Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave dell'immunobiologia di base e della ricerca infiammatoria sulle malattie intestinali per quanto riguarda la cascata di adesione delle cellule immunitarie necessaria per l'homing agli organi periferici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un approccio conveniente e diretto per rispondere alle domande funzionali nel contesto dell'adesione cellulare in condizioni di flusso. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per esplorare il meccanismo degli anticorpi anti-integrina poietici cellulari nelle malattie infiammatorie intestinali, può essere modificato per analizzare problemi simili in altri contesti di malattia infiammatoria.

Inizia allungando un pezzo di tubi di gomma su un lato con piccole forbici per consentire l'inserimento di un capillare rettangolare di circa 0,5 centimetri nel tubo. Quindi sigillare la connessione con pellicola di paraffina. Rivestire il capillare con 20 microlitri del addressin di interesse e sigillare il lato non collegato al tubo con pellicola di paraffina di plastica per almeno un'ora di incubazione a 37 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, rimuovere il film di paraffina di plastica e lasciare che il liquido ammollo dal capillare su un tovagliolo di carta per svuotare il tubo. Quindi bloccare il capillare con 20 microlitri di soluzione di blocco per almeno un'ora a 37 gradi Celsius. È molto importante applicare il blocco al capillare direttamente dopo aver rimosso il rivestimento per evitare l'essiccazione del capillare in quanto ciò potrebbe compromettere la funzionalità delle proteine codificate.

Mentre il capillare viene bloccato, aggiungere 18 millilitri di sangue umano intero anticoagulato da un tubo da 50 millilitri e diluire il sangue a un volume totale di 35 millilitri con PBS. Strato 10 millilitri di gradiente di densità mezzo sotto la soluzione ematica e isolare le cellule del sangue periferico mononucleare per centrifugazione gradiente densità. Al termine della separazione, trasferire le cellule mononucleari del sangue periferico dall'interfaccia del mezzo gradiente di densità a un nuovo tubo da 50 millilitri.

E portare il volume totale nel tubo fino a 50 millilitri con PBS fresco. Dopo la centrifugazione, resuspend il pellet in 10 millilitri di PBS fresco per il conteggio e la macchia delle cellule con un colorante di tracciamento cellulare adatto secondo le istruzioni del produttore. Al termine dell'incubazione di colorazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimorsi il pellet a 1,5 per 10 alle sei cellule per millilitro di concentrazione media RPMI completa.

Quindi semina un millilitro di cellule in tanti pozzi di un piatto di 48 gradi come ci sono le condizioni. E aggiungere il volume appropriato di anticorpo anti-integrina ai pozzi appropriati per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente utilizzare una pipetta P1000 per rimescolare le celle più volte prima di trasferire le celle in singoli due tubi millilitro.

Risciacquare ogni bene con un millilitro di PBS e mettere in comune i lavaggi nei due tubi di millilitro appropriati. Dopo il conteggio, pelletare le cellule per centrifugazione e rimescolare le cellule nel volume appropriato del tampone di adesione per ottenere 1,5 volte dieci alla sesta cellule per sospensioni millilitre. Quindi aggiungere il volume appropriato di cloruro di manganese a ciascun tubo a una concentrazione finale millimolare.

Quando le celle sono pronte, accendere il microscopio e selezionare i filtri e i laser appropriati, la modalità obiettivo e acquisizione. Rimuovere il film di paraffina di plastica dalla punta del capillare e utilizzare le forbici per allungare un pezzo di tubi di gomma di cinque centimetri per consentire al capillare di essere collegato al tubo più piccolo. Sigillare il collegamento tra il capillare e il tubo con pellicola di paraffina di plastica.

E montare il capillare su un vassoio di fissazione. Posizionare il vassoio sul porta vassoio del microscopio in modo che il capillare sia a fuoco. E inserire i tubi di gomma nella tacca corrispondente della pompa peristaltica.

Posizionare l'estremità non attaccata del tubo nel primo tubo campione contenente la sospensione cellulare. E inserire il tubo corto sull'altro lato del capillare in un tubo da 15 millilitri per raccogliere il flusso attraverso. Lasciare riempire i tubi a una portata di 500 microlitri al minuto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge quasi il capillare.

Quindi lasciare che il capillare si riempia a una portata di 100 microlitri al minuto. Quando il capillare è riempito di cellule, regolare la portata a 10 microlitri al minuto e catturare le immagini time lapse delle cellule che si muovono lentamente attraverso il capillare lungo l'interno della parete rivestita di addressin ogni due secondi per un totale di tre minuti. Una volta che la sospensione cellulare raggiunge l'interno del capillare, è fondamentale evitare qualsiasi interruzione del flusso in quanto ciò porterà a un'interazione statica dell'addressina dell'integrina che potenzialmente parzialeggia la misurazione.

Prima di scartare il flusso l'intero capillare attraverso l'oculare del microscopio per assicurarsi che la sezione osservata sullo schermo sia rappresentativa. Liberare i tubi dalla pompa e lasciare che il fluido rimanente torni nel tubo dei due millilitri. Quindi scollegare il capillare e il tubo dal vassoio di fissazione e l'immagine del capillare successivo come appena dimostrato.

Per valutare le registrazioni time lapse, aprire la prima sequenza nel software di analisi appropriato ed esportare la prima e l'ultima tre immagini come file TIFF. Apri le tre immagini di inizio in ImageJ e seleziona l'immagine, il tipo e i 32 bit per convertire le immagini a 32 bit. Quindi selezionare l'immagine, il colore e unire i canali per unire le immagini in un'unica immagine e convertire l'immagine composita in RGB per il salvataggio come file TIFF.

Dopo aver convertito le ultime tre immagini nello stesso modo, contare le celle bianche visibili all'inizio e terminare le immagini composite. E sottrarre il numero di celle bianche nell'immagine iniziale dal numero di celle bianche nell'immagine finale. La perfusione di capillari rivestiti con ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, ma non Isotipo Fc chimera con PBC umani porta ad una marcata adesione quando è presente una delle tre addressine.

Al contrario, l'inibizione delle interazioni di addressina dell'integrina usando anticorpi neutralizzanti porta tipicamente a una marcata diminuzione dell'adesione dinamica che è assente quando vengono aggiunti anticorpi di controllo dell'isotipo. Inoltre, il trattamento di cellule T umane CD4 con chemiochine specifiche porta ad una maggiore adesione alle addressine rispetto alle cellule umane non trattate. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare che vari fattori contribuiscono all'adesione cellulare dinamica in vivo che non può essere completamente riassunta in questo saggio.

Tuttavia, è possibile regolare il saggio per affrontare domande molto complesse. Al fine di affrontare ulteriori domande sul comportamento di adesione differenziale dei tipi di cellule di prova, è anche possibile eseguire test di adesione competitivi con diversi tipi di cellule etichettati con diversi coloranti di tracciamento cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha permesso di esplorare gli effetti dei diversi anticorpi anti-integrina utilizzati o attualmente in fase di sviluppo per il trattamento delle malattie infiammatorie intestinali.