Name: Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri l'ingegneria del tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane per la medicina rigenerativa. Questo metodo consente di produrre tessuto retinico pronto per il trapianto in modelli animali.

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Gli autori vorrei ringraziare Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Parigi, Francia) per il loro contributo durante la messa a punto del metodo descritto qui.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR [GPiPS: RFCS005-2010-ANR; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programma di Bio-ingegneria - DBS20140930777] e da LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. È stato sostenuto dal NeurATRIS, un'infrastruttura di ricerca traslazionale (Investissements d'Avenir) per bioterapie in neuroscienze [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, l'infrastruttura nazionale (Investissements d'Avenir) Ingegneria per pluripotenti e cellule staminali differenziate [ANR-11-INBS-000] di Christelle Monville. Karim Ben M'Barek è stato sostenuto da borse di studio dal DIM Stempole e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. Staminali sono parte dell'Istituto per le Malattie Rare supportato dall'Association Française contre les Myopathies (AFM) bioterapie-Téléthon.

Tutto il materiale umano utilizzato in questo protocollo sono stato utilizzato in conformità con i regolamenti dell'Unione europea. La linea cellulare umana di ES utilizzata in questo studio è stata derivata da un unico embrione. La coppia che aveva donato l'embrione è stato pienamente informata e hanno dato il loro consenso per una donazione anonima. Una linea cellulare di uso clinico umana ES è stata derivata da questo embrione, incassata, qualificata e adeguatamente documentata da Roslin cellule (UK). Prosciutti sono ottenuti in condizioni di sterilità durante un taglio cesareo in madri che hanno firmato un consenso informato per la donazione di placenta secondo le linee guida di ospedale (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparazione di terreni di coltura e reagenti
<ol><li>
Preparazione del terreno di coltura delle cellule RPE
	<ol>
<li>Per preparare il terreno di coltura delle cellule RPE, aggiungere 4% siero sostituto (20 mL per un volume finale di 500 mL), 1.000 x diluito 2-mercaptoetanolo (500 µ l per un volume finale di 500 mL) e soluzione di 1% Eagle′s mezzo minimo essenziale (MEM) gli aminoacidi non essenziali (5 mL per un finale volume di 500 mL) di (DMEM) medio alto glucosio dell'Aquila di Dulbecco modificato (475 mL per un volume finale di 500 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del mezzo di trasporto/conservazione
	<ol>
<li>Per preparare il mezzo di trasporto/conservazione, aggiungere 1% di penicillina-streptomicina (5 mL per un volume finale di 500 mL) di CO2-mezzo indipendente (495 mL per un volume finale di 500 mL) e tenerlo a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Risospensione dell'enzima termolisina
	<ol>
<li>Preparazione di una soluzione madre di termolisina<ol>
<li>Per preparare una soluzione stock di termolisina, scongelare la polvere di termolisina, che è stata conservata a-20 ° C, a temperatura ambiente.</li>
			<li>Come l'attività enzimatica può essere variabile da lotto a lotto, calcolare questa attività basata sul certificato di analisi fornito con la polvere di termolisina del batch da utilizzare. Dividere le "attività della proteasi neutra calcolato = ANPC" (indicato nel certificato di analisi) di 181 (che è il peso molecolare di tirosina). Il risultato ottenuto corrisponde all'attività enzimatica totale della dotazione termolisina polvere (U/fiala).</li>
			<li>Preparare una soluzione di riserva a 200 U/mL aggiungendo il volume d'acqua corrisponde all'attività enzimatica totale (U/fiala) diviso per 200 (U/mL).</li>
			<li>Sciogliere l'enzima pipettando l'acqua che è stato aggiunto su e giù. Vortice la soluzione per 30 s e verificare se la polvere completamente è stato sospeso. Pipettaggio più può essere richiesto per una completa dissoluzione.</li>
			<li>Aliquota della soluzione di riserva e conservare a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparazione di una soluzione di lavoro di termolisina Nota: La soluzione di termolisina deve essere preparata il giorno del trattamento prosciutto.<ol>
<li>Scongelare le aliquote stock di termolisina a 200 U/mL conservati a-20 ° C. Diluire la soluzione madre di 200x in tampone fosfato salino (PBS) al fine di ottenere un'attività enzimatica finale di 1 U/mL. Preparare 40 mL per trattare le patch di prosciutto 1 – 4.</li>
			<li>Filtrare la soluzione di termolisina attraverso un prima del filtro di 0,2 µm di utilizzare.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Risospensione di gelatina
	<ol>
<li>Preparazione della soluzione di gelatina di 20% e blocco Nota: Il 20% di soluzione di gelatina e il blocco può essere preparati fino a 1 settimana prima dell'uso.<ol>
<li>Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C a bagnomaria per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 10 g di gelatina a 40 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.</li>
			<li>Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Vortice ogni 10 min per omogeneizzare la soluzione.</li>
			<li>Una volta che la soluzione è omogenea, aggiungere 4 mL di soluzione 20% gelatina a quattro piastre di coltura di 6 cm. Evitare le bolle. Aggiungere una pellicola di plastica paraffina per proteggere i piatti e lasciare che la soluzione a solidificare a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparazione della soluzione di gelatina di 8% Nota: La soluzione di gelatina 8% può essere preparata il giorno prima dell'uso e conservata a 4 ° C.<ol>
<li>Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 4 g di gelatina di 46 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.</li>
			<li>Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Aggiungere un film di plastica paraffina per proteggere il tubo e tenerlo a bagno d'acqua a 37 ° C se deve essere utilizzato lo stesso giorno, o conservarlo a 4 ° C se deve essere usato più tardi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. termolisina trattamento delle membrane amniotiche umane
<ol><li>
Lavare la membrana amniotica umana
	<ol>
<li>Sono prosciutti forniti come piccoli pezzi (circa 30 mm x 30 mm) fissati in un'impalcatura di nylon, sia già a 4 ° C in PBS o congelati. Se forniti congelati, scongelare le membrane a 37 ° C in un incubatore per 30 min.</li>
		<li>Lavare le membrane:<ol>
<li>Posto 1 – 4 membrane in un flacone da 250 mL contenente 80 mL di PBS. Utilizzare come molte bottiglie come richiesto.</li>
			<li>Agitare ogni bottiglia in un agitatore per piastre ad alta velocità per 5 min, poi scarta il PBS. Aggiungere 80 mL di PBS e ripetere.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trattamento di termolisina
	<ol>
<li>Aggiungere 40 mL di soluzione di lavoro di termolisina (1 U/mL) al flacone contenente le membrane (1 – 4 membrane per bottiglie; fino a 3 bottiglie alla volta).</li>
		<li>Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min e poi vortice li per 30 s. Ripetere 1 x.</li>
		<li>Scartare la soluzione di termolisina e aggiungere 80 mL di PBS.</li>
		<li>Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min. Scartare il PBS e aggiungere 80 mL di PBS. Ripetere 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fissazione delle membrane amniotiche umane su un inserto di cultura
<ol><li>Utilizzare pinze lunghe sterili (che possono raggiungere il fondo della bottiglia) per rimuovere i prosciutti uno per uno e trasferire ogni prosciutto a una piastra di coltura di 10cm contenente 10 mL di PBS.</li>
	<li>In una nuova piastra di coltura 10cm contenente 10 mL di PBS, posizionare una delle membrane con il nylon rivolto verso il basso. Scollegare due dei quattro ganci che sono utilizzati per fissare la membrana di nylon.</li>
	<li>Inserire l'anello più piccolo dell'inserto cultura tra il nylon e la membrana.</li>
	<li>Assicurarsi che la membrana copre l'anello più piccolo completamente. La seconda parte dell'inserto cultura sopra la membrana di clip. La membrana dello scantinato del prosciutto è rivolto verso l'alto all'interno dell'inserto di cultura. Staccare le ultime due clip.</li>
	<li>Taglio, con forbici sterili, l'eccesso di membrana fuori l'inserto di cultura se necessario. Usando il forcipe, trasferire la membrana fissa nell'inserto cultura ad una piastra 12-pozzetti, aggiungere PBS e memorizzare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Ripetere queste operazioni (dal punto 3.2-3.5) con le altre membrane.</li>
</ol>4. lo scongelamento e la semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane
<ol><li>
Lo scongelamento delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento
	<ol>
<li>La banca di cellule RPE è congelata a 1 milione cellule per flaconcino criogenico in azoto liquido. Scongelare i flaconcini criogenici come molti come richiesto (350.000 celle sono seminate a membrana).</li>
		<li>Preparare una provetta da 15 mL contenente 3 mL di terreno RPE per flaconcino criogenico. Una volta che il flaconcino è scongelato, trasferire le cellule in ogni provetta. Ripetere questa operazione per le altre fiale.</li>
		<li>Omogeneizzare (pipetta su e giù un paio di volte per risospendere le cellule in medium RPE) e prendere 10 µ l della soluzione cella e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di blu di trypan. Place 15 µ l di questa soluzione in una camera di conteggio, poi contare il numero di cellule vitali (non colorato in blu) sotto un microscopio con un obiettivo 4x. Ripetere questa operazione per le altre fiale.</li>
		<li>Nel frattempo, centrifugare le provette da 15 mL a 110 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere le cellule a 700.000 cellule/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento in membrane amniotiche umane
	<ol>
<li>Rimuovere la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane dall'incubatrice.</li>
		<li>Aspirare il PBS. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 4.1.4 al centro dell'inserto cultura. Aggiungere 1 mL di mezzo RPE fuori l'inserto di cultura (all'interno del pozzo). Ripetere per le altre membrane.</li>
		<li>Posizionare la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane nell'incubatrice.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. il mantenimento di colture di cellule di epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane
<ol><li>Rinnovare il mezzo 2 x alla settimana, solitamente il lunedì e il venerdì, almeno fino al giorno 30 della cultura.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dentro e fuori l'inserto di cultura per ogni pozzetto e rinnovarlo con medium fresco (1 mL di fuori dell'inserto di cultura e 500 µ l all'interno). Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>6. preparazione della Patch di epitelio retinico del pigmento per trapianto
Nota: A partire da giorno 30 della cultura, il tessuto è pronto per il trapianto.
<ol><li>Caldo la soluzione 8% gelatina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. riempire la camera interna del vibratome con freddo CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C).</li>
	<li>
Inserire il blocco di 20% gelatina del vibratome.
	<ol>
<li>Prendere il piatto di cultura di 6 cm contenente il blocco di gelatina di 20% dal frigo. Usando un bisturi, tagliare un blocco di 5 cm x 5 cm. Incollare il lato superiore del blocco al supporto con colla del cianoacrilato o suo equivalente.</li>
		<li>Inserire una nuova lama in del vibratome.</li>
		<li>Regolare il livello del blocco finché è allo stesso livello della lama di rasoio.</li>
		<li>Riempire il bagno intorno al supporto con fresco CO2-mezzo indipendente a 4 ° C. Tagliare il blocco con il vibratome usando una velocità media fino a quando il blocco viene tagliato in modo uniforme, portando ad una superficie liscia. Impostare la posizione 0.</li>
		<li>Aspirare il terreno intorno al blocco di gelatina fino a quando è completamente asciutto e poi prendere la piastra di coltura 12-pozzetti contenenti i tessuti da incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Usando il forcipe, aprire con cautela l'inserto di cultura sulla parte superiore del blocco di gelatina. Taglio, con le forbici, tutte le parti delle membrane che non contengono celle (fuori dal ring dove le cellule non sono state coltivate). Aspirare l'intero medio residuo.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione 8% gelatina liquida a 37 ° C al fine di coprire le membrane. Rimuovere delicatamente l'eccesso. Aspettare 5-8 minuti per consentire la gelatina a solidificare.</li>
		<li>Aggiungere fresco CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C) per il bagno fino a quando la membrana è coperto.</li>
		<li>Taglio, con il vibratome in una posizione di-100 µm, con una velocità media, rimanendo consapevoli di come si comporta il blocco. Alla fine della sezione, fare attenzione a mantenere l'orientamento del tessuto.</li>
		<li>Con un bisturi, tagliare un angolo per identificare l'orientamento della sezione.</li>
		<li>Raccogliere la membrana incorporata in gelatina con una spatola e posizionarlo in una piastra a 6 pozzetti riempita con il mezzo di conservazione a 4 ° C, fino a quando l'innesto nell'occhio destinatario.</li>
		<li>Al momento del trapianto, regolare le dimensioni dell'impianto per la dimensione dell'occhio destinatario sotto un microscopio chirurgico (1 – 3 per i ratti, 10 – 15 mm2 per primati non umani).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968(2012).</li>
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<li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced%2C+dry+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
</ol>

Olivier Goureau è l'inventore su in attesa di brevetti relazionati alla generazione di cellule retiniche da cellule staminali pluripotenti umane. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un metodo per la coltura di cellule RPE su un'impalcatura biologica e la sua preparazione per l'impianto in modelli animali. Una delle fasi critiche del protocollo è il mantenimento dell'orientamento del prosciutto lungo tutta la procedura fino alla sua inclusione in gelatina. Infatti, viene rimosso l'epitelio nativo della membrana e relativa membrana dello scantinato diventa esposto9. Le cellule RPE devono essere seminati in cima a questa membrana dello scantinato. Al momento di...

RPE è cruciale per la sopravvivenza e l'omeostasi dei fotorecettori con cui è strettamente associato1. Diverse condizioni patologiche alterano la funzionalità e/o sopravvivenza, comprese la RP e AMD.
RP è un gruppo di mutazioni monogeniche ereditarie che colpiscono le funzioni di fotorecettori, cellule RPE o entrambi di2,3. Si stima che le mutazioni che interessano specificamente RPE cellule rappresentano il 5% di RP2. AMD è un'altra condizione dove lo strato RPE è alterato, leader perdita di visione in definitiva a centrale. AMD è causato da complesse interazioni di fattori genetici e ambientali e colpisce gli anziani4,5,6. Secondo le proiezioni, AMD sarà una preoccupazione per 196 milioni di pazienti nel mondo da 20207. Per questi disturbi, non esiste alcuna cura efficace, e una delle strategie proposte è il trapianto di nuove cellule RPE per compensare i morti/non funzionale preesistente di cellule RPE8.
La modalità di formulazione del prodotto finale per essere innestato è essenziale per garantire i migliori risultati funzionali. Le cellule RPE iniettate come una sospensione cellulare, pur essendo un metodo di consegna, facile e semplice sollevano preoccupazioni per quanto riguarda la loro sopravvivenza, integrazione e funzionalità9,10,11,12 , 13. gli scienziati ora stanno sviluppando più complesse formulazioni di consegnare ingegnerizzato tessuto retinico9,13,14,15,16. In questo contesto, abbiamo sviluppato un metodo originale per generare in vitro tessuto RPE che poteva essere utilizzato per il trapianto9.
Banche di cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (ES) sono utilizzate nel presente protocollo. Comunque, alternativa RPE cellula banche da fonti differenti delle cellule (cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, cellule RPE primarie, ecc.) e differenziato con un metodo diverso sono adatti anche per questo protocollo. Esso comprende differenziazione diretto protocolli mediante citochine e/o piccole molecole17,18,19,20,21,22.
Per essere trapiantati, il tessuto ingegnerizzato dovrebbe essere preparato su un ponteggio. Negli ultimi anni, diversi ponteggi sono stati sviluppati basandosi su un polimero o su una matrice di origine biologica13,23,24. Qui, il substrato biologico utilizzato è il prosciutto, ma altri substrati, come membrane Bruch denudate, potrebbero essere attuate. Il metodo qui descritto ha il vantaggio di usando un'impalcatura biologica che è più rilevante per l'ambiente nativo di RPE.
Cellule RPE di derivati da cellule ES umane sono coltivate per almeno 4 settimane al fine di essere completamente organizzato come un monostrato di ciottoli. In tale fase, l'epitelio ottenuta è funzionale e polarizzato9. Infine, come questo tessuto rughe facilmente, è incorporato in uno strato sottile di un vettore di idrogel per dargli più rigidità ed elasticità e per proteggerlo durante la procedura di iniezione. Questo prodotto è quindi conservato a 4 ° C fino ad innesto.

<table><tbody><tr><td>Cabina di biosicurezza sterile</td><td>TechGen International</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di smaltimento dei rifiuti liquidi per aspirazione</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2-controllato +37&nbsp; &deg; incubatore di cellule C</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; Pipetta L: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; Pipetta mL: P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C frigorifero</td><td>Liebherr</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Pinza (x2)</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo orizzontale</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>film di paraffina plastica</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 &; m filtro per siringa monouso</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>Siringa senza ago 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi 250 mL</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL provette Falcon sterili</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette Falcon sterili</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>inserto per coltura</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm di coltura cellulare: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Castorama</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Termolisina</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanolo (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo CO2-indipendente</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>membrana amniotica umana</td><td>Banca dei tessuti Ospedale St Louis (Parigi, Francia)</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Diverse condizioni patologiche dell'occhio influenzano la funzionalità e/o la sopravvivenza dell'epitelio retinico del pigmento (RPE). Questi includono alcune forme di retinite pigmentosa (RP) e degenerazione maculare senile (AMD). Terapia cellulare è una delle più promettenti strategie terapeutiche proposte per curare queste malattie, con già incoraggianti risultati preliminari in esseri umani. Tuttavia, il metodo di preparazione dell'innesto ha un impatto significativo su suoi esiti funzionali in vivo. Infatti, le cellule RPE innestate come una sospensione cellulare sono meno funzionale le stesse cellule trapiantate come un tessuto retinico. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per ingegnere RPE tessuto e la sua preparazione per un impianto in vivo . Cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti umane sono seminate su un supporto biologico, la membrana amniotica umana (prosciutto). Rispetto ai ponteggi artificiale, questo supporto ha il vantaggio di avere una membrana dello scantinato che è vicino alla membrana di Bruch cui cellule RPE endogene sono fissate. Tuttavia, la sua manipolazione non è facile, e abbiamo sviluppato diverse strategie per la sua corretta coltivazione e preparazione per l'innesto in vivo.

Prosciutti contengono uno strato epiteliale che deve essere rimossi prima della semina delle cellule RPE. Un trattamento enzimatico della membrana viene eseguito con la termolisina sotto agitazione. In ordine di non perdere la polarità della membrana (l'epitelio è su un lato), è fissato su un supporto quale composizione potrebbe essere diversa a seconda del provider (Figura 1A). L'adesione della membrana al suo sostegno in questa fase di verifica e se necessa...

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'autoterapia dell'occhio, ad esempio qual è l'efficacia di un tessuto bioingegnerizzato specificamente progettato in vivo. Con questa tecnica forniamo un metodo per produrre e modellare il tessuto retinico, nonché una strategia per l'elaborazione del tessuto per l'impianto dell'occhio in un modello animale. Inizia lavando da uno a quattro pezzi di membrana amniotica umana da 30 x 30 mm, o hAM.Fissare un'impalcatura di nylon due volte in 80 ml di PBS per lavaggio in un flacone da 250 ml su uno shaker, ad alta velocità per cinque minuti. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 40 ml di soluzione di termolisina funzionante a ciascun flacone e agitare i flaconi due volte per cinque minuti a 450 giri/min, seguiti da 30 secondi di vortice. Dopo il secondo ciclo di trattamento con Termolisina, lavare i pezzi altre due volte con 80 ml di PBS per lavaggio, come dimostrato.Quindi, utilizzare una lunga pinza sterile per trasferire gli hAM singolarmente, in un piatto di coltura da 10 cm, contenente 10 ml di PBS. Quindi posizionare una membrana con il nylon rivolto verso il basso in un secondo piatto di coltura di 10 cm di PBS e staccare

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Biologia dello sviluppo

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali.

Derivazione retina epitelio pigmentato (RPE) da pluripotenti indotte (IPS) Stem Cells dalle diverse dimensioni delle corpi embrionali

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Questo protocollo descrive come produrre cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) da cellule staminali pluripotenti. Il metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e di piccole molecole per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in RPE immaturi in quattordici giorni e RPE maturo, funzionale dopo tre mesi.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Il primate non umano (NHP) è un modello ideale per lo studio delle terapie cellulari retiniche umane a causa delle somiglianze anatomiche e genetiche. Questo manoscritto descrive un metodo per il trapianto submaculare di cellule epiteliali pigmentate retiniche nell'occhio NHP e strategie per prevenire le complicanze intraoperatorie associate alla manipolazione maculare.

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Scopri l'ingegneria del tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane per la medicina rigenerativa. Questo metodo consente di produrre tessuto retinico pronto per il trapianto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

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