Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

È descritta una procedura di isolamento di RNA (viaggio) tandem per il recupero dei complessi in modo endogeno formato mRNA-proteina. In particolare, complessi RNA-proteina sono reticolate in vivo, poliadenilazione RNAs sono isolati dagli estratti con i branelli di oligo e particolare mRNA vengono catturati con oligonucleotidi antisenso RNA modificati. Proteine legate a mRNA vengono rilevati dall'analisi del immunoblot.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione dell'espressione genica, come ad esempio il modo in cui le proteine leganti l'RNA si assemblano su particolari RNA in vivo e quindi impongono la regolazione genica post-trascrizionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non necessita di alcuna clonazione o manipolazione genetica. Può essere adattato a qualsiasi organismo modello o sottotipo.

Per progettare gli oligonucleotidi, analizzare la struttura secondaria dell'mRNA o di un suo frammento utilizzando strumenti online. Innanzitutto, inserisci la sequenza nucleotidica nella casella vuota, quindi nella casella Opzioni di base seleziona l'energia libera minima ed evita coppie di basi isolate. Nella casella Opzioni di output, selezionare il grafico interattivo della struttura secondaria dell'RNA e infine fare clic sul pulsante Procedi.

Apparirà una nuova finestra che mostra la struttura secondaria dell'mRNA di interesse. Selezionare almeno tre diverse sequenze lunghe da 21 a 24 nucleotidi all'interno dell'mRNA di interesse, preferibilmente in regioni prive di estese strutture secondarie e situate in regioni non tradotte a 3 numeri primi. Selezionare le regioni con un rapporto guanidina/citosina vicino al 50% e prive di ripetizioni tandem nucleotidiche per evitare la potenziale formazione di forcine o autoricottura.

Progettare manualmente oligonucleotidi di RNA modificati con 2-prime-metossi che portano una porzione di biotina al 3-prime che sono completamente complementari alle regioni selezionate all'interno dell'mRNA bersaglio desiderato. Utilizzare uno strumento online adatto per regolare la temperatura di fusione degli ibridi di RNA tra i 60 e i 65 gradi e avere una buona complessità di sequenza linguistica. Utilizza lo strumento di ricerca dell'allineamento locale di base per cercare una potenziale ibridazione incrociata di ASO con altri mRNA nel trascrittoma.

Seleziona Nucleotide BLAST, inserisci la sequenza nella casella vuota e seleziona l'organismo di interesse. Mantenete i parametri rimanenti come predefiniti e fate clic su BLAST. Incollare le cellule HEK293 al 70% di confluenza in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri mescolando due microgrammi del gene reporter con 20 microlitri di reagente di trasfezione e aggiungendole alle cellule.

Metti le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 48 ore prima della raccolta. Il giorno del raccolto, rimuovere il terreno con una pipetta sierologica e lavare rapidamente le cellule due volte con 10 millilitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungi sei millilitri di PBS al piatto e mettilo sul ghiaccio.

Quindi esporre le cellule alla luce UV a 100 millijoule per centimetro quadrato in un reticolante UV. Dopo l'esposizione ai raggi UV, raschiare le cellule e il PBS e trasferirli in una provetta da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 250 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver rimosso il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule in due millilitri di tampone di lisi pre-raffreddato pipettando su e giù cinque o sei volte mantenendo la provetta in ghiaccio. Trasferire il lisato con una pipetta in una provetta da cinque millilitri posta sul ghiaccio e sonicare per tre cicli costituiti da raffiche di 20 secondi a un'ampiezza di 10 micron con 30 secondi di periodi di raffreddamento sul ghiaccio. Dopo aver trasferito il lisato in provette da due millilitri, centrifugare a 15.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta. Per iniziare l'isolamento dell'RNA, equilibrare un milligrammo di biglie magnetiche oligo(dT)accoppiate in 500 microlitri di tampone di lisi. Rimuovere la provetta dal rotatore, posizionarla su una rastrelliera magnetica e rimuovere il tampone di lisi.

Combina quattro milligrammi di estratto proteico HEK293 con le microsfere magnetiche accoppiate all'oligo(dT)25. Mescolare energicamente i campioni, quindi incubare per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Posizionare le provette su un supporto magnetico per 10 secondi, quindi rimuovere il surnatante.

Mantenere il surnatante sul ghiaccio per i successivi cicli di recupero. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio A alle perle e vorticare per cinque secondi. Raccogliere le perle con un magnete e poi lavare le perle due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio B.To eluire l'RNA, aggiungere 30 microlitri di Tris-HCl da 10 millimolari e incubare la provetta a 80 gradi Celsius per due minuti agitando continuamente a 1.000 giri/min.

Trasferire la provetta direttamente sul supporto magnetico e raccogliere l'eluato il più rapidamente possibile dopo circa 10 secondi per evitare il potenziale rilegame degli mRNA alle perle a temperature più basse. Gli eluati di cicli ripetuti vengono quindi combinati e possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. Per catturare mRNA specifici, aggiungere 30 microlitri di biglie magnetiche accoppiate con streptavidina a un millilitro di tampone di legame e lavaggio contenente 0,1 milligrammi per millilitro di RNA di trasferimento di E.coli.

Equilibrare su un rotatore per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, lavare le perle tre volte con 750 microlitri di legante e tampone di lavaggio. Agitare il tubo, quindi rimuovere il tampone B&W, quindi risospendere in 30 microlitri di tampone e tenere in ghiaccio fino all'uso.

Diluire circa 35 microgrammi di proteine totali dal precedente poli(A)isolamento in 100 microlitri di tampone di legame e lavaggio, quindi aggiungere 200 picomoli dell'oligonucleotide antisenso appropriato e incubare a 70 gradi Celsius per cinque minuti per facilitare la ricottura. Rimuovere l'intero blocco termico dal dispositivo e posizionarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per farlo raffreddare lentamente. Successivamente, aggiungere al campione i 30 microlitri di perle magnetiche equilibrate accoppiate con streptavidina, quindi incubare la miscela per 30 minuti a 25 gradi Celsius agitando costantemente a 950 giri/min in un mixer.

Posizionare il tubo sul supporto magnetico, rimuovere il surnatante e lavare le perle tre volte con 750 microlitri di legante preriscaldato e tampone di lavaggio a 55 gradi Celsius. Aggiungere 20 microlitri di Tris-HCl da 10 millimolari e posizionare a 90 gradi Celsius agitando costantemente a 950 giri/min per 10 minuti per eluire l'RNA. Dopo 10 minuti, posizionare il tubo nel supporto magnetico e raccogliere immediatamente l'eluato.

Si tratta di un gel di agarosio utilizzato per la rilevazione di mRNA con RT-PCR utilizzando primer specifici dopo cattura con oligo(dT) e un oligonucleotide antisenso a p27 mRNA da estratto di cellule HEK293. Viene mostrato anche un controllo senza oligonucleotidi antisenso. Le corsie di ingresso mostrano l'RNA totale dalle cellule reticolate.

Inoltre, vengono mostrati anche i risultati della competizione con poly(A). Qui è mostrata un'analisi immunoblot di proteine legate all'mRNA con anticorpi che rilevano l'antigene umano R, la proteina legante l'RNA sconosciuta e la beta-actina, che è una proteina di controllo negativa. Il blot mostra che l'antigene umano R è stato rilevato con successo in isolati di poli(A)RNA dopo la cattura di mRNA p27 con oligonucleotidi antisenso.

L'antigene umano R non è stato rilevato negli isolati di controllo senza oligonucleotide antisenso. Le corsie di input mostrano le proteine nell'estratto da cellule reticolate e vengono mostrati anche i risultati della competizione con il poli(A). Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa per analizzare sistematicamente l'intero campione di proteina che interagisce con un particolare RNA in vivo.

È importante sottolineare che TRIP è un approccio versatile che può essere adattato a tutti i tipi di RNA poliadenilati in tutti gli organismi per comprendere la disposizione dinamica delle interazioni tra le proteine dell'RNA. Pertanto, può essere utilizzato per studiare RNA controllati dallo sviluppo o correlati alla malattia e può eventualmente portare a nuovi bersagli per l'intervento terapeutico.