrazione presunto virus-cellula, come essi eventi rappresentano probabilmente in vitro la legatura, piuttosto che le giunzioni di vera integrazione.</li>
		<li>Ignorare qualsiasi sequenze con livelli di fluorescenza di evidente picco dissimili su entrambi i lati della giunzione presunta integrazione in cromatografi di sequenziamento, come queste sono probabilmente artefatti generati da contaminazione incrociata durante la reazione di sequenziamento o cromatografia capillare.</li>
		<li>Definiscono l'esclusiva integrazione eventi come quelli con l'esatta HBV e sequenze di cellulare allo svincolo virus-cellula. Nota: Ripetizione di eventi grazie all'esclusiva integrazione può derivare da espansione clonale delle cellule che contengono tali integrazioni o contaminazione durante la PCR (che possa essere testata utilizzando reazioni di controllo negativo, ulteriormente dettagliate nei risultati rappresentativi qui di seguito). Ripetute integrazioni in specifiche sequenze cellulari sono tenuti a visualizzare diversi siti terminali di HBV per ogni evento di integrazione, come vie di fine-unirsi non-omologo sono usate15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la frequenza di integrazione moltiplicando il fattore di diluizione di invertito modelli del DNA per il numero di giunzioni di virus-cellula rilevato che il fattore di diluizione, seguita da normalizzazione alla quantità di input di DNA totale nella reazione di inversione. In generale, la frequenza di integrazione è dell'ordine di 01:104 celle.</li>
</ol>

S.U. è un co-richiedente e co-inventore di brevetti Myrcludex B come inibitore di voce HBV/HDV. T.T. non dichiara conflitti di interesse.

Prima di eseguire il protocollo, è importante notare che questo test di invPCR è una tecnica altamente sensibile, in grado di amplificare le singole copie del modello di DNA. Pertanto, limitare la contaminazione da prodotti di PCR è della massima importanza. Le strategie generali per limitare la contaminazione del prodotto PCR sono i seguenti. (i) stabilire aree fisicamente separate per i diversi passaggi del metodo. Ogni zona dovrebbe avere separato camici e guanti devono essere modificati quando si spostano tra queste aree. Abbiamo elencato queste zone di sotto in ordine dal più al meno probabile essere contaminato: PCR estrazione e sequenziamento reazione set-up area del prodotto (post-PCR); Aggiunta del modello PCR e fiammeggiato poli trasferimento zona (abbiamo usato Cappe PCR con una lampada UV decontaminante con buoni risultati); Zona di estrazione e inversione di DNA (pre-PCR); e una zona di "DNA template-free" utilizzato esclusivamente per la preparazione di magazzino e soluzioni PCR. (ii) essere consapevoli del flusso d'aria in laboratorio come un driver potenziale di contaminazione incrociata. In particolare, la contaminazione incrociata di reazioni di PCR durante la fase di trasferimento del pin fiammato è più probabilità di verificarsi e sarà portare a inesatta quantificazione della frequenza di integrazione. Cappe PCR possono essere utilizzati per limitare queste Croce-correnti. Pozzetti di controllo negativo (ad es., Myrcludex B-trattati campioni o senza controlli di modello) nella PCR possono essere utilizzati anche per verificare la contaminazione incrociata. (iii) limitare potenziali contaminanti PCR sulle pipette e superfici di lavoro pulendo regolarmente li con una soluzione di degradazione del DNA.
Il protocollo specificato qui è predisposto per rilevare l'integrazione di un clone HBV infettivo noto generato da HepAD38 cella linea42. Se l'inoculo utilizzato è di una diversa sequenza di DNA di HBV (ad es., da siero del paziente), quindi il genoma HBV dovrebbe essere prima sequenziato per confermare la compatibilità degli iniettori di PCR e inversione design. In studi precedentemente pubblicati19, abbiamo usato 3 set di primer che legano sequenze di DNA di HBV conservate che fiancheggiano il sito previsto delle giunzioni di integrazione di HBV DNA. Altre sequenze dell'iniettore e protocolli sono stati descritti per determinare la sequenza genomic di HBV44,45,46,47,48 e funzionino correttamente.
Inoltre, diverse cellule HBV-sensibili (ad es., cellule HepG2-NTCP di epatociti umani primari, HepaRG differenziato,) possono essere utilizzate; Tuttavia, abbiamo trovato che le cellule Huh7-NTCP forniscono il rapporto segnale-rumore più grande, quando si considera il numero di virus-cellula giunzioni di DNA che sono amplificate rispetto al virus DNA intermedio che è amplificato13. In particolare, cellule terminalmente differenziate come epatociti umani primari o HepaRG differenziato non efficientemente subiscono la mitosi, conseguente a un alto livello di prodotti intermedi replicativi HBV DNA amplificabile rimanendo all'interno delle cellule. Abbiamo trovato che ~ 90% di sequenze amplificate rappresentano la riorganizzazioni del DNA di HBV (e non integrazione eventi) in cellule terminalmente differenziate, rispetto al 70 – 50% delle cellule del tumore epatico linee13. Questi prodotti sono generalmente genoma HBV DNA contenente grandi omissioni nella superficie e nucleo open reading frame, o possono rappresentare quasi-specie HBV con un ulteriore NcoI sito prima del SphI sito. L'amplificazione di queste specie HBV (tra cui un diagramma schematico) sono stati descritti in dettaglio in precedenza13.
Ci sono parecchi svantaggi a questo metodo. A causa della natura laboriosa e multi-giorno del presente protocollo, invPCR non è adatto per analisi di alto-rendimento di un gran numero di campioni. Inoltre, poiché si basa sulla limitazione della titolazione di diluizione, il nostro metodo non è molto preciso nella quantificazione; anche se, dovrebbero misurare facilmente modifiche a livello di registro nella frequenza di integrazione.
Inoltre, il nostro protocollo di inversione è adatto solo per rilevare le integrazioni che si verificano tra la regione di DR2 e DR1 del genoma HBV, come la maggior parte delle integrazioni di HBV si verifica all'interno di questa regione49. NGS analisi dei tessuti paziente HBV che ha mostrato una grande minoranza (fino a ~ 50%) può verificarsi anche di fuori di questa regione49. Nuovi disegni di invPCR sono teoricamente in grado di rilevare questi altri siti di integrazione, se non (a nostra conoscenza) sono state effettuate ancora. Tale proposito, a causa dei siti necessari degli enzimi di limitazione necessari a valle dalla sequenza di giunzione di virus-cellula per la reazione di inversione, invPCR non rileva tutte le integrazioni che si verificano all'interno delle regioni DR2 e DR1 del genoma HBV (vale a dire, abbiamo hanno stimato che ~ 10% di tutte le integrazioni sono rilevabili utilizzando in silico simulazioni13). Tuttavia, quando applicato a un lotto mirato di campioni con un piccolo numero di trattamenti diversi, invPCR è uno dei metodi per la rilevazione del DNA di HBV integrato presso una sola risoluzione di base-accoppiamenti solo pratici.
Immaginiamo quindi le applicazioni di questo metodo che serve un ruolo chiave nella ricerca virale (tramite mutazioni dell'inoculo HBV), cellulare (tramite KO o sovraespressione di geni cellulari specifici, o attraverso l'applicazione di varie droghe) e ambientale ( ad esempio, l'esposizione allo stress ossidativo) fattori che inducono la integrazione di HBV DNA. Con questo metodo e il recente sviluppati sistemi di infezione di HBV, consentiamo un controllo senza precedenti di questi fattori, così che possano essere ben isolato e meglio caratterizzato. Ci aspettiamo inoltre che questo porterà ad una comprensione fondamentale delle conseguenze dell'integrazione dell'HBV DNA, compreso ciò che gli antigeni virali di misura (ad es., HBx o HBsAg50) sono espressi dal modulo integrato, quello che controlla questa espressione, cellulare e se o non integrazione HBV cambia in modo significativo il fenotipo cellulare verso uno stato più pro-oncogeno. I risultati di questi studi futuri avranno un profondo impatto sulle strategie terapeutiche utilizzate per il trattamento di epatite cronica B e la comprensione di base del virus stesso.

HBV è un virus a DNA double-stranded che possono causare l'infezione cronica per tutta la vita, portando a cirrosi epatica ed epatocellulare carcinoma (HCC)1,2,3. Mentre ci sono meccanismi molecolari multipli Guida HBV persistenza4 (ad es., alta stabilità del modello trascrizionale epigenetico virale), l'evasione di sorveglianza immunitaria e basso fatturato di epatociti nel fegato e suoi associati rischio di HCC iniziazione5,6 (ad es., l'infiammazione cronica e l'attivazione di cellulare vie di sforzo), integrazione di HBV DNA nel genoma della cellula ospite (un meccanismo segnalato per entrambi questi fenomeni) è stato scarsamente studiato . Delle ragioni principali è la mancanza di idonei in vitro infezione sistemi per HBV che consentono il rilevamento affidabile degli eventi di integrazione. Qui, descriviamo un protocollo recentemente sviluppato per il rilevamento delle integrazioni di HBV DNA che può essere utilizzato per delucidare i meccanismi molecolari e le relative conseguenze e generazione in vitro .
Replicazione dell'HBV e la formazione di integrazione del DNA di HBV è stata valutata in precedenza nel dettaglio7. Brevemente, HBV entra in epatociti utilizzando il Peptide Co-transporting Taurocholate del sodio (NTCP) come il principale recettore cellulare per infezione8,9. I nucleocapsids di HBV che contengono il DNA circolare HBV-rilassato (rcDNA) genoma entra nel nucleo, dove la rcDNA è convertito in DNA circolare covalentemente chiuso episomal (cccDNA). Il nucleare cccDNA agisce come il modello trascrizionale per mRNA virale e pre-genomic RNA (pgRNA)10. HBV polimerasi e pgRNA vengono quindi assemblate in neonata nucleocapsids (composto di dimeri di proteina core HBV). PgRNA HBV è retrotrascritto entro il nucleocapside, risultante in un genoma di rcDNA o un doppio filamento lineare DNA (dslDNA) genoma11,12. Questi nucleocapsids maturo contenenti genomi di HBV DNA sono infine avvolto ed esportati come virioni.
Infezione di epatociti da avvolte particelle contenenti molecole di dslDNA può provocare integrazione virale nella host cella genoma13, portando a forme di replica-incompetente di HBV DNA7,14,15. Integrazione di HBV DNA si verifica presso il sito di cromosomiche double-stranded del DNA si rompe15. Raccogliendo la prova suggerisce che ogni evento di integrazione si verifica in una posizione essenzialmente casuale all'interno di host cella genoma16,17. Inoltre, integrazione di HBV DNA si verifica piuttosto raramente, ad un tasso di 1 per 104 cellule13,18,19,20. Importanti questioni relative all'integrazione dell'HBV DNA rimangono senza risposta, specialmente per quanto riguarda l'esatte vie molecolari coinvolte, la dipendenza da virali e fattori dell'ospite, gli antigeni virali espressi da forme integrate e il loro possibile contributo a persistenza virale7. Abbiamo istituito un modello in vitro di far luce su alcune di queste domande.
La rarità di eventi di integrazione dell'HBV DNA (sia rispetto al tasso di integrazione per la cellula e il numero di copia di ogni integrazione unica) in vitro l'infezione da HBV modelli rendono loro difficile da rilevare. Mitosi delle cellule sono limitata nel nostro sistema in vitro , come la divisione delle cellule non supportano efficiente infezione. Così, a differenza nei tessuti del fegato pazienti dove significativa espansione clonale degli epatociti si verifica18,19,20, molto che pochi (1-2) copie di ogni integrazione sono presenti in un determinato pool di cellule infettate in vitro . Abbiamo anche trovato che integrazione si verifica principalmente durante l' infezione iniziale degli epatociti (e non continuamente negli epatociti infettati cronicamente)13. Di conseguenza, integrazione di HBV DNA non può essere aumentato da semplicemente coltura delle cellule per un periodo più lungo.
In generale, metodi precedentemente utilizzati per rilevare il DNA di HBV integrato, tra cui Southern blot ibridazione21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , cassette-mediato legatura PCR28e tutto il sequenziamento del genoma29,30,31,32,33, non hanno la sensibilità per rilevare singolo-copie delle integrazioni. Noi e altri ricercatori abbiamo usato inverso nested PCR (invPCR) per rilevare l'integrazione del DNA hepadnaviral in anatra, marmotta e fegati umani infetti13,14,18,19, 34,35,36. Altri hanno introdotto modifiche procedurali alla tecnica invPCR che possono alterare la generazione di segnali di falsi positivi e limitare la possibilità per quantificazione37. Se la prova è effettuata come descritto in questo protocollo, invPCR rappresenta un saggio specifico e sensibile che identifica e quantifica (in numeri assoluti copia) più integrazioni di HBV DNA. La giunzione del DNA di HBV-cella è sequenziale ad una risoluzione di coppia singolo-base, permettendo bioinformatical studi di virale e sequenze di DNA ospite presso i siti di integrazione13.
Precedentemente abbiamo descritto38 risultati da invPCR sul tessuto del DNA di HBV-infettati Estratto da una vasta gamma di fonti, tra cui tessuti del fegato snap-congelato, paraffina sezioni del fegato e campioni di tessuto estremamente piccolo isolati da microdissezione laser19. Questo protocollo delinea una versione aggiornata di un saggio di invPCR usando il DNA Estratto da tessuti di cultura-derivato delle cellule dopo l'infezione in vitro , in cui vengono generati i numeri di copia basso delle integrazioni (1 – 2 copie per integrazione). L'HBV DNA integrazioni formate in vitro assomigliano a quelli trovati in tessuti paziente rispetto alla loro distribuzione sul genoma cellulare e giunzione all'interno della sequenza virale che è integrato13,16, suggerendo un percorso paragonabile all'interno di un fegato infetto.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Inattivare a caldo prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina, 10.000 U/mL; Streptomicina 10mg/ml, 100&volte;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, 200 mM</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,5 mg/mL; EDTA, 0,22 mg/mL, 1&volte;</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td>Stock al 40% p/v in 1xPBS, autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMSO per spettroscopia</td><td>Merck</td><td>102950</td><td></td></tr><tr><td>Tenofovir disoproxil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS021622</td><td>Dissolvenza in DMSO</td></tr><tr><td>Lamivudina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1295</td><td>Dissolvenza in DMSO</td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit di tessuto</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.250</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000<</td><td></td></tr><tr><td>em>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>433209</tr><tr><td>destrano (35-45 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1662-10G</td><td></td></tr><tr><td>etanolo assoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>BsiHKAI</td><td>NEB</td><td>R0570L</td><td></td></tr><tr><td>SphI-HF</td><td>NEB</td><td>R3182L</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold Taq kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331816</td><td>Utilizzare per primo nest PCR</td></tr><tr><td>Tappetini di tenuta in silicone per piastre PCR a 96 pozzetti Biorad</td><td></td><td>2239442</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR Soluzione di degradazione del DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6509 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Replicatore a 96 pin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi PCR</td><td>Kit Promega</td><td>M8295</td><td>Utilizzare per la PCR del secondo nido, utilizzare un tampone verde per un facile caricamento del gel di agarosio</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarosio</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAEX II</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di copia basso numero di dna virale integrato formato da in vitro l'infezione di epatite b

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Virus di epatite B (HBV) è un comune ematica patogeno che causa il cancro del fegato e cirrosi epatica derivando dall'infezione cronica. Il virus si replica in genere attraverso un DNA episomal intermedio; Tuttavia, l'integrazione dei frammenti di HBV DNA nel genoma ospite è stato osservato, anche se questa forma non è necessaria per la replicazione virale. L'esatto scopo, tempismo e meccanismi da cui HBV DNA integrazione si verifica non è ancora chiari, ma recenti dati indicano che si verifica molto presto dopo l'infezione. Qui, la generazione in vitro e l'individuazione delle integrazioni di HBV DNA sono descritti dettagliatamente. Il nostro protocollo specificamente amplifica singole copie di integrazioni di DNA del virus-cellula e consente sia la quantificazione assoluta e risoluzione di coppia singolo-base della sequenza di giunzione. Questa tecnica è stata applicata a vari tipi di cellule HBV-sensibili (tra cui epatociti umani primari), a vari mutanti HBV e in collaborazione con varie esposizioni della droga. Prevediamo che questa tecnica diventando un test chiave per determinare i meccanismi molecolari di questo fenomeno clinicamente rilevante.

Una rappresentazione schematica della tecnica invPCR è illustrata nella Figura 1. Un'elettroforesi su gel di agarosio di esempio di un invPCR successo è illustrato nella Figura 2 , prima e dopo l'isolamento del prodotto PCR. La figura 3 Mostra l'output di analisi BLAST dal passaggio 5.1 nei casi di (i) amplificazione della giunzione di DNA del virus-cellula e (ii) l'amplificazione di un intermedio replicativo di HBV DNA.
Risultati da controlli positivi attesi: cellule Huh7-NTCP infettate con ceppi HBV eparina-purificato come descritto in precedenza (Figura 1) possono servire come controllo positivo. In questo caso, solo prodotti di PCR dovrebbero essere raggiunto mediante la diluizione di secondo o terzo 1:3 di ciascun campione (corrispondenti a equivalenti di cella4 ~ 10 per diluizione, Figura 2). A queste diluizioni, circa il 50% dei prodotti rappresenterà giunzioni di DNA vero virus-cellula, mentre l'altra metà rappresenta l'amplificazione di intermedi di HBV DNA (Figura 3).
In precedenti studi13, abbiamo trovato alcuni casi di giunzioni ripetute virus-cellula, non suggerendo nessun cellulari siti genomici di integrazione preferenziale di HBV DNA. Troviamo anche che &gt;80% di giunzioni virus-cellula si verificano tra nucleotidi 1732 e 1832 (secondo il nucleotide numerazione del genotipo HBV D, GenBank Accession n #U95551.1), dove quest'ultimo rappresenta il capolinea destro del modulo di dslDNA HBV. Sequenze di giunzioni vero virus-cellula trovate attraverso il nostro metodo in esperimenti in vitro sono pubblicamente disponibili su GenBank (numeri di adesione MH057851 a MH058006).
Risultati da controlli negativi attesi: non infetti le cellule Huh7-NTCP o inoculato Huh7-NTCP cellule pretrattate con Myrcludex B possono agire come controlli negativi. InvPCR analisi del DNA Estratto da queste cellule non dovrebbero produrre nessun prodotto PCR. L'esecuzione di questi campioni di controllo negativo nello stesso piatto di PCR come campioni positivi consente test di contaminazione durante il processo di PCR annidata. Il test più rigoroso per la contaminazione incrociata è l'esecuzione di un campione di controllo negativo in pozzi A-D e l'esempio positivo in pozzi E-H su una piastra a 96 pozzetti. In questo caso, la più alta concentrata diluizione del campione positivo viene eseguita in una riga direttamente adiacente alla diluizione meno concentrata del campione negativo. Se i prodotti di amplificazione sono osservati nei campioni di controllo negativo, istituire le misure suggerite nella discussione per ridurre al minimo gli eventi di contaminazione incrociata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Figura 1: figura schematica del processo di invPCR per rilevare integrazioni di HBV DNA. Dopo l'infezione da HBV, solo una minoranza delle cellule Huh7-NTCP contengono HBV dslDNA (rosso) integrato nel genoma della cellula ospite (rosso), raffigurata nella parte superiore. DNA totale è quindi estratto dalle cellule (passaggio 1), invertito (passaggio 2) e amplificato dalla PCR annidata (passaggio 3). Sono indicate le posizioni relative dei siti di restrizione enzimatica (Ncoio e BsiHKAI) nella giunzione del DNA asportato virus-cellula. La figura è adattata da una precedente pubblicazione13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Figura 2: agarosio gel elettroforesi ed estrazione del gel successivi di un successo invPCR. "M" rappresenta la scala di marcatore del DNA. Ogni riga di 12 rappresenta tecnico replica a una diluizione singola sulla piastra PCR. Due campioni di DNA invertiti possono essere eseguiti per gel di agarosio/piastra PCR. I prodotti di PCR per ogni diluizione dovrebbero titolo fuori in un ~ 1: rapporto 3. Estrazione dei prodotti dalle due diluizioni meno concentrate dove singole bande possono essere facilmente isolati è in genere sufficiente, come tasso di integrazione dell'HBV DNA è determinata per titolazione a punto finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Figura 3: analisi di esplosione delle sequenze di prodotto di invPCR. Come lunghi tratti di sequenza vengono generati da Sanger sequenziamento, la fonte di sequenze di DNA è generalmente inequivocabili. Forte allineamento per HBV e genoma cellulare è osservata in diverse aree del FASTA sequenza file generato da Sanger sequenziamento sul pannello superiore, suggerendo una giunzione di DNA vero virus-cellula. Nel pannello inferiore, la sequenza viene allineato solo a frammenti del genoma HBV, suggerendo un prodotto generato dall'amplificazione di un genoma HBV DNA riarrangiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui descriviamo la generazione in vitro di HBV DNA tramite un sistema di infezione del virus dell'epatite B e la rivelazione altamente sensibile della sua integrazione (1 – 2 copie) usando inverso nested PCR.

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella virologia dell'epatite B, come trovare fattori cellulari o virologici che influenzano l'integrazione del DNA HPV. Ci sono molteplici vantaggi in questa tecnica. È relativamente economico, e facile da eseguire, l'analisi dei risultati è semplice, ed è molto sensibile, fino a singole copie.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sull'integrazione hbv, può anche essere utilizzato per altri virus che si integrano nel genoma della cellula ospite, come HIV, HTLV-1 o HPV. Per infettare le cellule, seminare 200.000 cellule per millilitro in una piastra di dodici pozzetto, con 1 millilitro di D-mem. Il giorno successivo, utilizzare la colonna di eparina purificata su-per-na-din da HEP-AD 38 come inoculante per infettare le cellule a 1.000 VGE per cella, in 500 microlitri di mezzo di coltura.Quindi, coltura le cellule a 37 gradi Celsius. Quindi, il giorno successivo, lavare le cellule due volte con un millilitro di sterile una volta PBS. Quindi, sostituire il mezzo di coltura ogni 2 giorni, fino alla raccolta.Al giorno 3 dopo l'infezione, trattare le cellule con 5 micromolare tenofovir disoproxil e 10 micromolare Lamivudine per limitare la produzione di intermedi replicativi HBV amplificati dalla PCR inversa. Al giorno 5, dopo l'infezione, tripinare alcune cellule con 200 microlitri di Tripsiderina EDTA e sospenderle in 2 millilitri di D-mem contenenti 5 micromolare Tenofovir disoproxil e 10 micromolare Lamivudine. Successivamente, trasferire le sospensioni cellulari su una piastra a sei pozza, per indurre un ciclo di mitosi.Al giorno 7 dopo l'infezione, tripinare le cellule espanse in 400 microlitri di Trypsin EDTA e sospendere la miscela in 1 millilitro di D-mem. Quindi, trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri. Pellet le cellule per centrifugazione a 500 volte G, per cinque minuti.E rimuovere il Su-per-na-din per aspirazione. Estrarre il DNA dal pellet cellulare utilizzando un kit di estrazione del DNA, secondo le istruzioni del produttore. Per l'inversione del DNA, allocare da 1,5 a 2,5 microgrammi dell'estratto totale di DNA in un tubo PCR da 200 microliter.Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di miscela principale enzimatica di restrizione per ottenere un volume di reazione di 40 microliter, contenente 1 volte il buffer di reazione di digestione e 10 unità NCO-1HF. Incubare la reazione enzimatica di restrizione in una macchina PCR a 37 gradi Celsius per un'ora, per un'efficienza di digestione ottimale. Quindi, inattivare l'enzima di restrizione incubandolo di 80 gradi Celsius per 20 minuti.Trasferire l'intera reazione enzimatica di restrizione in un tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di tampone di ligasi del DNA 1 volte T4 e 500 unità di ligasi del DNA T4 e mescolare accuratamente. Un grande volume di reazione incoraggia la legatura intramolecolare dei frammenti di DNA digeriti.Incubare la reazione di legatura a temperatura ambiente per 2 ore per garantire la legatura completa. Dopo 2 ore, inattivare la ligasi del DNA T4 a 70 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, aggiungere 10 microlitri di 10 solfato di dodecil di sodio per garantire la completa inattivazione della ligasi T4.Aggiungere cloruro di sodio a una concentrazione finale di 100 millimolare e Dextran a una concentrazione finale di 90 microgrammi per millilitro. Mescolare con il vortice di impulsi e ruotare brevemente verso il basso il mix di reazione. Quindi, aggiungere 900 microlitri di 100 etanolo e mescolare per inversione.Precipitare il DNA a -20 gradi Celsius durante la notte. E pellettò il DNA precipitato per centrifugazione a 14000 volte G per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il Su-per-na-dine per aspirazione.Lavare il pellet con 500 microlitri da 70 etanolo. E centrifugazione a 14000 volte G per 15 minuti. Quindi, rimuovere l'etanolo per aspirazione e asciugare all'aria il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20 minuti.Sciogliere il pellet in 20 microlitri di acqua e aggiungere 20 microlitri di miscela di master enzimatico limitante per ottenere un volume di reazione di 40 microlitri, contenente 1 volte il buffer di reazione di digestione, 5 unità BSIHK-1 e 5 unità di SPH-1HF. Nidificare, incubare la reazione enzimatica di restrizione in un blocco di calore a 37 gradi Celsius, per 1 ora. Spingi brevemente verso il basso la miscela di reazione, incuba la reazione enzimatica di restrizione in un blocco di calore a 65 gradi Celsius per 1 ora.In questa procedura, rimuovere potenziali ampliconi da una guarnizione del tappetino di silicio riutilizzabile, utilizzando una soluzione di degradazione del DNA. Risciacquare accuratamente il tappetino con acqua priva di DNA e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente. Successivamente, preparare un millilitro di 1 miscela PCR contenente i primer esterni avanti e indietro ad una concentrazione di 0,5 micromolare.Aggiungere 170 microlitri se il 1 per PCR si mescola ai pozzi A-1 ed E-1, in una piastra PCR da 96 porri. Quindi, aggiungere 120 microlitri del mix 1 volte PCR ai pozzi B-1 e H-1. Successivamente, aggiungere 10 microlitri del DNA invertito ai pozzi A-1 ed E-1.Mescolare la reazione in ogni pozzo, tubazionando delicatamente ciascuno, circa 10 volte utilizzando un P-1000 impostato su 100 microlitri. Diluire serialmente i campioni dai pozzi A-1 a D-1, con un rapporto di 1:3 trasferendo 60 microlitri ad ogni passo. Mescolare i pozzi ad ogni passo tubazionandoli delicatamente circa 10 volte utilizzando un P-1000 impostato su 100 microlitri.Evitare di formare bolle, ripetere la procedura per il pozzo E-1, diluendo fino al pozzo H-1. Successivamente, allocare 10 microlitri della miscela di reazione, utilizzando pipetta multicanale, da Wells A-1, H-1, in pozzi A-2, H2, A-3, H-3 e così via, fino a raggiungere i pozzi A-12, H-12 della piastra del pozzo 96. Coprire la piastra PCR con un tappetino di silicio asciutto e premere con fermezza.Quindi, posizionare la piastra in una macchina PCR ed eseguire il programma indicato, prima di trasferire la piastra a temperatura ambiente. Successivamente, riscaldare i perni di un replicatore a 96 pin a ro-caldo con un bruciatore Bunsen, quindi raffreddare per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Riempire i pozzali di una seconda piastra PCR con 10 microlitri da 1 volta la miscela PCR, contenente un tampone pronto per il carico di gel, e l'interno in avanti e indietro a 0,5 micromolare.Rimuovere con cura il tappetino di silicio dalla piastra PCR della piastra del pozzo 96 dalla PRIMA PCR rotonda ed evitare la contaminazione incrociata tra i pozzi. Utilizzare il replicatore raffreddato per trasferire i prodotti PCR della piastra del pozzo 96, dalla PCR del primo round, alla piastra del pozzo da 96 appena assegnata. Effettuare la PCR nidificata, utilizzando la condizione come indicato.Per isolare i prodotti PCR, analizzarli per elettroforesi gel, utilizzando una piastra da 96 porri, con gel di agarosio 1.3. Per un gel Agarose da 100 millilitri, correre a 200 volt per 10-15 minuti. Successivamente, asportare le bande di DNA dai gel di Agarosio, usando cannucce da bere usa e getta.Per ogni prodotto PCR, posizionare la spina di paglia e gel Agarose in un tubo da 1,5 millilitri, tagliare la paglia a misura con le forbici. Successivamente, espellere le spine di Agarosio in ogni tubo, spremendo all'estremità del frammento di paglia. Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone di estrazione del gel e 5 microlitri di perline di vetro per l'estrazione del gel a ciascun tubo.Estrarre i prodotti PCR per le istruzioni del produttore per il kit di estrazione del gel e diluire il DNA dalle perline con 30 microlitri di acqua. Invia il DNA purificato per il sequenziamento sanger, con il primer in avanti utilizzato nella PCR nidificata al secondo round. Un esempio di elettroforesi in gel di Agarosio di PCR inversa di successo, prima e dopo l'isolamento del prodotto PCR, è mostrato qui.M rappresenta il marcatore DNA quest'ultimo, ogni riga di 12 rappresenta le repliche tecniche ad una singola diluizione sulla piastra PCR. In questo caso, i singoli prodotti PCR dovrebbero essere ottenuti con la seconda o la terza diluizione 1:3 di ciascun campione. A queste diluizioni, circa il 50% dei prodotti rappresenterà vere e propria giunzione del DNA delle cellule virali.Mentre l'altra metà rappresenta l'amplificazione degli intermedi del DNA HBV. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di esplorare l'integrazione del DNA HPV in sistemi di infezione in vitro altamente controllati. Ulteriori metodi, come l'analisi biotematica, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande.Ad esempio, se l'integrazione del DNA HPV avviene in regioni specifiche del genoma cellulare. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite B, può essere pericoloso e controlli di infezione appropriati, come armadietti di sicurezza bio e vaccinazione preventiva, dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunologia e Infezioni

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