Name: Valutazione globale dellefficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri un sistema innovativo per valutare l'efficacia e la sicurezza del rilascio di farmaci mirati alla placenta utilizzando imaging in vivo, ultrasuoni ad alta frequenza e HPLC. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale dello sviluppo fetale e placentare nei topi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione nazionale di scienze naturali (81771617) e la scienza naturale Fondazione della provincia di Guangdong (2016A030313178) assegnato a X.F.; una sovvenzione dalla Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) assegnato a X.F; Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo sviluppo umano del National Institutes of Health, sotto Premio numero R01HD088549 (il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il funzionario viste del National Institutes of Health) di N.N.

Tutti gli esperimenti del mouse seguito rigorosamente i protocolli (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Accademia cinese delle scienze.
1. sintesi di nanoparticelle mirate A lipido-polimero placentare Condroitin solfato
<ol><li>Sintetizzare MTX - e ICG-caricati del lipido-polimero nanoparticelle (MNPs e INPs rispettivamente) e nanoparticelle plCSA-BP-coniugato (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) come descritto dettaglio altrove18.</li>
</ol>2. in vivo Imaging di fluorescenza
<ol><li>
Preparazione dei topi incinto
	<ol>
<li>Posizionare i topi femminili CD-1 (8-12 settimane) con un maschio fertile dello stesso ceppo in una gabbia (maschio: femmina = 1:2) nel pomeriggio e controllo vaginale spine la seguente mattina. Se un plug vaginale è osservato, definire il mouse come giorno embrionale 0.5 (0.5).</li>
		<li>Topi casa incinto da sola in una stanza senza agente patogeno animale con una h di luce/10 h 14 scuro ciclo e forniscono l'accesso gratuito per cibo e acqua fino e 14.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Iniezione endovenosa di nanoparticelle
	<ol>
<li>Prima della procedura, è necessario sterilizzare le nanoparticelle mediante filtrazione attraverso un filtro di 0,22 μm siringa. Pesare il mouse incinto a E11.5 per determinare la quantità e il volume di iniezione delle nanoparticelle. Nota: Il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere meno dell'1% (peso/volume) del peso corporeo del mouse incinto. Ad esempio, il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere inferiore a 0,25 mL in un mouse di 25 g.</li>
		<li>Per dilatare la vena della coda, caldo la coda per 5-10 min con un rilievo di riscaldamento.</li>
		<li>Prima dell'iniezione, aspirare l'INPs o plCSA-INPs in una siringa da insulina 28 g.</li>
		<li>Trasferire il mouse incinto per un dispositivo che trattiene il mouse, consentendo un accesso alla vena della coda. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Quindi inserire la siringa nella vena caudale. Iniettare lentamente l'INPs o plCSA-INPs (equivalente ICG di 5mg/kg) con pressione uniforme sopra 5-10 s. Nota: Interrompere l'iniezione se un blister appare sulla coda perché questo risultato indica che l'ago non è nella vena. Siringhe non devono essere condivise tra topi per minimizzare la trasmissione di malattia e la contaminazione incrociata.</li>
		<li>Registrare il tempo di iniezione. Nel frattempo, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia si ferma, che richiede normalmente 30-60 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vivo imaging
	<ol>
<li>30 min dopo l'iniezione, i topolini incinto usando la fluorescenza in vivo imaging sistema di immagine.</li>
		<li>Anestetizzare i topi incinto con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min e isoflurano al 2-4% in un alloggiamento associato dell'unità anestesia e verificare l'anestesia completo di lento e respiro regolare. Quindi, spostarli nella camera di imaging. Posizionare i topi anestetizzati incinto nella camera di imaging, tenere gli animali in posizione supina.</li>
		<li>Posizionare un cono di naso sopra la bocca e il naso per consentire l'inalazione di isoflurane 1-2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia.</li>
		<li>Selezionare parametri 2D-fluorescenza e fotografici all'immagine i segnali di fluorescenza di ICG. Impostare l'esposizione di auto e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 710/820 nm.</li>
		<li>Al termine della procedura di imaging, spegnere l'afflusso di isoflurane per interrompere l'anestesia e attentamente tornare i topi incinto loro gabbie.</li>
		<li>48 h dopo l'iniezione delle nanoparticelle, anestetizzare i topi incinto con isofluorano e quindi sacrificare la diga di dislocazione cervicale. Raccogliere i feti e placente utilizzando Graefe pinze, pinze di Graefe e forbici di dissezione.</li>
		<li>Posizionare le placente e feti nella camera di imaging e immagine utilizzando il metodo descritto al punto 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HFUS valutazione dello sviluppo embrionale
<ol><li>
Modelli animali
	<ol>
<li>Ottenere e preparare i topi incinto come descritto al punto 2.1.</li>
		<li>Utilizzare HFUS ai topi incinta immagine a E 6,5 (protocolli 3.2 e 3.3.3). In primo luogo, conferma gravidanza visualizzando embrioni il giorno E6.5 e quindi allocare in modo casuale i topi incinto in tre gruppi: il gruppo MNP, plCSA-MNP gruppo e gruppo di tampone fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Iniettare PBS, MNPs o plCSA-MNPs (1 mg/kg equivalente di MTX) nelle vene dei topi incinta coda ogni giorno a partire da E6.5 come descritto al punto 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione per l'imaging
	<ol>
<li>24 h dopo l'iniezione di nanoparticelle, immagine i topi incinto utilizzando il HFUS sistema di imaging.</li>
		<li>Anestetizzare i topi incinto come descritto al punto 2.3.2. Attivare i controlli di temperatura integrato della piattaforma imaging e preriscaldare la piattaforma a 37-42 ° C. Fissare i topi incinto in posizione supina sulla piattaforma usando del nastro.</li>
		<li>Posto il cono di naso collegato all'unità di anestesia sopra il muso. Applicare isoflurano 2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia costante.</li>
		<li>Rimuovere chimicamente i capelli dall'addome usando una crema depilatoria. Spazzare via la crema residua accuratamente con una garza imbevuta di acqua e poi ricoprire l'addome con gel di accoppiamento acustico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura di imaging
	<ol>
<li>Posizionare il trasduttore di 40 MHz nel braccio meccanico.</li>
		<li>Regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini longitudinale del feto e della placenta con la regione di interesse che si trova nella zona focale.</li>
		<li>
Analisi e formazione immagine B-Mode Nota: Vedere film 1.<ol>
<li>Fare clic sul pulsante B-Mode e abbassare il trasduttore sopra l'addome, fino a quando il feto e la placenta entrare in vista. Premere Scansione/Freeze per avvio/arresto imaging, premere Cine memorizzare per memorizzare il ciclo di cinematografia e premere telaio memorizzare per memorizzare immagini telaio.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante di misura per analizzare la lunghezza sac gestational (GS), lunghezza della groppa di corona fetale (CRL), diametro biparietale (BPD), circonferenza addominale (AC), diametro placenta (PD) e spessore placenta (PT).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Analisi e PW-Doppler imaging Nota: Vedere film 1.<ol>
<li>Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante PW , posizionare la casella di volume di campionamento al centro dell'arteria ombelicale e premere Scan/Freeze per avviare la formazione immagine. Fare clic su Cine memorizzare per raccogliere immagini di arteria ombelicale.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la velocità di picco dell'arteria ombelicale (UA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Analisi e formazione immagine di Doppler modalità colore
		<ol>
<li>Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante colore e regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini del cuore fetale. Premere scansione/freeze per avviare imaging e Cine memorizzare per raccogliere immagini.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la frequenza cardiaca fetale (HR).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi HPLC
<ol><li>
Preparazione tessuto
	<ol>
<li>Iniettare i topi incinto con una singola dose di MNPs o plCSA-MNPs (equivalente MTX di 1 mg/kg) a fine gravidanza (ad es., e 14.5) come descritto al punto 3.1.3.</li>
		<li>Dopo 24 h, anestetizzare i topi tramite un'iniezione intraperitoneale di avertin alle 240 μg/peso (g). Non garantire nessuna risposta a un pizzico di piede per verificare che i topi sono completamente anestetizzati.</li>
		<li>Spruzzare la zona del torace con etanolo al 75%. Eseguire perfusione cardiaca (tagliare gli atri destro e irrorare attraverso il ventricolo sinistro) come precedentemente descritto in dettaglio19,20 con 50 mL di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata per 10 min rimuovere le nanoparticelle non associate.</li>
		<li>La diga di eutanasia. Eseguire un taglio cesareo per raccogliere i feti e placente usando il forcipe di Graefe, dissezione Forbici e pinze di Graefe e conservare i tessuti a-80 ° C prima dell'analisi.</li>
		<li>Preparare la soluzione di omogeneizzazione (10% acido perclorico) e tenere il ghiaccio. Raccogliere circa 200 mg di tessuto e aggiungere 500 μL di soluzione di omogeneizzazione per ogni campione. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore a tutta velocità per 30 s e ripetere questa procedura due volte.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 14.000 × g per 20 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante (circa 300 μL) attraverso una siringa filtro 0,45 μm e trasferire il liquido risultante a un flacone HPLC. Inserire fiale del campione in un vassoio di autocampionatori per iniezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di standard di
	<ol>
<li>Preparare la seguente soluzione per la fase mobile: 40mm potassio fosfato bibasico (pH 4,5) e acetonitrile (88:12, v/v). Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa dimensione dei pori 0,45 μm e trasferire il liquido risultante in una bottiglia pulita del serbatoio HPLC. Nota: Regolare il pH con acido fosforico 0.1 M. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 min per degassare la fase mobile ogni volta prima di utilizzare.</li>
		<li>Pesare 10 mg di MTX in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di idrossido di sodio 1 M.</li>
		<li>Vortice ad alta velocità fino a quando il MTX si dissolve completamente. Nota: Questo è lo stock di primario e possa essere conservato a-20 ° C per diversi mesi.</li>
		<li>Per creare lo stock MTX secondario (500 μg/mL), diluire 50 μL dello stock primario a 950 μL della fase mobile. Nota: Conservare il ghiaccio fino all'utilizzo e preparati freschi ogni giorno. È importante utilizzare la fase mobile per l'elaborazione di norme per evitare picchi derivanti da miscelare dissimili soluzioni dopo l'iniezione del campione.</li>
		<li>Effettuare ulteriori diluizioni per creare gli standard (tabella 1). Conservare gli standard sul ghiaccio e preparare freschi ogni giorno. Eseguire le norme della serie con i campioni sperimentali.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Numero</td>
			<td>Concentrazione finale (μg/mL)</td>
			<td>ΜL di standard, 500 μg/mL</td>
			<td>Mobile phase(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>998</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>980</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>800</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Preparazione della curva standard per MTX. La concentrazione finale della soluzione standard di MTX è da 0,5 a 100 μg/mL.
<ol start="3"><li>
Strumentazione HPLC e parametri di funzionamento Nota: I campioni sono stati analizzati su un sistema HPLC dotato di pompa solvente, un rivelatore spettrofotometrico UV (313 nm) e una colonna C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm granulometria).<ol>
<li>Accendere il degassificatore di HPLC per eliminare l'aria dal sistema. Attivare il flusso, equilibrare la colonna con la fase mobile per 30 min per ridurre il rumore della linea di base.</li>
		<li>Impostare la temperatura della colonna a 25 ° C, iniettare 20 volumi μL del campione ad una portata di 1 mL/min e scegliere il Metodo Run per avviare l'analisi.</li>
		<li>Quando le piste sono state completate, modificare manualmente la fase mobile acetonitrile di grado HPLC. Eseguire per circa 15 min proteggere il sistema. Nota: Per eseguire questo passaggio dopo il tempo di esercizio raccomandato potrebbe comportare danni alla colonna.</li>
		<li>Per l'analisi quantitativa, calcolare le aree sotto le cime MTX standard di interesse utilizzando il software di sistema HPLC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+of+Factor+V+Leiden+and+Prothrombin+Gene+Mutation+and+Placenta-Mediated+Pregnancy+Complications%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis+of+Prospective+Cohort+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies.</a> PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).</li>
<li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+thrombophilia+and+pregnancy+complications+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited.</a> Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).</li>
<li>Brenner, B., Aharon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombophilia+and+adverse+pregnancy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Thrombophilia and adverse pregnancy outcome.</a> Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).</li>
<li>Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+addressability+of+global+disease+burden+in+maternal+and+perinatal+health+by+investment+in+R%26D%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+%26+International+Health%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D.</a> Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).</li>
<li>Fisk, N. M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Market+failure+and+the+poverty+of+new+drugs+in+maternal+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Market failure and the poverty of new drugs in maternal health.</a> PLOS Medicine. 5 (1), e22(2008).</li>
<li>Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticle+delivery+of+doxorubicin+into+placental+tissues+to+treat+ectopic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies.</a> Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).</li>
<li>King, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-homing+peptides+as+tools+for+targeted+delivery+of+payloads+to+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta.</a> Science Advances. 2 (5), e1600349(2016).</li>
<li>Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Homing+Peptide-microRNA+Inhibitor+Conjugates+for+Targeted+Enhancement+of+Intrinsic+Placental+Growth+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling.</a> Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).</li>
<li>Cureton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Targeting+of+a+Novel+Vasodilator+to+the+Uterine+Vasculature+to+Treat+Impaired+Uteroplacental+Perfusion+in+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy.</a> Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).</li>
<li>Paul, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+human+and+mouse+uterus+using+immunoliposomes+targeted+to+the+oxytocin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-specific+drug+delivery+by+trophoblast-targeted+nanoparticles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice.</a> Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+placenta-specific+transgene+expression+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging.</a> PloS One. 6 (1), e16348(2011).</li>
<li>Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+surface-modified+liposomes+to+evaluate+their+behavior+after+pulmonary+administration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).</li>
<li>Ito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+whole-body+multimodality+imaging+of+gastric+cancer+peritoneal+metastasis+combining+fluorescence+imaging+with+ICG-labeled+antibody+and+MRI+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).</li>
<li>Mazza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-Indocyanine+Green+Nanoprobes+for+Optical+Labeling+and+Tracking+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+Post-Transplantation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+ultrasound+for+in+vivo+pregnancy+diagnosis+and+staging+of+placental+and+fetal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice.</a> PloS One. 8 (10), e77205(2013).</li>
<li>Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound+database+profiling+growth%2C+development%2C+and+cardiovascular+function+in+C57BL%2F6J+mouse+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/58209/synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa">Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+the+central+nervous+system+of+rats+with+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 527(2007).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1367593103001091">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+staging+of+spontaneous+embryo+resorption+by+ultrasound+biomicroscopy+in+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).</li>
<li>Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+high-frequency+ultrasonography+to+evaluate+cardiovascular+and+uteroplacental+blood+flow+in+mouse+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pregnancy+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy.</a> Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).</li>
<li>Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+ultrasonographic+characterization+of+phenotypic+changes+during+embryo+development+in+non-anesthetized+mice+of+different+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes.</a> Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).</li>
<li>Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+%CE%B23+integrin+by+targeted+ECO%2FsiRNA+nanoparticles+inhibits+EMT+and+metastasis+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+doxorubicin+by+CSA-binding+nanoparticles+for+choriocarcinoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment.</a> Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).</li>
<li>Jenkins, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+%28BLI%29+to+improve+and+refine+traditional+murine+models+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).</li>
<li>Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+safety+considerations+of+nanoparticle-mediated+drug+delivery+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy.</a> Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).</li>
</ol>

X.F. e B.Z. inventori su domanda di brevetto PCT/CN2017/108646 presentato da SIAT che riguarda un metodo di consegna di droga placenta-specifico e la sua applicazione. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

In questo manoscritto, delineiamo un sistema di tre-metodo per determinare se le nanoparticelle plCSA-BP-guida sono uno strumento efficace per la consegna di farmaci alla placenta di targeting. L'uso di in vivo imaging per monitorare il segnale a infrarossi fluorescente ICG confermato la specificità di targeting placenta di plCSA-BP. Using HFUS e HPLC, abbiamo dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato possono fornire in modo efficiente MTX solo per il cellule della placenta, non per il feto.
<p class=...

Complicazioni di gravidanza placenta-mediata, tra cui pre-eclampsia, la perdita di gravidanza, distacco della placenta e piccola età gestazionale (SGA), sono comuni e portare a sostanziale morbilità materna e fetale e mortalità1,2, 3e molto pochi farmaci hanno dimostrato di essere efficace per il trattamento di gravidanza disturbi4,5. Lo sviluppo di strategie per la consegna di droga placenta-mirati più selettivi e più sicura durante la gravidanza rimane impegnativo nella terapia farmacologica moderna.
Negli ultimi anni, parecchi rapporti sono concentrati sulla somministrazione mirata di farmaci di uteroplacental tessuti di rivestimento di nanoparticelle con peptidi o anticorpi come strumenti di targeting per placenta. Questi includono un anticorpo di anti-fattore di crescita recettore (EGFR)6 , tumore-homing peptidi (CGKRK e iRGD)7, placenta-mirato peptidi8, peptidi di targeting per sistema vascolare placentare9 e gli anticorpi contro il L'ossitocina del ricevitore10.
Qui, dimostriamo che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) può essere utilizzato per la somministrazione mirata di nanoparticelle e loro carichi di droga di placenta11. Le nanoparticelle plCSA-BP-guidati sono complementari alla uteroplacental segnalati metodi di targeting, perché prendono di mira il trofoblasto placenta.
Come un metodo non invasivo, in vivo imaging è stato utilizzato per monitorare l'espressione genica placenta-specifica in topi12e verde di indocianina (ICG) è stato ampiamente utilizzato per tenere traccia di nanoparticelle utilizzando sistemi13, di formazione immagine di fluorescenza 14,15. Così, abbiamo iniettato per via endovenosa plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricate con ICG (plCSA-INPs) per visualizzare la distribuzione di plCSA-INP in topi incinta con un imager di fluorescenza. Abbiamo quindi iniettato per via endovenosa di methotrexate (MTX)-caricato plCSA-NPs in topi incinti. L'ultrasuono ad alta frequenza (HFUS), un altro non-invasiva, in tempo reale strumento16,di imaging17 è stato utilizzato per monitorare lo sviluppo fetale e placenta nei topi. Infine, abbiamo usato ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) per quantificare la distribuzione di MTX in placente e feti.
In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente il sistema di tre-metodo utilizzato per valutare l'efficienza di consegna della droga placenta-mirati da nanovettori plCSA-BP-guidata.

<table><tbody><tr><td>CD-1 topi</td><td>Beijing Vital River</td><td>201</td><td>Femmina (8-12 settimane)</td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>BD</td><td>328421</td><td>per iniezione endovenosa</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Sinopharm 10009218 chimico</td><td></td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Lecitina di soia</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Processore ad ultrasuoni</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Metotrexato (MTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900324</td><td>per la sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Verde indocianina (ICG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1340009</td><td>per in vivo soluzione</td></tr><tr><td>salina tamponata con fosfato per imaging (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di spettro IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>per l'imaging in vivo</td></tr><tr><td>Gel per trasmissione di ultrasuoni</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>per l'imaging ecografico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Lunan Pharmaceutical</td><td>I0040</td><td>per mantenere l'anestesia</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td>TMG001</td><td>per la rimozione del</td></tr><tr><td>trasduttore a 40 MHz</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>per ecografia</td></tr><tr><td>Sistema di ecografia ad alta frequenza</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>per ecografia</td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>per anestesia</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>per perfusione cardiaca</td></tr><tr><td>soluzione salina allo 0,9%</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>per perfusione cardiaca</td></tr><tr><td>1,5 mL Provette in polipropilene</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>per la precipitazione delle proteine</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Filtro per siringhe (0,45 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sinopharm</td><td>10019763</td><td>chimico per la soluzione di</td></tr><tr><td>fiale MTX HPLC</td><td>Acque</td><td></td><td>670650620 per HPLC</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sinopharm 20032117 chimico</td><td></td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>JKchemical</td><td>932537</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>C18 colonna</td><td>Acque</td><td>186003966</td><td>per HPLC</td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>per HPLC</td></tr></tbody></table>

valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di placenta-targeted drug delivery utilizzando tre metodi complementari

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Nessun trattamenti efficaci attualmente esistenti per le complicazioni di gravidanza placenta-collegata, e lo sviluppo di strategie per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta, riducendo al minimo gli effetti collaterali materni e fetali rimane impegnativo. I vettori delle nanoparticelle mirate fornire nuove opportunità per trattare i disordini placentari. Recentemente abbiamo dimostrato che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) potrebbe essere usato per guidare le nanoparticelle per consegnare i farmaci alla placenta. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente un sistema per valutare l'efficienza di consegna della droga alla placenta di plCSA-BP che impiega tre metodi distinti utilizzati in combinazione: in vivo imaging, ultrasuono ad alta frequenza (HFUS) e ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC). Utilizzo in vivo imaging, plCSA-BP-guidata nanoparticelle sono state visualizzate in placente di animali vivi, mentre HFUS e HPLC ha dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato in modo efficiente e in particolare consegnato metotrexato alla placenta. Così, una combinazione di questi metodi può essere utilizzata come strumento efficace per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta e lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per diverse complicazioni di gravidanza.

In questo manoscritto, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricato con MTX (plCSA-MNPs) o ICG (plCSA-INPs) sono state iniettate per via endovenosa in topi incinti. In vivo imaging ha rivelato segnali forti di ICG nella regione dell'utero 30 min dopo l'iniezione plCSA-INP. L'INPs sono stata localizzata principalmente nella regione di fegato e milza (Figura 1A). A 48 h dopo l'iniezione plCSA-INP, incinto topi sono stati sacrificati, rivelando ICG segnal...

Descriviamo un sistema che utilizza tre metodi per valutare la sicurezza e l'efficacia della somministrazione di farmaci mirati placenta: in vivo imaging per monitorare l'accumulo delle nanoparticelle, ultrasuono ad alta frequenza per monitorare lo sviluppo placenta e fetale e HPLC per quantificare la consegna della droga al tessuto.

Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nanomedicina sull'efficacia e la sicurezza del farmaco caricato su nanoparticelle somministrate alla madre e al feto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita una misurazione biochimica accurata della quantità di farmaco erogato alla placenta. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle complicanze della gravidanza mediate dalla placenta perché è importante garantire un targeting preciso della somministrazione del farmaco alla placenta.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la valutazione ecografica ad alta frequenza dello sviluppo embrionale richiede pazienza ed esperienza per essere padroneggiata. Per l'iniezione endovenosa di nanoparticelle, trasferire una topolina gravida Embryonic Day 14.5 con vene caudali dilatate al calore in un sistema di ritenuta e pulire la coda con un tampone imbevuto di alcol. Quindi inserire la punta dell'ago di una siringa da insulina calibro 28 in una vena della coda dilatata e premere lentamente lo stantuffo per 5-10 secondi con una pressione uniforme per erogare le nanoparticelle nella vena della coda.30 minuti dopo

comprehensive-evaluation-effectiveness-safety-placenta-targeted-drug

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Gemello-gemello sindrome di trasfusione e doppia sequenza policitemia anemia sono due problemi potenzialmente devastanti in medicina perinatale. Entrambi i disturbi si verificano solo in gemelli monocoriali e il risultato di flusso di sangue placentare sbilanciato attraverso anastomosi vascolari. Forniamo un semplice protocollo per valutare con precisione la presenza di anastomosi vascolari mediante iniezione di colore tintura dei vasi placentari dopo la nascita.

La valutazione accurata e semplice delle anastomosi vascolari in placenta monocoriale con colorante

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Ex vivo di imaging intero organo è un metodo rapido per determinare le concentrazioni relative dei composti fluorescente all'interno e tra tessuti o gruppi di trattamento. Al contrario, la fluorescenza istologia quantitativa, mentre più alta intensità di lavoro, consente la quantificazione dei livelli tissutali assoluti di molecole marcate.

L'impiego di Ex Vivo Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Presentiamo un metodo dettagliato per studiare la fisiologia placentare umana in vivo a termine. Il metodo combina il campionamento di sangue dai vasi in entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta con misurazioni a ultrasuoni del flusso di sangue del volume e del campionamento dei tessuti placentari.

L&#39;approccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana<em&gt; In Vivo</em

Questo studio presenta un protocollo per il tessuto reversibile di compensazione, immunostaining, 3D-rendering e analisi di reti vascolari nei campioni di villi di placenta umana nell'ordine di 1-2 mm3.

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.

Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare e valutare la funzione citotossica delle cellule killer naturali da placenta da un saggio di placca colorimetrica. La riduzione della pressione di perfusione uterina modello ratto di ischemia placentare è stato scelto per dimostrare l'isolamento mediato da anticorpi e la valutazione della funzione citotossica delle cellule Natural Killer.

Un saggio di citotossicità a base di piastre per la valutazione della funzione citolitica della cellula killer naturale del ratto placentare

Qui viene presentato un protocollo di perfusione vascolare materna-fetale ex vivo per consentire la somministrazione di un articolo di prova nella vascolarizzazione materna e per valutare il trasferimento placentare di particelle xenobiotiche o agenti farmacologici oltre alle alterazioni in fisiologia placentare.

Perfusione ex vivo della placenta del roditore

Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l'iniezione e l'elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.

Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo

Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.

Rottura della barriera emato-encefalica del topo da piccole vescicole extracellulari da placente umane ipossiche

Scopri un sistema innovativo per valutare l'efficacia e la sicurezza del rilascio di farmaci mirati alla placenta utilizzando imaging in vivo, ultrasuoni ad alta frequenza e HPLC. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale dello sviluppo fetale e placentare nei topi.

Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

Esplora altri video