Micropuntura dello spazio di Bowman in topi nei paraggi 2 Photon microscopia
11 ottobre 2018
Vi presentiamo uso di microscopia di 2 fotoni per posizionare una micropipetta all'interno dello spazio urinario di Bowman in topi, che unisce 2 tecniche fondamentali della fisiologia renale. Uso di microscopia di 2 fotoni supera i limiti critici di microscopia convenzionale per micropuntura studi di fisiologia renale.
Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiologia del singolo nefrone, inclusi i tassi di filtrazione glomerulare delle proteine sistemiche e dei metaboliti e i loro contributi alla fisiologia tubolare. Il vantaggio principale di questa tecnica di micropuntura è che consente l'accesso allo spazio di Bowman e al nefrone corticale in tutti i topi. In genere, gli individui nuovi a questo metodo farebbero fatica perché richiede passaggi di preparazione eseguiti correttamente.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, applicare un unguento agli occhi e utilizzare il nastro adesivo per immobilizzare le estremità di un topo adulto da 20 a 25 grammi. Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere tutti i capelli sul lato sinistro dell'animale e utilizzare la milza per localizzare il rene sinistro attraverso la pelle sul lato dorsale e caudale della milza. Fai un'incisione di 0,5 centimetri nella pelle, seguita da una piccola incisione nel peritoneo abbastanza grande da far passare il rene.
Estrudere il rene con una leggera pressione e posizionare una forma stabilizzatore renale in polisiloxano attorno al tessuto. Allineare il rene con il distanziale in modo che la superficie più laterale del rene si estenda oltre lo stabilizzatore di circa un millimetro e fissare il rene alla forma con adesivo cianoacrilato. Incollare una piastra di testa alla forma stabilizzatore e montare la piastra della testa alle barre di montaggio sulla piastra di base.
Quindi, riempire il pozzo nel supporto in polisiloxano con una soluzione di agarosio dell'uno per cento e tenere un coperchio di 10 millimetri scivolare sopra la forma fino a quando l'agarosio è sodo. Sigillare il coperchio scivolare sulla piastra della testa con colla e creare un anello intorno al coperchio scivolare con cemento dentale. Quindi iniettare da 100 a 150 microlitri di FITC-Dextran retrò-orbitalmente e spostare rapidamente il mouse e la piastra di fissaggio allo stadio del microscopio a due fotoni.
Dopo aver focalizzato manualmente sulla superficie renale, passare alla modalità a due fotoni senza scansione ed esplorare la finestra di imaging per individuare un glomerulus bersaglio superiore a 30 micrometri sotto lo slittamento di copertura e a meno di 400 micrometri dalla capsula renale laterale. Registrare la distanza laterale e verticale dal glomerulus bersaglio. Quindi registrare le coordinate dello stadio x, y e z per il glomerulus.
E infine, sollevare il punto focale obiettivo di circa un millimetro nella colonna d'acqua senza modificare le coordinate dello stadio x e y. Guidare la punta della pipetta nella colonna d'acqua e attivare l'eccitazione DAPI. Spostate la pipetta nelle quote x e y fino al punto di fluorescenza massima della punta.
Questo sarà il centro dell'obiettivo. Modificate l'impostazione della citazione x in proteine fluorescenti rosse e visualizzate la pipetta con l'oculare per consentire una centratura precisa nella vista oculare. Torna a due fotoni per trovare la pipetta sotto la vista live a due fotoni e posizionare la punta esattamente al centro dell'immagine, questa è la posizione di registrazione.
Quindi salvare un'immagine della pipetta e registrare lo stage e le coordinate del controller della micropipetta. Rimuovere la pipetta dalla colonna d'acqua nell'asse x senza spostare l'asse y e z e spostare la pipetta z nella coordinata z glomerulus bersaglio e nel bordo del rene. Si noti lo stadio x e si calcola la pipetta del bordo renale x utilizzando l'offset dalla fase di registrazione x.
Aumentare lo stadio x per spostare lo stadio verso la pipetta fino a quando il bordo del rene è lontano a sinistra dello schermo, pur rimanendo visibile. Avanzare rapidamente la pipetta a circa 100 micrometri di distanza dalla pipetta X del bordo renale ha appena calcolato. Aumentare il guadagno rosso e iniziare ad avanzare lentamente la punta della pipetta verso il bordo renale sotto l'imaging a due fotoni vivo mentre si monitora l'istogramma dei pixel rossi.
Guidare lentamente la pipetta nell'asse x fino alla pipetta bersaglio glomerulus x, tenendo d'occhio lo stadio x. Una volta raggiunto il glomerulus, documentare la posizione con una pila z. Con la pipetta in posizione, impostare la micropompa per iniettare 100 nanolitri di perfluorodecalina in due minuti.
Per garantire la persistenza della pipetta e per ridurre la confusione dalla spina della pipetta durante l'ingresso. Dopo quattro o sei minuti di filtrazione, impostare la micropompa per aspirare fino a 300 nanolitri ad una velocità fino a 50 nanolitri al minuto. Questo bellissimo glomerulus vicino alla superficie dimostra immagini favorevoli a causa della posizione superficiale del glomerulus a 20 micrometri sotto la capsula renale.
Il glomerulus è troppo vicino alla superficie per la microiniezione, tuttavia, poiché la pipetta colpirebbe lo scivolo di copertura. Questi glomeruli sono posizionati in modo ottimale con i bordi laterali di 250 micrometri a destra e appaiono meno affilati a causa della rifrazione causata dalla loro profondità di 70 micrometri dalla capsula. Entrambi i fattori che rendono accessibili i glomeruli.
In questa tipica immagine di ingresso renale, una proiezione di intensità media da una pila z con viste ortogonali rivela la punta della pipetta all'interno dello spazio di Bowman, notare l'artefatto spettrale della punta della pipetta rossa dalla fluorescenza estremamente luminosa dei punti quantici disposti sulla sezione conica della punta. Qui, un rendering del volume da una pila z acquisito dopo aver posizionato una pipetta nello spazio di Bowman, mostra la punta della pipetta all'interno dello spazio che confina con il ciuffo capillare. Se viene utilizzata una pipetta con un'apertura troppo grande, la capsula renale può rompersi causando sanguinamento subcapsulare e ingresso del sangue nel lume della pipetta.
Utilizzando questo metodo, 17 proteine, principalmente a basso peso molecolare, sono state identificate da un minimo di due peptidi unici per proteina. Insieme a questo metodo, altri metodi come la maspectroscopia, le misurazioni degli elettrodi sensibili agli ioni e l'iniezione di anticorpi fluorescenti possono essere utilizzati per rispondere a domande sul ruolo dei soluti luminali nella fisiologia tubolare e glomerulare.
Panoramica
Questo studio analizza la fisiologia del singolo nefrone utilizzando una tecnica unica di microscopia a due fotoni per accedere allo spazio di Bowman nei topi. I risultati dimostrano il potenziale di questo approccio nel misurare i tassi di filtrazione glomerulare di proteine e metaboliti, offrendo spunti sulla fisiologia tubulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Fisiologia del singolo nefrone
- Fisiologia renale
- Filtrazione glomerulare
Sfondo
- Comprendere la funzione renale a livello di singolo nefrone è fondamentale per la ricerca fisiologica.
- La microscopia tradizionale presenta limitazioni nelle tecniche di micropuntura.
- La microscopia a 2 fotoni offre capacità di imaging migliorate.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di micropuntura con microscopia a due fotoni
- Sistema modello murino
- Immagini di fluorescenza con FITC-Destrano e DAPI
Risultati principali
- La tecnica consente la misurazione dei tassi di filtrazione glomerulare in tempo reale.
- Ha ridotto problemi comuni come l'ostruzione della pipetta durante l'inserimento.
- Sono state identificate 17 proteine dal fluido di trabocco campionato.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la capacità di studiare la fisiologia renale in animali vivi.
- Apre nuove prospettive per ulteriori ricerche sul ruolo dei soluti nella funzione renale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica consente un accesso diretto allo spazio di Bowman nei topi, superando i limiti della micropuntura convenzionale e dell'immagine a due fotoni, permettendo interventi e misurazioni a livello di singolo nefrone. Supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella ricerca sulla fisiologia renale fornendo un'analisi quantitativa dell'aspirato dal filtrato glomerulare. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici consentendo misurazioni in tempo reale di pressione, carica, flusso e composizione molecolare all'interno del nefrone.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle velocità di filtrazione glomerulare di proteine e metaboliti sistemici per convalidare bersagli terapeutici.
- Valore operativo: Permette l'accesso allo spazio di Bowman e al nefrone corticale in tutti i topi, favorendo studi riproducibili sull'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per saggi successivi, consentendo il recupero del filtrato dallo spazio di Bowman e dai segmenti del nefrone.
- Valore operativo: Supporta la standardizzazione dei saggi mediante letture quantitative di cromatografia liquida/spettrometria di massa delle proteine e dei metaboliti aspirati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette lo studio di sistemi rilevanti per le malattie misurando il ruolo dei soluti luminari nella fisiologia tubulare e glomerulare.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo un accesso ripetuto alla fisiologia del singolo nefrone in animali vivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio alla ricerca preclinica, fornendo un accesso diretto al nefrone per studi meccanicistici e letture allineate ai biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la micropuntura dello spazio di Bowman per valutare i processi di filtrazione e riassorbimento.
- Screening: Migliora la prontezza e la riproducibilità dei saggi grazie alla guida stereotassica e alla visualizzazione della pipetta rivestita con punti quantici per un targeting preciso del glomerulo.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di pressione, carica, flusso e composizione molecolare (ad esempio, 17 proteine a basso peso molecolare tramite LC/MS) per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo studi longitudinali sulla gestione dei soluti in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'indagine della fisiologia renale in diversi progetti grazie alla sua adattabilità a vari tipi di lettura (elettrodi sensibili agli ioni, anticorpi fluorescenti, spettrometria di massa).
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella fisiologia del singolo nefrone attraverso l'analisi diretta dell'aspirato.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie alla stabilizzazione stereotassica del rene e alla navigazione della pipetta guidata da immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati precoci a livello del nefrone sui processi di filtrazione di proteine e metaboliti, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei bersagli renali basata su dati quantitativi sul flusso e sulla composizione ottenuti dallo spazio di Bowman.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia renale, microscopia a due fotoni e manipolazione di micropipette.
- Richiede un microscopio a due fotoni, micropipette rivestite con punti quantici, un apparato stereotassico e sistemi di stabilizzazione con agarosio.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la preparazione chirurgica, i parametri di acquisizione delle immagini e i protocolli di raccolta degli aspirati.
- Comporta la necessità di adattamenti per diverse linee di topi e modelli di malattia che influenzano la profondità e l'accessibilità dei glomeruli.
- È limitato dalla profondità di imaging (~100 μm sotto la capsula) e dal potenziale trauma vascolare causato dall'inserimento della pipetta, che può provocare sanguinamento subcapsulare se non gestito con attenzione.
