Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nanomedicina sull'efficacia e la sicurezza del farmaco caricato su nanoparticelle somministrate alla madre e al feto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita una misurazione biochimica accurata della quantità di farmaco erogato alla placenta. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle complicanze della gravidanza mediate dalla placenta perché è importante garantire un targeting preciso della somministrazione del farmaco alla placenta.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la valutazione ecografica ad alta frequenza dello sviluppo embrionale richiede pazienza ed esperienza per essere padroneggiata. Per l'iniezione endovenosa di nanoparticelle, trasferire una topolina gravida Embryonic Day 14.5 con vene caudali dilatate al calore in un sistema di ritenuta e pulire la coda con un tampone imbevuto di alcol. Quindi inserire la punta dell'ago di una siringa da insulina calibro 28 in una vena della coda dilatata e premere lentamente lo stantuffo per 5-10 secondi con una pressione uniforme per erogare le nanoparticelle nella vena della coda.

30 minuti dopo l'iniezione, posizionare la topolina incinta anestetizzata nella camera di imaging di un sistema di imaging a fluorescenza in vivo in posizione supina. Selezionare la fluorescenza 2D e i parametri fotografici appropriati per l'imaging dei segnali di fluorescenza verde indocianina e impostare l'esposizione su auto e le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 710 e 820 nanometri. Quindi immagina l'animale e riporta il topo incinta nella sua gabbia.

48 ore dopo l'iniezione, utilizzare la pinza Graefe, la pinza per tessuti Graefe e le forbici da dissezione per raccogliere i feti e le placente e visualizzare i tessuti prelevati come appena dimostrato per l'intero animale. Per la valutazione ecografica ad alta frequenza dello sviluppo embrionale, 24 ore dopo l'iniezione di nanoparticelle, fissare la madre gravida anestetizzata su una piattaforma di imaging ecografico preriscaldata da 37 a 42 gradi Celsius in posizione supina e posizionare il trasduttore da 40 megahertz nel braccio meccanico. Quindi regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini longitudinali del feto e della placenta con la regione di interesse all'interno della zona focale.

Per l'imaging e l'analisi in modalità B, selezionare la modalità B e abbassare il trasduttore sull'addome fino a quando il feto e la placenta non sono visibili. Fare clic su Scansione/Congela per avviare e interrompere l'imaging, su Cine Store per memorizzare il cine loop e su Frame Store per memorizzare le immagini del fotogramma. Quindi fare clic su Misura per analizzare la lunghezza del sacco gestazionale, la lunghezza della groppa della corona fetale, il diametro biparietale, la circonferenza addominale, il diametro placentare e lo spessore della placenta.

Per l'imaging e l'analisi Doppler dell'onda del polso, utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic su Colore, quindi selezionare Onda del polso e posizionare la casella del volume di campionamento al centro dell'arteria ombelicale. Fare clic su Scansione/Congela per avviare l'imaging e su Cine Store per raccogliere le immagini dell'arteria ombelicale. Quindi fare clic su Misura per calcolare la velocità di picco dell'arteria ombelicale.

Per l'imaging e l'analisi in modalità color Doppler, utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic su Colore e regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini del cuore fetale come dimostrato. Quindi fare clic su Misura per calcolare la frequenza cardiaca fetale del ciclo dell'immagine cine memorizzata. Per l'analisi della cromatografia liquida ad alta pressione, o HPLC, iniettare prima un topo gravido Embryonic Day 14.5 con una singola dose di nanoparticelle, come dimostrato.

Dopo 24 ore, perfondere il cuore dell'animale gravido con 50 millilitri di soluzione salina ghiacciata allo 0,9% per 10 minuti per rimuovere eventuali nanoparticelle non legate e raccogliere i feti e le placente per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Il giorno dell'analisi, aggiungere 500 microlitri di soluzione di omogeneizzazione appena preparata a ciascun campione di tessuto da 200 milligrammi e omogeneizzare i campioni due volte alla massima velocità per 30 secondi per dissociazione. Dopo la seconda omogeneizzazione, centrifugare i campioni e filtrare i surnatanti attraverso un filtro a siringa da 0,45 micrometri in una fiala HPLC.

Posizionare le fiale del campione in un vassoio per autocampionatore per l'iniezione e accendere il degasatore HPLC per rimuovere l'aria dal sistema. Quindi, attivare il flusso per bilanciare la colonna con la fase mobile per 30 minuti per ridurre il rumore di base e impostare la temperatura della colonna a 25 gradi Celsius. Quindi iniettare volumi di campione da 20 microlitri a una velocità di flusso di un millilitro al minuto entro 30 minuti e fare clic su Esegui metodo per iniziare l'analisi.

Al termine delle corse, passare manualmente alla fase mobile in acetonitrile di grado HPLC e far funzionare l'acetonitrile per circa 15 minuti per proteggere il sistema. L'imaging in vivo rivela forti segnali verdi di indocianina nel tessuto uterino 30 minuti dopo l'iniezione di nanoparticelle coniugate con fluorescenza legata alla condroitina solfato placentare, mentre le nanoparticelle non legate si localizzano principalmente nel fegato e nelle regioni spleniche. 48 ore dopo l'iniezione, si osserva un segnale fluorescente nella placenta di animali iniettati con nanoparticelle legate alla condroitina solfato placentare, senza alcun segnale rilevato all'interno del feto.

Il monitoraggio ecografico ad alta frequenza di animali iniettati con nanoparticelle coniugate con fluorescenza legata alla condroitina solfato placentare rivela una riduzione significativa dei principali punti di riferimento dello sviluppo fetale e placentare. È interessante notare che il trattamento con nanoparticelle legate al metotrexato compromette anche leggermente lo sviluppo fetale e placentare, indicando che le nanoparticelle possono migliorare la consegna di metotrexato alla placenta attraverso l'aumento della permeabilità e dell'effetto di ritenzione. La misurazione delle concentrazioni di metotrexato mediante HPLC indica un tempo di ritenzione di sette minuti all'interno della placenta di topi iniettati con nanoparticelle legate al metotrexato.

24 ore dopo l'iniezione, i livelli di metotrexato placentare nel gruppo iniettato con nanoparticelle legate al metotrexato sono significativamente inferiori a quelli misurati nel gruppo di condroitina solfato placentare e nel gruppo di nanoparticelle legate al metotrexato, senza che il metotrexato sia rilevato nei feti di quest'ultimo. Il metotrexato può ancora essere rilevato nella placenta 48 ore dopo l'iniezione di condroitina solfato placentare e di nanoparticelle legate al metotrexato, dimostrando che il condroitina solfato placentare e le nanoparticelle legate al metotrexato non possono attraversare la placenta, riducendo così al minimo i potenziali effetti avversi sul feto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la placenta inizia a formarsi intorno al giorno embrionale 9 1/2, e quindi l'esperimento di imaging in vivo è meglio eseguito il giorno embrionale 10 1/2 o più tardi.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione e l'analisi immunofluorescente per rispondere a ulteriori domande sulla localizzazione delle nanoparticelle all'interno della placenta. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina riproduttiva per esplorare la possibilità di un trattamento mirato alla placenta nelle complicanze della gravidanza.