Un modello di coltura del tessuto della produzione di estrogeno primario bovina Granulosa Cells

Questo modello di coltura cellulare ci consente di studiare in vitro le caratteristiche delle cellule della granulosa bovina produttrici di estradiolo, come i fattori o le condizioni della tiroide. Il vantaggio principale di questo protocollo è la tecnica di crioconservazione che fa funzionare la coltura cellulare indipendentemente dall'alimentazione diretta del tessuto. La procedura sarà dimostrata da Veronica Schreiter, un tecnico del mio laboratorio.

Prima di iniziare la procedura di isolamento cellulare, lavare le ovaie bovine con antibiotico integrato con 1X PBS in un becher per rimuovere il sangue dalla superficie. Scartare il PBS e ripetere il lavaggio tre o quattro volte fino a quando le ovaie non sono pulite dal sangue residuo. Usa una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo al 70% per pulire un'ovaia.

Utilizzare una siringa da tre millilitri con un ago calibro 18 per perforare follicoli di piccole e medie dimensioni. E poi aspirare il liquido follicolare che contiene le cellule della granulosa. Trasferire il liquido follicolare in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Dopo aver perforato diversi follicoli, utilizzare un PBS 1X per sciacquare la siringa e l'ago per una pulizia intermedia per evitare che l'ago si blocchi con le cellule. Ripetere con la perforazione e l'aspirazione dei follicoli per ottenere il maggior numero possibile di cellule con il liquido follicolare. Per mettere da parte un numero appropriato di GC appena isolati come campioni di riferimento per l'analisi di RNA, DNA e proteine, posizionare diverse aliquote delle cellule di riferimento in provette fresche da 1,5 millilitri.

Centrifugare per un minuto a 12.000 volte G a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e liberare i pellet in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare la crioconservazione, pellettare delicatamente i GC centrifugandoli a 500 volte G a temperatura ambiente per tre minuti.

Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare nel siero di vitello fetale al 100%, o FCS, per rimuovere tutti i grumi visibili. Quindi aggiungere un volume del mezzo di congelamento precedentemente preparato, mescolare delicatamente e trasferire la miscela in una fiala criogenica. Posizionare la fiala in un contenitore di congelamento specializzato che impedisca il congelamento rapido, in modo che la velocità di raffreddamento non superi meno un grado Celsius al minuto.

Quindi congelare il contenitore a meno 80 gradi Celsius per un minimo di quattro ore. Scongelare rapidamente le cellule nella fiala criogenica in un bagno d'acqua a 37 gradi per tre o quattro minuti e trasferire la sospensione cellulare in Alpha MEM preriscaldata a 37 gradi senza supplemento ormonale per ottenere un volume finale di 10 millilitri. Centrifugare le celle a 500 volte G a temperatura ambiente per tre minuti.

Scartare il surnatante e aggiungere l'Alpha MEM integrato preriscaldato al pellet cellulare e risospendere con cura. Seminare i GC in una piastra da 24 pozzetti in un volume finale di 500 microlitri per pozzetto, assicurandosi di includere repliche di almeno tre pozzetti per condizione. Infine, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e con il 5% di CO2 per otto giorni, quindi procedere con l'analisi cellulare.

Dopo aver coltivato i GC a una densità normale di una volta per 10 fino alla quinta cellula per pozzetto, le cellule hanno mostrato un fenotipo simile a quello dei fibroblasti tipico dei GC. Le cellule coltivate ad alta densità di placcatura di una volta 10 alla sesta non hanno cambiato la loro morfologia, ma hanno formato grandi gruppi cellulari più frequentemente. Dopo aver coltivato le cellule a una densità di una volta 10 al quinto, l'espressione genica di diversi trascritti di marcatori valutati non ha rivelato alcuna differenza tra le cellule coltivate con o senza crioconservazione iniziale.

Quando i GC sono stati coltivati ad alta densità cellulare, la concentrazione di estradiolo è diminuita in modo significativo, mentre la concentrazione di progesterone è aumentata rispetto alle cellule cresciute a densità normale. I GC bovini coltivati in condizioni di assenza di siero per otto giorni hanno rivelato una differenza significativa nella regolazione di diversi geni marcatori selezionati in colture ad alta densità rispetto a quelle normali, misurata con QPCR. Durante l'utilizzo di questo modello di coltura cellulare di cellule della granulosa bovina produttrici di estradiolo, è importante ricordare i fattori che hanno influenzato la fisiologia cellulare, come la densità cellulare.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri protocolli di trattamento per rispondere a domande quali molecole o vie di segnalazione sono coinvolte nella differenziazione delle cellule della granulosa bovina. La tecnica di crioconservazione ha aperto la strada a un lavoro di coltura cellulare più strutturato e organizzato e potrebbe essere facilmente trasferita ad altre specie.