Name: Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Scopri la sintesi di nanoparticelle lipidiche-polimeriche coniugate con plCSA-BP per il targeting di tumori e trofoblasti placentari. Questo metodo semplice e riproducibile migliora la somministrazione mirata di farmaci.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da nazionali chiave della ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1000402), la Fondazione nazionale di scienze naturali (81571445 e 81771617) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Guangdong (2016A030313178) per Il fondo di ricerca di Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) a X.F. e X.F.

1. preparazione delle soluzioni madri
<ol><li>Preparare una soluzione acquosa di etanolo al 4% diluendo 4 mL di etanolo assoluto con 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione a 4 ° C. Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza contaminanti come batteri, particelle, ioni o nucleasi. Acqua ultrapura è stata ottenuta da un sistema di purificazione dell'acqua con una resistività di destinazione di mΩ·cm fino a 18,2, che significa bassa contaminazione anionici.</li>
	<li>Preparare un 1 mg/mL di soluzione madre di lecitina di soia sciogliendo 20 mg di lecitina di soia in 20 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione stock di lecitina di soia a 4 ° C.</li>
	<li>Preparate un 25 mg/mL soluzione di riserva (2000)-COOH DSPE-PEG sciogliendo 100mg di DSPE-PEG-COOH in 4 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.</li>
	<li>Preparate un 10 mg/mL soluzione di riserva di DOX sciogliendo 50 mg di DOX in 5 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva di DOX a 4 ° C al buio.</li>
	<li>Preparate un 2 mg/mL soluzione di riserva di PLGA sciogliendo 20 mg di PLGA in 10 mL di acetonitrile. Conservare la soluzione stock di PLGA a 4 ° C. Attenzione: Acetonitrile è infiammabile e tossico. Operare con cura in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi personali, quali camici, occhiali di sicurezza e guanti in lattice.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acido (MES, pH 6.0) sciogliendo 2,17 g di MES in 100 mL di acqua ultrapura. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.</li>
</ol>2. sintesi di DNPs
Nota: Per evitare la degradazione fotochimica DOX, tutte le operazioni sono state eseguite nel buio. Le nanoparticelle sono state sintetizzate da un precedentemente segnalati passo singolo sonicazione metodo11,13,14.
<ol><li>Aggiungere 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4% in una provetta sterile da 10 mL. Quindi, aggiungere 90 µ g della soluzione madre di lecitina di soia, 210 µ g di soluzione di riserva DSPE-PEG-COOH e 750 µ g di soluzione di riserva DOX a 3 mL di soluzione acquosa di etanolo al 4%.</li>
	<li>Inserire la provetta da centrifuga in un bagno di ghiaccio e posizionare il bagno di ghiaccio su un processore ad ultrasuoni.</li>
	<li>Con una siringa da 1 mL, pipettare 2 mg di soluzione di riserva di PLGA goccia a goccia (1 goccia/4-6 s) nella provetta della centrifuga. Nel frattempo, Sonicare tubo usando un processore ad ultrasuoni ad una frequenza di 20 kHz e un'ampiezza di uscita di 30% per 5 min per sintetizzare il DNPs. Nota: Per sintetizzare particelle uniformi con piccole dimensioni, la velocità alla quale la soluzione PLGA è gocciolata nella provetta deve essere lento, e generazione di bolla dovrebbe essere evitato.</li>
	<li>Purificare il DNPs lavando la soluzione di cui sopra in tampone MES 0.1 M (pH 6.0) 3 volte usando un filtro di centrifuga (MWCO, 10 kDa). Centrifuga a 4 ° C e 1000 × g per 3 minuti ogni volta. Infine, dovrebbero rimanere circa 1 mL di nanoparticelle MES-risolto. Nota: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Se non utilizzato per coniugare peptidi, le nanoparticelle possono essere purificate da tampone PBS (pH 7,4), e il DNPs purificata possono essere memorizzati a 4° C al buio.</li>
</ol>3. coniugazione di peptidi a DNPs
<ol><li>
Attivazione dell'estere
	<ol>
<li>Aggiungere 0,4 mg di EDC (concentrazione finale di 2 mM) a 1 mL di DNPs.</li>
		<li>Aggiungere 0,24 mg di NHS alla reazione (concentrazione finale di 2 mM). Nota: Per aggiungere facilmente la corretta quantità di EDC e NHS, una soluzione di riserva può essere preparata se i reagenti sono dissolti e utilizzati immediatamente.</li>
		<li>Mescolare bene i componenti di reazione e posizionare la reazione su un agitatore; permettono di reazione per 30 min - 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reazione di ammina
	<ol>
<li>Aumentare il tampone a pH 7.2-7.5 utilizzando PBS (20 ×, pH 7.4).</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di reazione 0,5 mg del peptide plCSA-targeting (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC). Nota: Prima dell'addizione, sciogliere i peptidi in 20% acetonitrile. Se peptidi non sono solubili, sonicazione in un sonicatore vasca può utili.</li>
		<li>Mescolare bene la soluzione e poi posto su un agitatore; consentire la reazione di procedere a 4 ° C durante la notte nel buio.</li>
		<li>Posizionare la soluzione di coniugato in sacchetti di dialisi (MWCO, Da 3.500) a Dializzare e purificare il plCSA-DNPs utilizzando il tampone PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente per 24 h al buio. Nota: In alternativa, purificazione potrebbe essere eseguita come descritto al punto 2.4 per ottenere plCSA-DNPs.</li>
		<li>Per applicazioni della coltura delle cellule, filtrare la soluzione ricostituita per filtro da 0,22 µm siringa sterile per rimuovere potenziali precipitati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. caratterizzazione del lipido plCSA-mirati-nanoparticelle polimeriche
<ol><li>
Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS)
	<ol>
<li>Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (diluizione 50 volte). Caricare 500 µ l di campione in una provetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta. Nota: Potenziale Zeta e cuvette DLS possono variare basato sulle specifiche dello strumento.</li>
		<li>Una volta completata la misurazione, registrare il diametro della particella, indice di polidispersione (PDI) e potenziale zeta. Media i risultati ottenuti da 4 ripetono letture e calcolare la deviazione standard.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Nota: La morfologia delle nanoparticelle è stata osservata da TEM con il metodo della macchia negativa. 24<ol>
<li>Diluire le nanoparticelle con acqua ultrapura (400-fold diluizione). Aggiungere 20 µ l del campione su una griglia TEM e lasciar per riposare per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di acido fosfotungstico 2% (p/v) e lasciar per riposare per 2 min. stoppino via la goccia.</li>
		<li>Asciugare la griglia TEM a temperatura ambiente.</li>
		<li>Impostare la tensione di accelerazione TEM a 80 kV e ingrandire l'immagine a 100.000 × visualizzare le nanoparticelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinazione dell'efficienza di incapsulamento (EE) e LE
	<ol>
<li>Generazione di curva standard. Sciogliere DOX in acqua ultrapura per preparare soluzioni DOX di cinque diverse concentrazioni: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. Generare una curva standard basata sulle concentrazioni di DOX.</li>
		<li>Diluire 25 µ l di nanoparticelle con 500 µ l di acqua ultrapura. Misurare l'assorbimento a 480 nm con uno spettrometro UV-VIS. La curva standard per calcolare le concentrazioni di farmaco.</li>
		<li>Calcolare LE usando la seguente equazione: LE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (Totale peso dei materiali)) × 100%.</li>
		<li>Calcolare il EE usando la seguente equazione: EE = ((quantità di droghe in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta di droga)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Misurazione dell'efficienza coniugazione usando l'analisi (BCA) acido bicinconinico 25 , 26 , 27<ol>
<li>Dispensare 25 µ l di soluzioni del peptide standard (tabella 1) o plCSA-DNPs nei pozzetti di micropiastre in duplice copia. Aggiungere 200 µ l del reagente lavoro in ciascun pozzetto e mescolare la piastra bene su un agitatore per piastre per 30 s.</li>
		<li>Coprire la piastra e incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Misurare l'assorbanza a 562 nm su un lettore di piastra. Utilizzare la curva standard generata per calcolare le concentrazioni di plCSA di plCSA-DNPs.</li>
		<li>Calcolare l'efficienza di coniugazione usando la seguente equazione: Efficienza di coniugazione = ((importo del peptide in nanoparticelle) / (quantità di aggiunta del peptide)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Flaconcino</td>
			<td>Volume di diluente (μL)</td>
			<td>Volume e origine del peptide (μL)</td>
			<td>Concentrazione finale del peptide (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>300 di Stock</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>250 di fiala una diluizione</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>250 di diluizione flaconcino B</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>250 di diluizione flacone C</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>200 di diluizione fiala D</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>250 di diluizione del flaconcino E</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>100 di diluizione flaconcino F</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Preparazione di peptidi Standard
5. fluorescenza microscopia valutazione dell'assorbimento di nanoparticelle plCSA-mirati in cellule di coriocarcinoma (JEG3)
<ol><li>Le cellule sui 12 pozzetti sterili a 1.0 × 10 di semi4 cellule/pozzetto con completa DMEM/F12 (cDMEM/F12, contenente 1% penicillina/streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS)). Permettono alle cellule di crescere alla confluenza del 60% a 37 ° C e 5% di CO2 in condizioni umide.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di media freddo fresco con un contenuto basso del siero (5% FBS) e DNPs o plCSA-DNPs (5 µ g di equivalenti DOX).</li>
	<li>Incubare la miscela delle cellule e nanoparticelle a 4 ° C per 1 h.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di fresco cDMEM/F12 e incubare le cellule a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere il cDMEM/F12 e lavare le cellule tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule.</li>
	<li>Rimuovere il PFA. Lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Aggiungere 1 mL di PBS contenente DAPI (1 µ g/mL) per i nuclei di colorazione e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Aspirare il PBS e lavare le cellule tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere liquido di montaggio e immagine della fluorescenza con un microscopio a fluorescenza, utilizzando canali verde e blu per visualizzare la DOX e nuclei, rispettivamente.</li>
</ol>

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<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems%3A+proteolytic+stability+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li>
</ol>

X.F. e B.Z. sono gli inventori il brevetto PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 inviato da SIAT che copre un metodo di sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati e applicazione. Nessun potenziali conflitti di interesse sono stati divulgati dagli altri autori.

Questo protocollo fornisce un metodo efficace e riproducibile per la sintesi di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero. Il metodo di passo singolo sonicazione per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero è veloce, riproducibile e diverso dai metodi di nanoprecipitazione tipici che coinvolgono riscaldamento, Vortex o evaporazione. Quindi, il metodo sviluppato riduce significativamente il tempo di sintesi. Inoltre, l'EDC/NHS bioconjugate utilizzato in questo protocollo è una tecnica comunemente usata e co...

Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Quindi, targeting tumorale selettiva è la chiave per esplorare metodi di successo terapeutici. Le nanoparticelle offrono un'opportunità promettente per la terapia del cancro, e molecolare assembly con diversi gruppi funzionali saranno che permettono di migliorare l'efficacia dei farmaci e ridurre gli effetti collaterali associati1,2. Inoltre, i sistemi di nanoparticella utilizzano principalmente attivi e passivi di targeting per raggiungere target tumori3.
Passivo di targeting sfrutta le caratteristiche innate di nanoparticelle e permeabilità migliorata ed effetti di ritenzione (EPR) per raggiungere le cellule del tumore. Liposomi cationici sono stati utilizzati con successo per fornire varie droghe anticancro a tumori in applicazioni cliniche4,5,6. Nonostante il potenziale effetto terapeutico del cancro efficace, una concentrazione di farmaco basso nella regione del tumore e un'incapacità di distinguere le cellule del tumore dai tessuti normali sono due principali limitazioni del passivo-targeting nanoparticelle7.
Strategie di targeting attive approfitta di antigene-anticorpo, ligando-recettore e altre interazioni di riconoscimento molecolare per consegnare i farmaci specificamente a tumori8. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è largamente espresso sulla maggior parte delle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Inoltre, la proteina malarica VAR2CSA specificamente possibile associare a plCSA9,10. Quindi, VAR2CSA può essere uno strumento per il targeting di cellule tumorali umane. Tuttavia, quando VAR2CSA è coniugato a nanoparticelle, la proteina full-length può limitare la penetrazione di nanoparticelle nelle cellule del tumore. Recentemente, abbiamo scoperto un peptide di associazione plCSA (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA. plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle rapidamente legato ad coriocarcinoma cellule e significativamente aumentato doxorubicina (DOX) attività antitumorale in vivo11; Queste particelle anche specificamente legato al trofoblasto placentare e potrebbero servire come strumento per la somministrazione mirata di farmaci per la placenta12.
Le nanoparticelle lipidiche-polimero sono costituiti da un guscio di monostrato lipidico e un nucleo idrofobo polimerico e rappresentano un nuovo vettore per la consegna della droga. Queste nanoparticelle combinano i vantaggi dei liposomi e polimerici nanovettori, quali dimensioni delle nanoparticelle controllabile, elevata biocompatibilità, rilascio prolungato di farmaci, efficienza di carico alta droga (LE) e un'eccellente stabilità13. In questo lavoro, abbiamo usato un metodo a passo singolo sonicazione per sintetizzare nanoparticelle lipidiche-polimero. Questo metodo è veloce, comodo e adatto per scale-up ed è stato ampiamente utilizzato per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero dal nostro gruppo11,14 e gli altri15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) è un popolare carbodiimide usato come un agente di reticolazione per biomolecole contenenti ammine e carbossilati19di coniugazione. Oltre a EDC, N-Idrossisulfosuccinimide (NHS) è il più comune reagente di coniugazione in superficie e nanoparticelle coniugazione reazioni20,21. NHS può ridurre il numero di reazioni secondarie e migliorare la stabilità e rendimento di estere intermedi22,23.
Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. In primo luogo, la sintesi di passo singolo sonicazione delle nanoparticelle di DOX-caricati del lipido-polimero (DNPs) è descritto. Quindi, una tecnica di bioconjugate EDC/NHS per la generazione di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero è stato introdotto. Questa tecnica di bioconjugate è utilizzabile anche per coniugare altri anticorpi e peptidi alle nanoparticelle. Infine, descriviamo l'analisi fisico-chimica di proprietà e in vitro utilizzato per caratterizzare le nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. Crediamo che queste nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero potrebbero costituire un sistema efficace per la somministrazione mirata di farmaci per tumori più umani e la somministrazione mirata di payload di placenta per trattare i disordini placentari.

<table><tbody><tr><td>plCSA peptide</td><td>Shanghai GL Biochem</td><td>573518</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Sinopharm 10009218</td><td></td><td>chimico per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Lecitina di soia</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>per la sintesi</td></tr> <tr><td>di nanoparticelleDoxorubicina</td><td>JKC 113424 chimico</td><td></td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1008621</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich 719897</td><td></td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Processore ad ultrasuoni</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Filtro centrifugo (MWCO 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>per centrifuga di purificazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>per purificazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td>2-[morfolino]acido etansolfonico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) cloridrato di carbodiimmide (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>, Sacche per dialisi,</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td><td>per la purificazione di nanoparticelle</td></tr>, <tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>, provette da centrifuga da 10 mL, polipropilene</td>, <td>Aladdin</td><td>S-025</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>, provette da centrifuga da 15 mL, polipropilene</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>per varie applicazioni</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro siringa sterile</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>per la purificazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td>siringa da 1 ml, polipropilene</td><td>BD</td><td>328421</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>per analizzatore granulometrico</td></tr><tr><td>Acido</td><td></td><td></td> fosfotungstico <td>per TEM</td></tr><tr><td>Griglia TEM</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>per TEM</td></tr><tr><td>Spettrometro UV-VIS</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td>per TEM</td></tr><tr><td>Trasmissione microscopio elettronico</td><td></td><td>JEOL JEM-100CXII</td><td>per analizzatore granulometrico</td></tr><tr><td>Reagente BCA A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>per saggio BCA</td></tr><tr><td>Reagente BCA B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>per saggio BCA</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>per BCA </td></tr><tr><td>test Lettore di piastre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan&trade; GO</td><td>per il test BCA</td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>JEG3 Banca</td><td>cellulare dell'Accademia cinese delle scienze</td><td>TCHu195</td><td>Planta umana</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30272.01</td><td>fenolo privo di rosso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10100</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070063</td><td>per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>per captazione cellulare</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1372021</td><td>per captazione cellulare</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606584</td><td>per captazione cellulare</td></tr><tr><td>Substrato di montaggio</td><td>Life</td><td>P36961</td><td>per captazione cellulare</td></tr></tbody></table>

sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plcsa) - targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Le nanoparticelle attivamente targeting offrono un approccio promettente per la terapia del cancro. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è espresso su una vasta gamma di cellule tumorali e trofoblasto placentare e malarica proteine che var2csa in particolare può essere associato a plCSA. Un peptide di associazione segnalata placentare condroitina solfato A (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA, specificamente anche possibile associare a plCSA sulle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Quindi, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle potrebbero essere usate come uno strumento per somministrazione di farmaci mirati a cancri umani e trofoblasto placentare. In questo protocollo, descriviamo un metodo per sintetizzare nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero caricate con doxorubicina (plCSA-DNPs); il metodo consiste in un singolo sonicazione passo e bioconjugate tecniche. Inoltre, sono descritti diversi metodi per la caratterizzazione plCSA-DNPs, compresa la determinazione di loro proprietà fisico-chimiche e l'assorbimento cellulare di cellule placentari coriocarcinoma (JEG3).

In questo protocollo, PLGA, DSPE-PEG-COOH e soia lecitina sono un polimero rappresentativo, coniugato del lipido-PEG-COOH e lipidi, rispettivamente. La sintesi di nanoparticelle plCSA-mirati del lipido-polimero tramite un singolo passaggio sonicazione metodo e una tecnica EDC/NHS è illustrata nella Figura 1. In primo luogo, in condizioni di sonicazione, lecitina di soia, PLGA e DSPE-PEG-COOH si autoassemblano per formare nucleo-conchiglia strutturato...

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.

Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, come la somministrazione mirata di terapie ai tumori umani e il citoblasto della placenta. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è un metodo semplice e riproducibile per sintetizzare peptidi coniugati in altre particelle. Per iniziare, aggiungere tre millimetri di etanolo al quattro per cento di etanolo a un tubo di centrifuga sterile da 10 millilitri.Quindi, aggiungere 90 microgrammi di soluzione stock di lecitina di soia, 210 microgrammi di soluzione di stock di acido DSPE-PEG-carbossilico e 750 microgrammi di soluzione stock DOX. Utilizzare una siringa millilitro per pipettare due milligrammi di soluzione stock PLGA. Posizionare il tubo di centrifuga in un bagno di ghiaccio su un processore ad ultrasuoni e sonicare per due minuti.Quindi, aggiungere la soluzione stock PLGA per quanto riguarda la caduta nel tubo di centrifuga. Per purificare i DNP, utilizzare un filtro di centrifuga per lavare la soluzione in tampone MES molare 0.1. Quindi, centrifugare la soluzione a 1000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.Per iniziare l'attivazione dell'estere, aggiungere 0,4 milligrammi di EDC a un millilitro di DNP. Quindi, aggiungere 0,24 milligrammi di NHS alla reazione. Quindi, consentire alla reazione di verificarsi fino a un'ora a temperatura ambiente al buio.Successivamente, mescolare accuratamente i componenti di reazione e posizionare la reazione su uno shaker. Per iniziare la reazione dell'ammina, utilizzare PBS per aumentare il pH tampone da 7,2 a 7,5. Quindi, aggiungere 0,5 milligrammi di peptide di targeting pICSA alla soluzione di reazione.Mescolare bene la soluzione e posizionarla su uno shaker. Quindi, consentire alla reazione di procedere a quattro gradi Celsius durante la notte al buio. Il giorno dopo, riempire i sacchetti di dialisi con la soluzione coniugata.Purificare i DNP pICSA con tampone PBS a temperatura ambiente per 24 ore al buio. Dopo aver coltivato le cellule in base al protocollo di testo, rimuovere il supporto e aggiungere un millilitro di supporti freschi e freddi con il cinque percento di DNP o DNP FBS e pICSA. Quindi, incubare la miscela cellulare e nanoparticelle per un'ora a quattro gradi Celsius.Successivamente, rimuovere il supporto e lavare le celle tre volte con PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzi freschi e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il supporto e lavare le celle tre volte con PBS.Quindi, aggiungere due millilitri di PFA freddo e quattro percento e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il PFA e lavare le celle con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS con DAPI per la colorazione dei nuclei.Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Infine, aggiungere il supporto di montaggio e l'immagine della fluorescenza con un microscopio a fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, i DNP sono stati preparati con successo e coniugati a pICSA BP. Dopo la coniugazione, il diametro dei DNP primari aumentò a circa 109 nanometri.Le immagini TEM dei DNP e dei DNP pICSA mostravano che le particelle erano ben disperse e generalmente dimostravano morfologia sferica. Il potenziale zeta delle nanoparticelle era negativo 20,1 e 29,9 millivolt, indicando che le nanoparticelle erano altamente stabili. Il saggio di assorbimento cellulare JEG3 ha indicato i DNP pICSA legati alle cellule JEG3 entro 30 minuti.Pertanto, il pICSA BP è stato coniugato in modo efficiente alla superficie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sonicare la miscela per uno o due minuti prima di aggiungere PLGA. Seguendo questa procedura, i nostri metodi come il test HPLC possono essere eseguiti al fine di determinare l'efficienza coniugazione in modo più accurato.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia riproduttiva per esplorare la possibilità di un trattamento mirato alla placenta nelle complicanze della gravidanza.

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