Name: Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Scopri la microgravimetria dissipativa per studiare l'interazione dell'Annessina A2 con membrane lipidiche supportate. Questo metodo senza etichette permette analisi quantitative in tempo reale del legame calcio-dipendente.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft sotto sovvenzioni SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 e SFB 1348/A11.

Nota: Buffer devono essere filtrati usando un filtro da 0,22 µm e degassato da un vuoto per 1 h.
1. lipidico della vescicola preparazione
<ol><li>Usare tubi di vetro da 2 mL. Sciogliere ogni lipido, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (pop) e colesterolo (Chol), in una miscela di cloroformio / metanolo (50: 50 v/v) per preparare una soluzione lipidica chiaro 5 mM. Sciogliere 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4,5) P2) in una miscela di cloroformio/metanolo/acqua (20:9:1 v/v).</li>
	<li>Combinare i lipidi disciolti nel rapporto molare desiderato di POPC/POPS (80/20), POPC/PI (4,5) P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) e POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (37/20/20/3/20) ( Tabella 1) in tubi di vetro 10 mL. Nota: L'importo finale del lipido totale è di 500 µ g.</li>
	<li>Evaporare i solventi organici utilizzando un flusso secco di azoto. Lasciare la miscela di lipidi in un sistema di alto vuoto (liofilizzazione) per 3 h rimuovere eventuali tracce residue dei solventi. Nota: Ciò provoca un film asciutto e chiaro.</li>
	<li>Risospendere il film lipidico in 1 mL di tampone citrato (10mm-citrato trisodico, 150 mM NaCl, pH 4,6). Incubare la sospensione del lipido a 60 ° C (questa temperatura è circa 10 ° C sopra la temperatura di transizione di fase del lipido di fusione più alto nella miscela) per 30 min in un bagno d'acqua e vortexare vigorosamente ogni 5 min. Nota: Questo provoca la formazione di vescicole multilamellari, grande (MLV). Mantenere la sospensione sopra la temperatura di transizione.</li>
	<li>Preriscaldare l'estrusore (a 60 ° C in questo caso) dotato di una membrana di policarbonato dimensioni dei pori di diametro di 50 nm sopra la temperatura di transizione (che qui è 40-50 ° C) per 30 min.</li>
	<li>Caricare la sospensione MLV nell'estrusore preriscaldato e passare delicatamente la miscela 31 x attraverso la membrana di policarbonato per formare unilamellari piccole vescicole (SUV)14. Mantenere la temperatura di sopra della temperatura di transizione.</li>
	<li>Trasferire la sospensione SUV a un recipiente di reazione in plastica da 2 mL e aggiungere il tampone citrato (Vedi punto 1.4) per portare il volume finale di 2 mL. Nota: Questo consente di ottenere una concentrazione finale del lipido di 250 µ g/mL.</li>
</ol>2. movimentazione i sensori al quarzo
Nota: Maneggiare i sensori al quarzo con una pinzetta.
<ol><li>Incubare a quattro sensori inseriti in un supporto di politetrafluoroetilene in una soluzione di 2% SDS per ≥ 30 min lavaggio li estesamente con acqua ultra-pura completamente rimuovere il SDS e lasciarli asciugare utilizzando un flusso di argon a secco o azoto.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di pulizia al plasma per rimuovere completamente eventuali contaminanti. Inserire i sensori asciutti nella camera di pulizia al plasma, evacuare la camera e lavare 3 volte con ossigeno. Girare il plasma cleaner in. Utilizzare i seguenti parametri di processo: 1 x 10-4 Torr pressione, potenza ad alta frequenza radio (RF) e 10 min di tempo di processo. Spegnere la macchina e togliere i sensori.</li>
</ol>3. microbilancia operazione
Nota: Un sistema microbilancia con quattro alloggiamenti di flusso a temperatura controllata in una configurazione in parallelo, collegata ad una pompa peristaltica e impostata su una portata di 80 µ l/min, è stato usato. In modalità flusso continuo, il buffer è stato pompato dal serbatoio di alimentazione nel serbatoio ricevente. Nel modo del ciclo, il contenitore di ricezione è stato collegato con il serbatoio di alimentazione per generare un loop chiuso. La temperatura è stata impostata a 20 ° C.
<ol><li>Attentamente ancorare i sensori puliti del plasma negli alloggiamenti del 4 flusso, usando la pinzetta. Evitare qualsiasi pressione su o torsione delle sezioni ed i tubi che potrebbero causare perdite.</li>
	<li>Lavare il sistema con tampone citrato (10mm-citrato trisodico, 150 mM NaCl, pH 4,6) in modalità open-flusso per 10 min. Nota: Questo richiede esattamente 3,2 mL di tampone, ma si consiglia di utilizzare un eccesso di tampone (10 mL).</li>
	<li>Lanciare il programma. Avviare la registrazione di eventuali cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione del primo tono fondamentale (n = 1) e toni (n = 3-13) utilizzando il software, fino a quando le linee di base frequenza e dissipazione sono stabili (questo richiederà circa 40-60 min). Nota: I livelli di rumore di frequenza (picco-picco) devono essere inferiori a 0,5 Hz e, per la dissipazione, più bassa di 0.1·10-6, con una deriva massima (in soluzione acquosa) di 1 Hz/h in frequenza e 0.3·10/h-6nella dissipazione.</li>
	<li>Quando le linee di base sono stabili, applicare la sospensione SUV in tampone citrato (2 mL in un piccolo tubo). Utilizzando un recipiente di reazione, rimuovere 1,5 mL del volume morto. Quindi chiudere il sistema in modalità loop-flusso. Registrare lo spostamento di frequenza/dissipazione per altri 10 minuti. Nota: Durante questo periodo, le vescicole saranno steso sul supporto2 SiO e fondono per formare un doppio strato continuo15,16 (passaggio 2 di Figura 1, Figura 2e Figura 3). Il SUV di adsorbimento sulla superficie del sensore è due-fasico e ha una frequenza tipica minima e massima nella dissipazione. Una nuova baseline di frequenza/dissipazione stabile con uno spostamento di frequenza caratteristica (a seconda della composizione lipidica) dal 26-29 Hz (Vedi tabella 1) indica un doppio strato continuo sulla superficie.</li>
	<li>Quando la SLB è stabile (Vedi punto 3.4), equilibrare il sistema con il buffer in esecuzione (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) alle richieste Ca2 + concentrazioni (che variano da 50 µM fino a 1 mM CaCl2, a seconda dell'esperimento) in una modalità di flusso aperta per 40 min.</li>
	<li>Aggiungere la proteina (qui, AnxA2) per il funzionamento del buffer contenente Ca2 + (Vedi punto 3.5). Eseguire l'applicazione della proteina in modalità loop-flusso fino a raggiungere uno stato di equilibrio stazionario (passaggio 3 in Figura 1, Figura 2e Figura 3). Nota: La concentrazione di proteina può variare da 1 a 400 nM. Adsorbimento di proteine provoca uno spostamento di frequenza dipendente dalla concentrazione che riflette l'adsorbimento di massa (proteina).</li>
	<li>Dissociare la proteina associata mediante chelanti ioni di Ca2 + con 5 mM EGTA nel buffer in esecuzione in modalità flusso continuo (passaggio 4 nella Figura 1 e Figura 2). Nota: Un recupero della frequenza e della dissipazione alla linea di base di SLB indica una totale reversibilità di legame alle proteine. Associazione-dissociazione cicli possono essere ripetuti per confrontare diverse concentrazioni o proteine.</li>
</ol>4. microbilancia pulizia
Nota: Eseguire una procedura di pulizia minima dopo ogni misurazione.
<ol><li>Rigenera il sistema microbilancia con 50 mL di ddH2O in modalità flusso continuo aperto, rimuovere i tubi dal contenitore dell'acqua e consentire al sistema di funzionare a secco.</li>
	<li>Rimuovere il sensore di cristallo con cautela e pulirlo con la soluzione di SDS 2% utilizzando il titolare di politetrafluoroetilene (Vedi punto 2.1).</li>
	<li>Asciugare le parti visibili all'interno del modulo di flusso dove è stato posizionato il sensore. Nota: Eseguire un intenso procedura di pulizia dopo una serie di 10 misurazioni.</li>
	<li>Pulire il sistema con una soluzione di SDS 2% (50 mL) a 40 ° C (programma di installazione del software) in modo continuo flusso aperto (tubo), utilizzando una portata di 20 µ l/min per un contatto prolungato con il detersivo.</li>
	<li>Pulire con 250 mL di ddH2O in modalità flusso continuo aperto ad una portata di 160 µ l/min. Nota: Dopo 4 mesi, è possibile effettuare una vasta procedura di pulizia secondo il manuale del produttore.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per rispondere a domande concernenti la relazione struttura-funzione delle membrane cellulari sia in maniera quantitativa e qualitativa, i profitti di biologia cellulare immensamente dall'uso di approcci biofisici sulla base ben consolidati e ampiamente usato tecniche , tra cui atomico microscopia a forza (AFM), risonanza plasmonica di superficie (SPR), e la tecnica di QCM-D impiegata qui. Abbiamo dimostrato in precedenti studi che legano proteine annessina in Ca2 +-modo dipendente alla membrana immobilizzata con alta affinità. Usiamo la frequenza e dissipazione turni della 7 ° tratto (Δf7) perché questo rappresenta il miglior compromesso di stabilità di sensibilità ed oscillazione di rilevamento.
Questa tecnica permette inoltre una descrizione quantitativa dell'interazione proteina di membrana. Associazione AnxA2 alla membrana è caratterizzata da cooperatività positiva che è mediata dal dominio conservato annessina core e dipende dalla presenza di colesterolo. I dati quantitativi ottenuti per AnxA2 e AnxA8 sono riportati dettagliano altrove6,8.
Ci sono molti passaggi critici in questo protocollo. Utilizzare i liposomi immediatamente; in caso contrario, piccole vescicole potrebbero fondere in vescicole più grandi con meno tensione superficiale, giungendo all'inibizione della formazione di bilayer del lipido. Mantenere una temperatura costante durante le misurazioni. Ogni piccola deviazione di temperatura provoca uno spostamento di frequenza e la dissipazione non trascurabile. Evitare le bolle d'aria; in caso contrario, il sistema è instabile e non stabilisce una linea di base.
L'equazione di Sauerbrey permette la conversione diretta di frequenza osservata si trasforma in cambiamenti nella massa ed è, pertanto, ampiamente usato. Tuttavia, l'ipotesi di una correlazione lineare tra il cambiamento nella frequenza di risonanza e la massa aggiunta solo vale per componenti formando una pellicola rigida e uniforme sulla superficie del sensore. L'equazione di Sauerbrey non può essere utilizzato per viscoelastico adsorbenti quali pellicole di acqua-ricco di proteine, strati lipidici con acqua incorporato, o persino adsorbito celle. Qui, più complessi modelli matematici sono obbligatori. Pertanto, è estremamente importante monitorare contemporaneamente i cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione. Per rilevare cambiamenti strutturali durante la misurazione, ΔD contro Δf i rapporti possono essere tracciati, con una linea retta che indica nessun cambiamenti conformazionali.
Dei principali vantaggi di questa tecnica è la possibilità di utilizzare una gamma molto ampia di materiali come substrati. Inoltre, è un metodo affidabile e diretto per studiare una vasta gamma di interazioni macromolecolari, come la corretta formazione delle pellicole di rivestimento di superficie (ad esempio SLB), così come ulteriori interazioni proteina-lipide, possa essere monitorato online.
Questo protocollo può essere applicato ad altre proteine di membrana-interazione, ad esempio, BAR dominio proteine19, ERM (ezrin, radixina e moesin) famiglia delle proteine che ha un ruolo importante in membrana-citoscheletro sollevatore20,21 ,22, o proteine che contengono domini C2 o PH. Inoltre, una vasta gamma di applicazioni di questa tecnica per lo studio di materiali biologici è stato con successo pubblicata, stabilendo così QCM come piattaforma sperimentale adatta per studiare le interazioni di assiemi più complessi macromolecolari o addirittura cellule23,24.

Le membrane cellulari sono strutture altamente dinamiche e complesse. La miscela composta di lipidi di membrana, insieme a proteine di membrana marginalmente e/o integralmente associata, assemblare microdomini di forma. L'organizzazione tempo-spaziale coordinata di questi microdomini di membrana è coinvolto in processi fisiologici chiave1. Membrana microdomain dynamics sono guidati dall'interazione dei lipidi della membrana, nonché dalla capacità delle proteine di membrana periferico di riconoscere e interagire con i lipidi arricchiti nei microdomini. L'assunzione di proteine per i lipidi specifici è spesso raggiunto via del lipido-riconoscimento moduli, ad esempio l'omologia di pleckstrin (PH) o il C2 domini2,3. Metodi analitici biofisiche utilizzando membrane modello sono chiave per comprendere i principi fondamentali che regolano questi processi a livello molecolare.
Annexins, una grande famiglia multigenica, sono ben noti per la loro capacità di legarsi ai lipidi della membrana caricata negativamente, principalmente della fosfatidilserina (PS), a Ca2 +-controllato di modo2. Il secondo tratto distintivo della famiglia annessina è la presenza di un segmento strutturale conservato, l'Annessina ripetere, cioè presenti quattro o otto volte e porti il Ca2 +- e fosfolipide-leganti siti4. Il Ca2 +-interazione dipendente del lipido pone il annexins in una posizione perfetta da percepire e trasmettere Ca2 +-mediata segnalazione alle membrane di destinazione. Coerentemente, annexins sono in grado di indurre la formazione di microdomini arricchiti in colesterolo, fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PI (4,5) P2) e PS, sia nella membrana cellulare e/o artificiale sistemi5. Questo protocollo descrive un metodo per analizzare l'interazione di annessina-membrana utilizzando una dissipazione di microbilancia a cristallo di quarzo (QCM-D)6,7,8.
Il componente di base in questa microbilancia è un'oscillazione al quarzo che funge da superficie del sensore. L'adsorbimento e/o associazione di molecole di superficie del sensore diminuisce la frequenza di risonanza (f) proporzionale all'aumento di massa. Se la superficie è uniformemente rivestita con un film, l'associazione di altre sostanze può interferire con l'integrità strutturale di questo strato, e tali cambiamenti nella viscoelasticità (il fattore D di dissipazione energetica) possono essere inoltre monitorati. Si tratta di una tecnica molto diffusa per studiare l'interazione delle proteine con lipidici. In questo approccio, vescicole lipidiche vengono assorbite sulla superficie del sensore opportunamente rivestito. Formazione di bilayer del lipido è favorevole su materiali a base di silice9,10, mentre le vescicole spesso non rompono su altre superfici idrofile, come gold11 ossidato dopo esposizione UV-ozono, TiO212o Al 2O313. La rottura delle vescicole coalescenza rilascia la fase acquosa, portando a cambiamenti caratteristici in massa e dissipazione. La generazione di solido-supportato lipidici (SLB) di fusione della vescicola è semplice e robusta e può essere utilizzata per generare modelli complessi che imitano le membrane cellulari.
Microbilancia a cristallo di quarzo dissipativo è una tecnica sensibile e privo di etichetta. Dei principali vantaggi è la possibilità di rivestire qualsiasi materiale che genera un film sufficientemente sottile sulla superficie, fornendo così una vasta gamma di applicazioni in settori di ricerca diversi. L'interazione della proteina-membrana è osservata in tempo reale, e i risultati possono essere analizzati direttamente. La stessa superficie di sensore può essere utilizzata nelle successive misurazioni (dopo aver eseguito una minima pulizia come descritto in questo protocollo), consentendo in tal modo accurati controlli interni e una comparabilità tra analiti.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Merck</td><td>017-013-00-2</td><td>99%</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Roth</td><td>4432.1</td><td>99%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0878</td><td>99%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3493</td><td></td></tr><tr><td>PiP2</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850155P</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>840034P</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>183</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extruder Liposofast</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qsense E4 Analizzatore</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QSense Dfind</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa IPC 4</td><td>Ismatec</td><td>ISM 930</td><td></td></tr><tr><td>QSX 303 SiO2 Biossido di silicio 50nm</td><td>Qsense</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PC 0.05&mu; m</td><td>Avanti lipidi polari</td><td>610003</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Versione 8 e 9</td></tr></tbody></table>

microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina annessina a2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

La tecnica di microbilancia a cristallo di quarzo che tende a dissipare è un approccio semplice e privo di etichetta per misurare simultaneamente le proprietà di assorbimento e viscoelastico massa della massa assorbita/immobilizzate su superfici di sensore, permettendo le misurazioni dell'interazione di proteine con superfici solido-sostenuto, come lipidici, in tempo reale e con un'alta sensibilità. Annexins sono un gruppo altamente conservato di proteine fosfolipide-leganti che interagiscono reversibilmente con headgroups negativamente caricati tramite il coordinamento degli ioni calcio. Qui, descriviamo un protocollo che è stato impiegato per analizzare quantitativamente l'associazione dell'Annessina A2 (AnxA2) per planare lipidici preparati sulla superficie di un sensore di quarzo. Questo protocollo è ottimizzato per ottenere dati affidabili e riproducibili e include una dettagliata descrizione passo-passo. Il metodo può essere applicato ad altre proteine di membrana-associazione e composizioni di doppio strato.

La diminuzione della frequenza di risonanza (Δf) si correla in modo lineare con la massa adsorbita (Δm), come definito dall'equazione di Sauerbrey. 17
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg">
Qui, f è la frequenza di risonanza, Cf è una costante che dipende dalle caratteristiche geometriche e fisiche di quarzo dato e la frequenza di risonanza, e A è l'area di superficie del sensore.
Nella maggior parte delle applicazioni, lo strato adsorbito non è completamente rigido ma viscoelastico. La risultante smorzamento dell'oscillazione del sensore al quarzo è denominato dissipazione (D). La dissipazione monitorata le modifiche (ΔD) correlano con le proprietà viscoelastiche della massa associata18 e sono definiti come segue8.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg">
Qui, Edissipato è l'energia perdita durante il periodo di una oscillazione, ed Ememorizzati è l'energia totale del sensore liberamente oscillante.
Per analizzare e quantificare i parametri di associazione, isoterme di frequenza sono derivate da tracciare gli spostamenti di frequenza di equilibrio (ΔΔfe) contro le concentrazioni di proteina. ΔΔfe è definito come
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg">
Qui, Δft1 rappresenta l'inizio della proteina adsorbimento e Δft2 lo stato di equilibrio. Adattamento alla curva non lineare può essere eseguita utilizzando un espansione di collina dell'equazione di Langmuir come segue6,8.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg">
Qui, ΔΔfmax è il ΔΔfe della concentrazione della proteina risultante nell'associazione massimo (saturazione), Kd è la costante di dissociazione apparente per la proteina/membrana complessa e n è il coefficiente di Hill.
Il coefficiente di Hill (n) descrive la cooperatività di associazione. Per n = 1, il modello di adsorbimento di Hill è un semplice isoterma di Langmuir (i siti di legame uguale e tutte le molecole legano indipendentemente da a vicenda per il doppio strato lipidico). Se n ≠ 1, un ligando associato cambia la membrana affinità per altri ligandi obbligatoria, sia aumentando (n &gt; 1, il cooperativity positivo) o diminuendo (n &lt; 1, il cooperativity negativo) l'affinità.
La figura 1 Mostra uno schema del flusso di lavoro sperimentale utilizzato nel nostro laboratorio per misurare gli spostamenti in risonanza e frequenza durante il Ca2 +-dipendente associazione e il rilascio di AnxA2 a bilayer del lipido in fase liquida. Una registrazione esemplare è illustrata nella Figura 2. Figura 2 A Mostra la registrazione della curva di frequenza e 2 di figuraB Mostra gli spostamenti di dissipazione. La goccia prominente in frequenza sull'aggiunta dei liposomi (Figura 2A [fase 1]) indica loro adsorbimento. Perché le vescicole buffer riempito non sono rigide, ma aumenta viscoelastico, la dissipazione (Figura 2B [fase 1]). Successivamente, la rottura di vescicole coalescenza. Il rilascio concomitante del buffer all'interno delle vescicole diminuisce la massa adsorbita fino a raggiungere un plateau stabile (Figura 2A [fase 2]). Di nota, l'aggiunta delle vescicole provoca uno spostamento ad elevata dissipazione, mentre lo spostamento in risposta a doppio strato è molto più piccolo a causa della rigida natura omogenea di SLB (Figura 2B [fase 2]). Passaggio 3 in Figura 2A e 2B record l'associazione di AnxA2 per i lipidi, che aggiunge massa, come visto tramite lo spostamento di frequenza libera, ma non interferisce con la struttura a doppio strato, come indicato dal solo piccolo cambiamento nella dissipazione. Quando Ca2 + è rimosso dall'agente chelante EGTA (Figura 1 e Figura 2 [passaggio 4]), AnxA2 si dissocia dal film lipidico. La frequenza, così come le registrazioni di dissipazione, spostano i livelli osservati con il bilayer solo (confronta i passaggi 2 e 4 in Figura 2A e 2B), che indica che l'associazione AnxA2 è totalmente dipendente dal Ca2 + e che il film lipidico rimane intatto.
AnxA2, come fanno più di annexins, dipende dalla caricati negativa lipidi come PS Questo si vede chiaramente quando si apre è assente nel bilayer del lipido (Figura 3). Figura 3 A Mostra la registrazione della curva di frequenza e Figura 3B Mostra gli spostamenti di dissipazione. Nota che la frequenza si sposta verso una linea di base stabile a-25 Hz, eppure la dissipazione non è alterata (Figura 3B [fase 2]), indicativo di una formazione di doppio strato corretto. Tuttavia, nessun cambiamento nella frequenza (Figura 3A) o di dissipazione (Figura 3B) è osservato dopo l'aggiunta di AnxA2 in presenza di Ca2 + (Figura 3A e 3B [fase 3]) o EGTA (Figura 3A e 3B [passaggio 4]), come AnxA2 non può interagire con il film lipidico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg"> Figura 1 : Modello grafico del flusso di lavoro sperimentale. Questo flusso di lavoro illustra l'assorbimento della vescicola alla superficie idrofila sensore (passaggio 1), la fusione della vescicola/rottura che porta alla formazione di SLB (passaggio 2), e il Ca2 +-dipendente adsorbimento (passaggio 3) e desorbimento EGTA-dipendente dei AnxA2 (passaggio 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg"> Figura 2 : Registrazione esemplare. Questi pannelli mostrano (A) il monitoraggio del tempo-dipendente della frequenza di risonanza del tratto 7 e (B) la dissipazione turni dei sensori al quarzo durante la misurazione. L'applicazione dei liposomi provoca una rapida diminuzione nella linea di base di frequenza, mentre la linea di base di dissipazione aumenta (passaggio 1). La stabilizzazione delle linee di base indica la formazione del bilayer (passaggio 2). Il AnxA2 (200 nM) adsorbimento (in presenza di Ca2 +) sul bilayer del lipido che contiene POPS aggiunge massa senza modificare significativamente la dissipazione, che indica che il film lipidico non è perturbato (passaggio 3). Il recupero della linea di base frequenza su Ca2 + chelazione con EGTA indica il desorbimento totale della proteina (passaggio 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg"> Figura 3 : Esperimento di controllo negativo, dimostrando che la AnxA2 non associare a SLBs in assenza di POPS. Questi pannelli mostrano l'aggiunta di liposomi e la formazione di SLB (passaggi 1 e 2). Nessun cambiamento nella frequenza (A) o (B) dissipazione è evidente dopo l'aggiunta di AnxA2 (passo 3; 200 nM, in presenza di Ca2 +) o EGTA (passaggio 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Composizione</td>
			<td>ΔΔF/Hz dopo formazione di SLBs</td>
			<td>ΔΔD * 10-6 dopo formazione di SLB</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS (80: 20)</td>
			<td>26,3 ± 0,2</td>
			<td>0,26 ± 0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/PI (4,5) P2 (95: 5)</td>
			<td>26,5 ± 0,5</td>
			<td>0.31 ± 0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS/Chol (60: 20: 20)</td>
			<td>29,2 ± 0,2</td>
			<td>0.45 ± 0,09</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (60: 17: 03:20)</td>
			<td>29,6 ± 0.6</td>
			<td>0,43 ± 0,10</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (37: 20: 20: 03:20)</td>
			<td>29,4 ± 0,4</td>
			<td>0,39 ± 0,14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: dati di composizione e formazione del lipido di SLB 7 .

Qui, presentiamo un protocollo sperimentale che possa essere impiegato per determinare l'affinità di legame e la modalità di interazione di privo di etichetta del fosfolipide-legante della proteina Annessina A2 con immobilizzati solido-supportato lipidici (SLB) misurando contemporaneamente la l'assorbimento di massa e le proprietà viscoelastiche della proteina Annessina A2.

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Questo metodo può aiutare a studiare le direzioni delle proteine con membrane lipidiche. Nel nostro caso, usalo per analizzare il legame dipendente dal calcio delle annessine ai fosfolipidi caricati negativamente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è priva di etichette, sensibile, quantitativa e che le interazioni possono essere osservate in tempo reale.Consentendo così l'analisi diretta dei risultati reali. Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi, come l'interazione di gruppi di micromolecole più complessi o persino di cellule. Utilizzare cinque soluzioni lipidiche millimolari chiare come descritto nel protocollo di testo.Unire i lipidi disciolti nel rapporto molare desiderato in tubi di vetro da 10 millilitri. Evaporare i solventi organici utilizzando un flusso secco di azoto. Lasciare la miscela lipidica su un sistema di lofilizzazione ad alto vuoto per tre ore per rimuovere eventuali tracce residue dei solventi.Ora, rimospendare il film lipidico in un millilitro di tampone di citrato. Incubare la sospensione lipidica a 60 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno d'acqua, vortice vigorosamente ogni cinque minuti. Questa temperatura è di circa 10 gradi Celsius sopra la temperatura di transizione di fase del lipide fuso più alto nella miscela.Nel frattempo, preriscaldare l'estrusore dotato di una membrana in policarbonato delle dimensioni di un poro di 50 nanometri di diametro superiore alla temperatura di transizione per 30 minuti. Caricare la sospensione vescicolare multilamellare nell'estrusore preriscaldato. Passare delicatamente la miscela 31 volte attraverso la membrana in policarbonato per formare piccole vescicole unilamellari o SUV.Mantenere la temperatura al di sopra della temperatura di transizione. Trasferire la sospensione del SUV su un recipiente di reazione in plastica da due millilitri e aggiungere il tampone di citrato per portare il volume finale a due millilitri. Incubare quattro sensori inseriti in un supporto in politetrafluoroetilene in una soluzione 2%SDS per almeno 30 minuti.Quindi lavarli ampiamente con acqua ultra pura per rimuovere completamente l'SDS e provarli usando un flusso di argon secco o azoto. Utilizzare un sistema di pulizia del plasma per rimuovere completamente eventuali contaminanti. Per fare ciò, inserire i sensori asciutti nella camera di pulizia del plasma, evacuare la camera e scaricarla tre volte con ossigeno.Quindi, accendi il pulitore al plasma. Utilizzare il vuoto, l'alta potenza a radiofrequenza e 10 minuti di tempo di processo. Dopo la pulizia, spegnere la macchina ed espulse i sensori.Agganciare con cura i sensori puliti al plasma nelle quattro camere di flusso utilizzando una pinzetta. Evitare qualsiasi pressione o torsione delle camere e dei tubi che possa causare perdite. Sciacquare il sistema con buffer di citrato in modalità di flusso aperto per 10 minuti.Avvia il programma. Inizia a registrare eventuali cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione del primo tono fondamentale e delle sfumature utilizzando il software fino a quando le linee di base di frequenza e dissipazione non sono stabili. Quando le linee di base sono stabili, applicare le sospensioni SUV nel buffer citrato.Utilizzando un recipiente di reazione, rimuovere 1,5 millilitri del volume morto, quindi chiudere il sistema in modalità flusso loop. Registrare lo spostamento di dissipazione della frequenza per altri 10 minuti. Quando l'SLB è stabile, equilibrare il sistema con un tampone di corsa alle concentrazioni di calcio richieste in modalità di flusso aperto per 40 minuti.Aggiungere la proteina al tampone di corsa contenente calcio. Eseguire l'applicazione della proteina in modalità flusso ad anello fino a raggiungere uno stato stazionario di equilibrio. Ora, dissociare la proteina legata imbrogliando gli ioni di calcio con cinque millimolari EGTA nel tampone di corsa in modalità a flusso aperto.Rigenerare il sistema di microbilanciamento con 50 millilitri di acqua distillata doppia in modalità a flusso aperto continuo. Rimuovere i tubi dal contenitore dell'acqua e lasciare asciugare il sistema. Rimuovere con cura il sensore di cristallo e pulirlo con una soluzione 2%SDS utilizzando il supporto in politetrafluoroetilene.Asciugare le parti visibili dell'interno del modulo di flusso in cui è stato posizionato il sensore. Qui è mostrata la registrazione della curva di frequenza e degli spostamenti di dissipazione. Il calo prominente della frequenza dopo l'aggiunta dei liposomi, indica il loro assorbimento perché le vescicole riempite di tampone non sono rigide ma viscoelastiche, la dissipazione aumenta.Successivamente, le vescicole coalesci si rompono. Il rilascio concomitante del tampone all'interno delle vescicole diminuisce la massa adsorbita fino a raggiungere un altopiano stabile. Il legame dell'allegato A2 ai lipidi aggiunge massa come visto dallo spostamento di frequenza chiaro, ma non interferisce con la struttura bistrato come indicato dall'unico piccolo cambiamento nella dissipazione.Quando lo ione calcio viene rimosso dall'agente chelatore, EGTA, l'annesso A2 si dissocia dal film lipidico. La frequenza e le registrazioni di dissipazione si spostano ai livelli osservati con il bistrato che indica solo che il legame annexin A2 dipende totalmente dallo ione calcio e che il film lipidico rimane intatto. Qui viene mostrato un esperimento rappresentativo di controllo negativo.Quando la fosfatidilserina è assente, non si manifestano variazioni di frequenza o dissipazione dopo l'aggiunta dell'allegato A2 in presenza dello ione calcio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante garantire una corretta formazione dei duestrati. Usa immediatamente i liposomi, altrimenti le piccole vescicole si fonderanno in quelle più grandi con meno tensione superficiale che può portare a una linea di base instabile.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una descrizione quantica di un'interazione proteica di membrana al fine di rispondere a domande aggiuntive come il legame cooperativo rispetto a quello non cooperativo.

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