Name: Analisi di adesione dinamico per lanalisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri un saggio di adesione dinamica per analizzare l'interazione di cellule immunitarie con endotelio vascolare in condizioni di flusso. Questo metodo valuta l'efficacia di anticorpi anti-integrina nelle malattie infiammatorie intestinali.

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La ricerca di CN, IA, MFN e SZ è stata sostenuta dal centro interdisciplinare per ricerca clinica (IZKF) e il programma ELAN dell'Università di Erlangen-Norimberga, l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung di Crohn tedesco e Colite Foundation (DCCV), la clinica ricerca gruppo CEDER di Consiglio di ricerca tedesca (DFG), il programma di argomento DFG sul Microbiota, l'iniziativa di campo emergente ed il DFG Collaborative Research centri 643, 796 e 1181.

Gli studi descritti nelle sezioni seguenti sono stati eseguiti secondo l'approvazione del comitato etico dell'Università Friedrich-Alexander Erlangen-Norimberga.
1. preparazione dei capillari
<ol><li>Collegare rettangolari capillari al tubo di gomma che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0.5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra tubo con pellicola di plastica paraffina e capillare.</li>
	<li>Cappotto del capillare con 20 µ l di MADCAM1 (ricombinante Fc chimera; 5 µ g/mL α4β7, ad es. MAdCAM-1, in tampone di rivestimento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES)) o la soluzione di controllo di isotipo appropriato utilizzando una pipetta p20 (fluido stesso si immergeranno nel capillare). Quindi, il lato non collegato al tubo con la pellicola di plastica paraffina ed incubare per almeno 1 h a 37 ° C. Utilizzare un capillare riempito solo con il tampone di rivestimento o con il controllo di isotipo appropriato come controllo negativo.</li>
	<li>Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare, svuotare il rivestimento lasciando il liquido soak fuori il capillare su un capillari di asciugamano e blocco di carta per almeno 1 h con 20 µ l di blocco soluzione (1x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sigillare il lato aperto del capillare con pellicola di plastica paraffina. Non rimuovere la soluzione bloccante prima di procedere alla microscopia.</li>
</ol>2. cella di isolamento, trattamento e preparazione per microscopia
Nota: Questa procedura può essere eseguita durante l'incubazione periodi necessari per la preparazione capillare.
<ol><li>Raccogliere 18 mL di sangue intero umano anticoagulated con un prelievo di sangue asettica impostato dalla vena cubitale del volontariato persone (per esempio, pazienti affetti da IBD e/o controlli sani) dopo consenso informato scritto secondo le regolazioni del locale Comitato etico. Nota: Questa operazione deve essere eseguita solo da personale medico qualificato ed esperto secondo le normative nazionali e/o locale.</li>
	<li>Riempire il sangue in una provetta da 50 mL e diluire fino ad un volume di 35 mL con PBS 1X. Quindi sottoposto la miscela di sangue-PBS con 10 mL di terreno di gradienti di densità.</li>
	<li>Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità per 15 min a 800 x g e 24 ° C, senza freno per separare le cellule.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) aspirando lo strato delle cellule bianche proprio sopra lo strato medio gradiente di densità (strato trasparente centrale). Trasferire PBMCs in una provetta di fresca 50 mL, riempire fino a 50 mL con 1x PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g e 10 ° C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS successivamente contare i numeri di cellulare, per esempio, utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.</li>
	<li>Facoltativo: Per studiare l'adesione dei granulociti eseguire la procedura seguente. In caso contrario, procedere con il passaggio 2.7 o 2,8.
	<ol>
<li>Raccogliere lo strato del granulocyte (livello più basso dopo centrifugazione in gradiente di densità contenente anche eritrociti). Risospendere le cellule in 40 mL di PBS 1X. Quindi aggiungere 8 mL di 6% destrano in PBS 1X, mescolare delicatamente e lasciare il sedimento di celle a temperatura ambiente per 30 minuti. Nota: Gli eritrociti affonderanno alla parte inferiore del tubo, mentre i granulociti rimarrà in sospensione.</li>
		<li>Dopo 30 min, raccogliere il surnatante, trasferire in un tubo fresco da 50 mL e centrifugare per 6 min a 300 x g e a 4 ° C. Scartare il surnatante e lisare gli eritrociti rimanenti aggiungendo 5 mL di 0,2% NaCl in ddH2O. Incubare per 1 min.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di 1,4% NaCl in ddH2O e incubare per un altro minuto. Fermare la Lisi ipotonica aggiungendo 20 mL di 1X PBS e centrifugare per 6 min a 300 x g e 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS. Quindi, contare i numeri di cellulare utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Facoltativo: Per studiare l'adesione dei sottoinsiemi PBMC, purificare diversi tipi di cellule o sottoinsiemi (ad es., CD4+ e CD8+ T cellule o CD19+ B cellule) utilizzando microsfere secondo il protocollo del produttore o di fluorescenza-attivato cella ordinamento (FACS). In caso contrario, procedere con il passaggio 2.8.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 300 x g e 10 ° C. Scartare il surnatante e macchia le cellule con cellulare tracciante (ad es., CFSE) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Successivamente, centrifugare le cellule per 10 min a 300 x ge scartare il surnatante. Risospendere in 1X PBS, determinare il numero di cell e centrifugare nuovamente per 10 min a 300 x g.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Nota: Queste cellule sono ora pronte per microscopia.</li>
	<li>Opzionale: Curare le cellule con citochine, neutralizzando gli anticorpi o altri composti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.
	<ol>
<li>Omettere il passaggio 2.10 e risospendere il pellet cellulare macchiato dal passaggio 2.9 nel medium RPMI (con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina) per ottenere una concentrazione di 1.5 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Pipettare 1 mL di questa sospensione cellulare in altrettanti pozzetti di una piastra di 48-bene come ci sono le condizioni per essere analizzati. Sempre preparare un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare non patinata come controllo negativo e un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare α4β7 rivestite come controllo positivo.</li>
		<li>Per il trattamento con anticorpi anti-integrina, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (ad esempio, 10 µ g/mL vedolizumab) alla sospensione di cellule. Incubare per 1 h a 37 ° C. Per il trattamento con citochine, aggiungere la quantità appropriata di citochina ricombinante (ad esempio, 10 ng/mL CXCL10) alla sospensione di cellule. Incubare per 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, è necessario raccogliere le cellule di risospendere le cellule più volte utilizzando una pipetta p1000. Trasferire le cellule in una provetta da 2 mL, risciacquare bene con 1 mL di PBS 1X e aggiungere alla provetta 2 mL. Determinare il numero di cellulare. Nota: L'incubazione di popolazioni di cellule aderenti (ad es., monociti) potrebbe richiedere ulteriori misure (ad es., il trattamento con tripsina) per staccare le cellule dalla piastra.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g e a 10 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in quantità adeguata di buffer di adesione per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Quando il pretrattamento con chemochine non aggiungere MnCl2 alla sospensione di cellule. Queste cellule sono ora pronte per microscopia. Nota: Il volume minimo utilizzato per il dosaggio dipende dalla pompa e la tubazione utilizzata. In questo studio, utilizzando la pompa peristaltica e la tubatura specificato nella Tabella materiali, era richiesto un volume minimo di 400 µ l. Se desiderata e applicabile (a seconda del tipo di cella e rendimento), la concentrazione di cellule in sospensione può essere aumentata per misurare più alta adesione in un breve periodo di tempo.</li>
	<li>Possibili modifiche: analisi di adesione dinamica competitiva
	<ol>
<li>Eseguire i passaggi di cui sopra con popolazioni differenti delle cellule per essere confrontate tra loro (ad es., regolamentazione e cellule T effettrici isolate attraverso l'isolamento di biglie magnetiche seguendo le istruzioni del produttore secondo il punto 2.7).</li>
		<li>Macchia di ogni popolazione con un colorante diverso (ad es., CFSE e Fichera) come descritto nei passaggi 2.8 – 2,9 per essere in grado di distinguere le popolazioni delle cellule durante la microscopia.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Volumi uguali di sospensioni di cellule (ad es., 500 µ l di cellule T regolatorie) e 500 µ l di cellule T effettrici di mescolare per ottenere un finale misto della concentrazione cellulare di 1.5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Tali sospensioni possono essere utilizzati successivamente per analisi competitiva del processo di adesione irrorando popolazioni differenti delle cellule attraverso la capillare stesso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. live Cell Imaging di aderenza dinamica
<ol><li>Accendere il microscopio e selezionare il filtro appropriato o laser per eccitare la cellula di rilevamento dye(s) (ad es., 488 laser di nanometro per CFSE), un obiettivo appropriato (ad es., 40 X) e un imaging di intervallo di acquisizione modalità abilitazione tempo.</li>
	<li>Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare e collegare il capillare con un breve pezzo di tubo (circa 5 cm di lunghezza) che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0,5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra il tubo con la pellicola di plastica paraffina e capillare.</li>
	<li>Montare il capillare su un vassoio di fissazione (ad es., coperchio da una piastra a 6 pozzetti con un cut-out rettangolare leggermente più corto rispetto alla lunghezza del capillare) e posizionare il capillare fisso sul titolare del vassoio del microscopio, in modo che il capillare è in stato attivo e pronto per microscopia.</li>
	<li>Inserire il tubo di gomma nella corrispondente tacca della pompa peristaltica e posizionare l'estremità non collegato alla capillare nella provetta del campione secondo contenente la sospensione cellulare. Inserire il tubo corto sul lato opposto del capillare in una provetta da 15 mL per raccogliere flusso continuo.</li>
	<li>Lasciate che il riempimento della tubazione con una portata di 500 µ l al minuto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge quasi il capillare. Poi lasciare che il riempimento capillare con una portata di 100 µ l/min. Nota: Un rapido riempimento del capillare assicura una distribuzione regolare della sospensione delle cellule all'interno del capillare.</li>
	<li>Quando il capillare è riempito con una sospensione cellulare, regolare la portata a 10 µ l/min. Nota: Queste portate possono variare, quando vengono utilizzati i capillari di dimensioni diverse o diverse pompe peristaltiche. In questo studio, il tasso di flusso di 10 µ l/min è stato ottimizzato per la pompa e capillari per simulare il flusso sanguigno in vivo .</li>
	<li>Catturare immagini time-lapse delle cellule si muove lentamente attraverso il capillare lungo la α4β7 rivestite all'interno muro ogni 2 s per un totale di 3 min. Nota: Gli intervalli e il tempo totale può variare a seconda del tipo di cella e questione da affrontare.</li>
	<li>Prima di gettare il capillare, schermo intero capillare attraverso l'oculare del microscopio per assicurarsi che la sezione mostrata nel video è rappresentante. Se necessario, effettuare una seconda registrazione.</li>
	<li>Liberate il tubo dalla pompa e lasciate che il liquido rimanente correre indietro nella provetta 2 mL, poi scollegare la tubazione e capillare dal vassoio di fissazione e continuare con il successivo capillare.</li>
</ol>4. valutazione e conta cellulare
<ol><li>Aprire la sequenza di time-lapse con il software appropriato ed esportare le prime tre immagini ("inizio") e le ultime tre immagini ("fine") come file Tiff.</li>
	<li>Aperte le tre immagini "Beginning" in ImageJ, convertire a 32 bit ('immagine | Tipo | 32 bit') e unire immagini (' immagine | Colore | Unire i canali; assegnare i colori rossi, verdi e blu per le differenti immagini). Convertire immagine composita in RGB (' immagine | Type-RGB') e salvare come file Tiff. Ripetere l'operazione con le immagini di "Fine". Nota: Nell'analisi di adesione dinamica competitiva con le cellule colorate con colori diversi, in primo luogo dividere i canali delle immagini per analizzare separatamente adesione delle popolazioni differenti delle cellule.</li>
	<li>Contare le celle bianche visibili nel composito "Inizio" e "Fine" e sottrarre il numero di globuli bianchi nel «Principio» da cellule bianche alla "fine". Nota: La differenza rappresenta il numero di nuovi aderenti cellule nell'intervallo di tempo di 3 min. Nell'immagine composita, cellule che spostato sono visibili nel colore specifico che è stato assegnato al rispettivo telaio poiché essi localizzare in un altro posto nel frame precedente e seguente. Per le celle che sono aderenti, i segnali rossi, verde e blu nel stesso posto si sovrappongono al bianco.</li>
	<li>Per visualizzare meglio i risultati, è necessario compilare un video dalle sequenze di time-lapse, per esempio, usando ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B14%CE%B21+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn%27s+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).</li>
<li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23964932">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li>
<li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li>
<li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038247">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li>
<li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li>
<li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%3A+The+Official+Clinical+Practice+Journal+of+the+American+Gastroenterological+Association%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MAdCAM+antibody+%28PF-00547659%29+for+ulcerative+colitis+%28TURANDOT%29%3A+a+phase+2+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).</li>
<li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-based+therapeutics%3A+biological+basis%2C+clinical+use+and+new+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B14%CE%B27+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li>
<li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit%3A+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).</li>
<li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab%2C+an+Anti-%CE%B14%CE%B27+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li>
<li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis%3A+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li>
<li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis%2C+Calcium+Flux%2C+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+MRP8%2F14+is+a+regulator+of+%CE%B22+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li>
<li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li>
<li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li>
<li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+%CE%B1E%CE%B27+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8%28%2B%29+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li>
</ol>

M.F.N. ha servito come consulente per Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. M.F.N. e S.Z. ha ricevuto il sostegno alla ricerca da Takeda e Roche.

Il protocollo di cui sopra descrive una tecnica utile per studiare la dinamica adesione delle cellule immuni umane a ligandi endoteliali. Attraverso la variazione di ligandi rivestiti, tipi cellulari irrorato o sottoinsiemi, incubazione con stimoli ulteriori o diversi anticorpi neutralizzanti, ha quasi illimitato di potenziali applicazioni. Pertanto, tali dosaggi di adesione dinamica possono essere utile per rispondere a entrambe le domande fondamentali della ricerca di base, nonché query traslazionale che potrebbe contr...

Movimento delle cellule è un processo strettamente regolato indispensabile per lo sviluppo e la funzione degli organismi pluricellulari, ma inoltre è implicata nella patogenesi di una moltitudine di malattie1. Recentemente, il processo di homing delle cellule immuni dal flusso sanguigno ai tessuti periferici ha guadagnato l'attenzione aumentante, poiché contribuisce al rifornimento e all'espansione delle cellule patogene in tessuti infiammati in malattie immunologicamente mediate2 ,3. In particolare, l'homing ha dimostrato di avere rilevanza traslazionale in malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Il terapeutico anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferire con homing gut ha indicato l'efficacia in studi clinici di grandi4,5 ed è stato utilizzato con successo nel mondo reale pratica clinica6,7 , 8. ulteriori composti sono propensi a seguire9,10. Allo stesso modo, l'anticorpo di integrina terapeutico anti-α4, natalizumab, è utilizzato per il trattamento della sclerosi multipla (MS)11.
Tuttavia, la nostra comprensione funzionale del processo di homing in generale e il meccanismo di azione di tali anticorpi terapeutici in particolare è ancora limitato. È assodato che homing è costituito da diversi passaggi tra cui cella tethering e rotolamento con adesione successiva delle cellule che conduce all'arresto costante seguita da trans migrazione endoteliale12,13. I suddetti anticorpi neutralizzano le integrine sulla superficie delle cellule impedendo l'interazione con addressins sull'endotelio della parete del vaso. Questo è pensato per impedire cella ferma adesione14,15. Eppure, stiamo solo cominciando a capire la rilevanza differenziale delle integrine specifiche per homing delle cellule dei sottogruppi distinti delle cellule. Inoltre, gli effetti degli anticorpi anti-integrina su diversi sottoinsiemi del cellulare e associazioni di dose-risposta sono in gran parte sconosciute che conduce a un sacco di domande aperte nel campo delle terapie di homing e anti-adesione di intestino in IBD.
Pertanto, strumenti utili per affrontare tali questioni sono disperatamente necessari. L'effetto degli anticorpi anti-integrina sull'interazione integrina α4β7 finora è stata valutata principalmente valutando l'inibizione di efficacia/associazione associazione con citometria a flusso o tramite adesione statica saggi16,17 ,19,18,20, così con apparente semplificazione e deviazione dalla situazione fisiologica. Recentemente abbiamo stabilito un'analisi di adesione dinamico per studiare l'adesione integrine-dipendente delle cellule umane per addressins e gli effetti degli anticorpi anti-integrina sotto sollecitazione di taglio2. Il principio della tecnica è stato dimostrato in precedenza con mouse cellule21,22. Qui, si era adattato e sviluppato per affrontare le questioni di cui sopra traslazionale, apertura nuovi viali per meglio comprendere i meccanismi della terapia con anticorpi anti-integrina in vivo.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 48 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>833.923</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di adesione: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Capillari Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>: tubo Boro rettangolare 0,20 mm x 2,00 mm ID, lunghezza 50 mm</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, immunotools umano</td><td></td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Microbeads,</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>umano CellTrace&trade; Kit di proliferazione cellulare CFSE</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (Rotixa 50 RS)Tampone</td> di rivestimento <td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 150 mM NaCl + 1 mM Microscopio</td> confocale HEPES <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, umano</td><td>Immunotools</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>destrano 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcons (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc chimera controllo isotipo</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Portate Pompa peristaltica (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG umano</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo IgG del topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Indirizzo vascolare della mucosa nella molecola di adesione cellulare 1 (MAdCAM-1)</td><td>R& D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Camera di conteggio</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, umano</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>senza Mg e Ca</td></tr><tr><td>Film di paraffina plastica: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>CD18 anti-umano purificato</td><td></td><td>Biolegend 302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in gomma: SC0059T tubi LMT-55 a 3 stop, diametro interno 1,02 mm, lunghezza 406,4 mm</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Pipetti sierologici</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend</td><td></td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing delle cellule del sistema immunitario è importante per la patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Adesione di integrina-dipendente delle cellule di addressins è un passo fondamentale in questo processo e interferire con l'adesione di strategie terapeutiche sono state stabilite con successo. L'anticorpo di anti-α4β7 integrina, vedolizumab, è utilizzato per il trattamento clinico del morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) e altri composti sono propensi a seguire.
I dettagli della procedura di adesione e i meccanismi di azione degli anticorpi anti-integrina sono ancora poco chiari per quanto riguarda molti a causa delle limitate tecniche disponibili per la ricerca funzionale in questo campo.
Qui, presentiamo un saggio di adesione dinamico per l'analisi funzionale di adesione delle cellule umane in condizioni di flusso e l'impatto delle terapie anti-integrina nel contesto di IBD. Si basa sull'aspersione di cellule umane primarie attraverso capillari di vetro ultrasottile α4β7 rivestite con l'analisi al microscopio in tempo reale. Il saggio offre una varietà di opportunità per modifiche e perfezionamenti e detiene potenzialità per applicazioni traslazionale e meccanicistici scoperte.

Il metodo presentato in questo manoscritto ha lo scopo di simulare il processo di in vivo di adesione delle cellule umane per la parete endoteliale quanto più possibile a funzionalmente valuta adesione delle cellule e il ruolo degli anticorpi interferenti. Di conseguenza, ultrasottili capillari sono rivestiti con addressins e irrorati con le cellule umane fluorescente contrassegnate di interesse utilizzando una pompa di perfusione. Utilizzando cellule vive l'adesione delle cellul...

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave dell'immunobiologia di base e della ricerca infiammatoria sulle malattie intestinali per quanto riguarda la cascata di adesione delle cellule immunitarie necessaria per l'homing agli organi periferici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un approccio conveniente e diretto per rispondere alle domande funzionali nel contesto dell'adesione cellulare in condizioni di flusso. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per esplorare il meccanismo degli anticorpi anti-integrina poietici cellulari nelle malattie infiammatorie intestinali, può essere modificato per analizzare problemi simili in altri contesti di malattia infiammatoria.Inizia allungando un pezzo di tubi di gomma su un lato con piccole forbici per consentire l'inserimento di un capillare rettangolare di circa 0,5 centimetri nel tubo. Quindi sigillare la connessione con pellicola di paraffina. Rivestire il capillare con 20 microlitri del addressin di interesse e sigillare il lato non collegato al tubo con pellicola di paraffina di plastica per almeno un'ora di incubazione a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, rimuovere il film di paraffina di pla

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale, ci hanno permesso di esaminare il complesso di risposte innate e adattative immunitario associate con patogenesi. Utilizzando il punteggio istologico, la quantificazione di citochine pro-infiammatorie e di attività mieloperossidasi, si può cominciare a valutare queste risposte visto nella malattia infiammatoria intestinale.

Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

Qui presentiamo un metodo semplice e rapido per caratterizzare le proprietà adesive intrinseche delle molecole di adesione cellulare putative.  L'ectodominio secreto, marcato con epitopo, di una molecola di adesione cellulare viene catturato dal terreno di coltura su piccole perle funzionalizzate uniformi.  Queste perle possono quindi essere utilizzate immediatamente in semplici saggi di aggregazione delle microsfere.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Gli attuali trattamenti di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) hanno lo scopo di alleviare i sintomi della malattia, ma possono causare gravi effetti collaterali. Così, strategie alternative sono allo studio in modelli animali colite. Qui, viene spiegato come gli effetti benefici della dieta completa sui segni clinici IBD sono analizzati in un tale modello di colite.

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

Il punteggio sistematico dell'infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l'interpretazione dei dati.

Analisi sistematica del punteggio per l'infiammazione intestinale in un modello di colite indotta da solfato di sodio di Murine

Nel presente studio, il destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) viene somministrato ai topi tramite sonda gastrica orale per valutare la permeabilità intestinale sia in vivo che in campioni plasmatici e fecali. Poiché la funzione di barriera intestinale è influenzata in molti processi patologici, questo test diretto e quantitativo può essere utilizzato in diverse aree di ricerca.

Valutazione dell'integrità della barriera intestinale nei topi utilizzando destrano marcato con fluoresceina-isotiocianato

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'imaging di singole piastrine in migrazione utilizzando cavi avidina-biotina funzionalizzati con RGD con densità regolabile, rivelando che le piastrine generano una forza sufficiente per rompere il legame avidina-biotina.

Un test in vitro per studiare la migrazione piastrinica utilizzando tethers avidina-biotina funzionalizzati con RGD

Questo protocollo dimostra come il modello murino di infiammazione ileale e fibrosi simile alla malattia di Crohn (CD) contenente il dominio Src 2 contenente 5'-inositolo fosfatasi (SHIP) possa essere utilizzato per testare nuove terapie per la MC.

Valutazione degli interventi terapeutici nel modello murino carente di SHIP di ileite e fibrosi simile alla malattia di Crohn

Scopri un saggio di adesione dinamica per analizzare l'interazione di cellule immunitarie con endotelio vascolare in condizioni di flusso. Questo metodo valuta l'efficacia di anticorpi anti-integrina nelle malattie infiammatorie intestinali.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

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