Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'autoterapia dell'occhio, ad esempio qual è l'efficacia di un tessuto bioingegnerizzato specificamente progettato in vivo. Con questa tecnica forniamo un metodo per produrre e modellare il tessuto retinico, nonché una strategia per l'elaborazione del tessuto per l'impianto dell'occhio in un modello animale. Inizia lavando da uno a quattro pezzi di membrana amniotica umana da 30 x 30 mm, o hAM.

Fissare un'impalcatura di nylon due volte in 80 ml di PBS per lavaggio in un flacone da 250 ml su uno shaker, ad alta velocità per cinque minuti. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 40 ml di soluzione di termolisina funzionante a ciascun flacone e agitare i flaconi due volte per cinque minuti a 450 giri/min, seguiti da 30 secondi di vortice. Dopo il secondo ciclo di trattamento con Termolisina, lavare i pezzi altre due volte con 80 ml di PBS per lavaggio, come dimostrato.

Quindi, utilizzare una lunga pinza sterile per trasferire gli hAM singolarmente, in un piatto di coltura da 10 cm, contenente 10 ml di PBS. Quindi posizionare una membrana con il nylon rivolto verso il basso in un secondo piatto di coltura di 10 cm di PBS e staccare due delle quattro clip che fissano la membrana al nylon. Inserire l'anello più piccolo dell'inserto di coltura tra il nylon e la membrana, assicurandosi che la membrana copra completamente l'anello più piccolo.

Agganciare la seconda parte dell'inserto di coltura alla parte superiore della membrana in modo che la membrana basale dell'hAM sia rivolta verso l'alto con il lato destro rivolto verso l'alto nell'inserto di coltura e staccare le ultime due clip. Quindi utilizzare forbici sterili per tagliare qualsiasi membrana al di fuori dell'inserto di coltura, se necessario. E usa una pinza per trasferire la membrana in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, contenente PBS per la conservazione a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Prima della semina, scaldare le fiale criogeniche contenenti da 10 a una sesta cellula RPE in 3 ml di terreno RPE in un tubo conico da 15 ml per fiala. Quando le cellule si sono scongelate, pipettare per ottenere sospensioni di singole cellule in ciascuna delle provette e contare il numero di cellule vitali mediante esclusione blu tri pan. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet a sette volte 10 alla quinta concentrazione di cellule per millilitro in terreno RPE fresco.

Quindi, aspirare il PBS da ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti preparata e aggiungere 500 microlitri di cellule al centro di ciascun inserto di coltura e 1 ml di terreno RPE sul fondo di ciascun pozzetto. Quindi rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 30 giorni, cambiando il terreno due volte alla settimana fino alla fine della coltura. Il giorno 30 della coltura, scaldare una soluzione di gelatina all'8% a bagnomaria a 37 gradi Celsius, per 30 minuti.

E riempi la camera interna di un vibratomo con un mezzo indipendente da CO2 a quattro gradi Celsius. Usa un bisturi per tagliare un blocco di 5 cm per 5 cm da un blocco di gelatina al 20% conservato a quattro gradi Celsius. Fissare il lato superiore del blocco al supporto con un adesivo appropriato.

E posiziona una nuova lama nel vibratomo. Regolare il blocco fino a portarlo allo stesso livello della lama del rasoio e riempire il bagno attorno al supporto con un mezzo indipendente da CO2 a quattro gradi Celsius. Tagliare il blocco a una velocità media fino a quando il blocco non viene tagliato uniformemente con una superficie iniziale liscia e impostare la posizione su zero.

Quindi aspirare il terreno attorno alla gelatina fino a quando la gelatina non è completamente asciutta. E usa una pinza per aprire con cura un inserto di coltura seminato RPE sulla parte superiore del blocco. Utilizzare le forbici per rimuovere tutta la membrana all'esterno dell'anello di inserimento e aspirare l'intero volume di fluido residuo.

Aggiungere fino a 1 ml di soluzione di gelatina liquida all'8% sulla membrana fino a coprirla. E rimuovere con cura la gelatina in eccesso. Dopo cinque-otto minuti, aggiungere al bagno un mezzo fresco indipendente da CO2 a quattro gradi Celsius fino a coprire la membrana solidificata.

E con il vibratomo in posizione 100 micron, tagliare una sezione della membrana a velocità media, avendo cura di mantenere l'orientamento del tessuto. Tagliare un angolo della sezione con un bisturi per consentire l'identificazione dell'orientamento della sezione. E usa una spatola per trasferire la membrana incorporata nella gelatina in una delle piastre a sei pozzetti, riempite con un mezzo di conservazione a quattro gradi Celsius.

L'orientamento della fetta poteva essere invertito a causa del movimento libero prima del taglio dell'angolo. Quindi fai attenzione a fissare la posizione della fetta subito dopo la sezione. La dimensione dell'impianto può quindi essere regolata in base alle dimensioni dell'occhio ricevente al microscopio operatorio, prima del trapianto.

In genere rimangono alcune cellule morte sulla superficie della membrana, dopo la fissazione sull'inserto di coltura, ma tali cellule vengono eliminate quando si cambia il terreno di coltura. Le fibre della membrana basale sono visibili a un ingrandimento maggiore quando non rimangono cellule, indicando che il periodo di trattamento con termolisina è stato ottimizzato. L'epitelio retinico diventa più facile da vedere al microscopio, man mano che matura, formando un monostrato completo simile a un ciottolo a tre settimane.

A quattro settimane, l'epitelio è abbastanza maturo per essere preparato per l'impianto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che lo stato della gelatina dipende dalla temperatura. Quindi fai attenzione a seguire rigorosamente le temperature consigliate.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della terapia con cellule staminali, per esplorare il potenziale terapeutico di un tessuto bioingegnerizzato in un modello animale di retinite pigmentosa. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per preparare un tessuto sopra un'impalcatura, per il suo successivo trapianto, può anche essere applicato a sistemi più complessi contenenti strati di fotorecettori. In generale, gli individui che si avvicinano per la prima volta a questo metodo avranno difficoltà a gestire le membrane amniotiche umane, che sono molto sottili e tendono a piegarsi facilmente.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di fissazione della membrana amniotica umana e di inclusione della gelatina sono difficili da apprendere e richiedono un particolare approccio di manipolazione.