Name: Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Scopri come misurare la concentrazione ionica nello strato limite unstirred con patch-clamp a pipetta aperta. Questa tecnica elettrofisiologica consente di stimare accuratamente gli effetti del flusso fluido sui canali ionici meccanosensibili.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma Pioneer Research Center (2011-0027921), di base scienza ricerca programmi (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795 NRF) attraverso la National Foundation ricerca di Corea finanziato dal Ministero della scienza, ICT & Pianificazione del futuro e da una sovvenzione del Corea Health Technology R & D Project attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (HI15C1540).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Konkuk University.
1. agarosio sale ponti tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl
Nota: Agarosio 3M KCl sale ponti sono prodotte come precedentemente descritto12 con variazioni minori.
<ol><li>Formazione di ponti<ol>
<li>Piegare i tubi capillari di vetro fuoco per formare una forma a U come appropriato. Il diametro interno dei capillari dovrebbe essere abbastanza grande per ridurre la resistenza in serie durante la registrazione correnti di grandi ioni. Tubi con un diametro interno di 2-5 mm sono solitamente accettabili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della soluzione di KCl 3M agarosio<ol>
<li>Preparare 100 mL di soluzione di KCl 3M (1m o 2m è anche accettabile).</li>
		<li>Peso 3 g di agarosio.</li>
		<li>Sciogliere l'agarosio in 100 mL di KCl (cioè, 3% di agarosio) su una piastra calda tra 90 e 100 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>I ponti con 3M KCl agarosio di caricamento<ol>
<li>Per facilitare il carico, immergere i ponti di vetro a forma di U nella soluzione di agarosio-KCl. Nota: È facile da scavare i ponti di vetro se la soluzione di agarosio-KCl è contenuta in un contenitore poco profondo e largo.</li>
		<li>Tenerli durante la notte a temperatura ambiente (TA) per l'agarosio impostare e indurire.</li>
		<li>Accuratamente di scavare i ponti di agarosio-KCl-caricato vetro dal set/indurito dell'agarosi-sale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Memorizzare i ponti<ol>
<li>Preparare abbastanza volume (cioè, 500 mL) della soluzione di KCl 3M in un flacone a collo largo.</li>
		<li>Memorizzare i ponti di agarosio-sale preparati in bottiglia in frigorifero.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. applicazione della forza di taglio di flusso del fluido alle cellule in una camera di Patch di bloccaggio
Nota: Un diagramma schematico della disposizione sperimentale patch clamp è illustrato nella Figura 1.
<ol><li>Posto in un contenitore caricato con soluzione di balneazione (volume e l'altezza dovrebbe già essere misurati) sopra la camera di patch-clamp.</li>
	<li>Riempire la camera di patch-clamp con la soluzione di balneazione di suctioning il tubo.</li>
	<li>Per interrompere il flusso del fluido, il tubo di clip a lato del contenitore di bloccare il flusso del fluido, quindi il tubo di clip sul lato aspirazione per interrompere l'aspirazione allo stesso tempo. Questa è la condizione di controllo "stazionario".</li>
	<li>Per applicare la forza di taglio di flusso del fluido, aprire entrambi i tubi sul lato aspirazione e contenitore allo stesso tempo.</li>
	<li>Prima o dopo aver applicato la forza di taglio di flusso del fluido alla cella, misura della portata in mL/min.</li>
	<li>Calcolare la portata misurando la diminuzione nel volume del liquido in un dato tempo.</li>
	<li>Dalla portata misurata e la geometria (struttura) della camera di balneazione, la forza di taglio applicata alla cella di flusso di liquido dovrebbe essere stimata (Vedi sezione discussione).</li>
	<li>In alternativa, per controllare il tasso di flusso (per la procedura 2.3-2.6), è possibile utilizzare una pompa di perfusione. In questo caso, fare attenzione a garantire una costante anziché un flusso pulsatile.</li>
</ol>3. misurare i cambiamenti nel potenziale di giunzione metallo liquido di flusso del fluido tra soluzione del bagno ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl (Figura 3A)
<ol><li>Utilizzare l'elettrodo Ag/AgCl o pellet, che è disponibile dai prodotti già pronti, senza il ponte salino dell'agarosi.</li>
	<li>Preparare una soluzione salina fisiologica sale per la camera di balneazione (ad es., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucosio; pH regolato a 7.4 con NaOH).</li>
	<li>Posizionare una pipetta patch contenente una soluzione di KCl 3M in aula per ridurre al minimo lo spostamento potenziale di giunzione tra la pipetta e soluzioni di balneazione.</li>
	<li>Difficoltà l'amplificatore di tensione-morsetto per la modalità corrente del morsetto ("io = 0" o "CC").</li>
	<li>Dopo annullando il potenziale di offset iniziale, misurare le variazioni di tensione indotte da varie portate.</li>
	<li>Per verificare che le variazioni di tensione sono potenziali di giunzione liquido/metallo, ri-esaminare l'effetto del flusso del fluido sul potenziale di giunzione utilizzando il bridge di agarosio-sale tra la soluzione del bagno e un elettrodo Ag/AgCl.</li>
</ol>4. sperimentale stima della concentrazione reale Cl– nello strato Unstirred adiacente all'elettrodo Ag/AgCl sotto condizione statica (Figura 3B)
<ol><li>Dai risultati del passaggio 3, disegnare le relazioni di potenziale-portata di giunzione e stimare il valore massimo (saturazione) di MAIUSC potenziale di giunzione dalla portata supra-fluido.</li>
	<li>Preparare soluzioni con varie concentrazioni di Cl (cioè, 50, 99, 147, 195 e 288 mM di NaCl).</li>
	<li>Modificando il Cl– concentrazione nel liquido bagnarsi, disegnare la giunzione potenziali-[Cl–] relazione. Si noti che il tasso di liquido deve essere costante e sufficientemente elevata (> 30 mL / min) per evitare la diminuzione della concentrazione di Cl– a quello dell'elettrodo di riferimento Ag/AgCl adiacente.</li>
	<li>Le curve di due rapporti, stimare i cambiamenti nella concentrazione di Cl– dal turno di potenziale di giunzione misurato.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes%3A+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare la concentrazione reale di Cl– nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl determinando la giunzione metallo liquido potenziale con una pipetta di patch-clamp aperto riempita con un alta KCl concentrazione. Il cambiamento nella concentrazione di Cl– nello strato limite può causare uno spostamento del potenziale di giunzione quando si passa da statico a condizioni di flusso fluido. Semplicemente utilizzando un'agarosi...

Flusso del fluido è un importante segnale ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici come la vasodilatazione indotta da flusso fluida e fluido shear forza-dipendente vascolare rimodellamento e sviluppo1,2, 3,4,5. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di taglio di flusso del fluido completamente non sono capiti, si ritiene che fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating criticamente può contribuire alle risposte indotta da flusso fluido5 , 6 , 7 , 8. ad esempio, l'attivazione del raddrizzatore inward endoteliale Kir 2.1 e Ca2 +-attivato K+ (KCa2.3, KCNN3) canali dopo l'afflusso di Ca2 + di flusso del fluido è stata suggerita per contribuire al fluido vasodilatazione indotta da flusso6,7,8. Di conseguenza, molti canali ionici, soprattutto meccanicamente attivato o - inibiti canali, sono stati studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con il patch-clamp tecnica6,9,10 , 11. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale eseguito durante la registrazione di patch-clamp, risultati e interpretazione dei dati sul flusso fluidi-regolamenti delle scanalature dello ione può essere erronea10,11.
Dallo svincolo di potenziale tra il liquido del bagno e riferimento Ag/AgCl elettrodi11è una fonte di fluidi indotta da flusso artefatti nella registrazione di patch-clamp. Si ritiene generalmente che la giunzione di liquido/metallo potenziale tra il fluido di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl è costante come la concentrazione di Cl– del fluido balneazione viene mantenuta costante, considerando la risposta chimica tra la soluzione di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl per essere:
AG + Cl–↔ AgCl + elettrone (e–) (equazione 1)
Tuttavia, in un caso dove la reazione elettrochimica nel complesso tra la soluzione di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (equazione 1) procede da sinistra a destra, la concentrazione di Cl– del fluido balneare adiacente di Ag/AgCl fare riferimento elettrodo (strato limite unstirred12,13,14,15) può essere molto inferiore a quello nella maggior parte dei balneari soluzione, a meno che non sufficiente convezione trasporto è assicurato. Utilizzando un elettrodo Ag/AgCl vecchio o non ideale con insufficiente clorazione di Ag può aumentare tale rischio. Questo artefatto correlate a flusso fluido presso l'elettrodo di riferimento, infatti, possa essere esclusi semplicemente posizionando un ponte convenzionale dell'agarosi-sale tra il fluido di balneazione e riferimento dell'elettrodo, dal momento che il manufatto si basa sulle alterazioni nella real Cl– concentrazione adiacente l' elettrodo Ag/AgCl11. Il protocollo presentato in questo studio viene descritto come impedire i cambiamenti di potenziale di giunzione correlate a flusso e misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred.
Dopo aver posizionato un'agarosi ponte di KCl tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl, c'è un altro fattore cruciale da considerare: proprio come il riferimento Ag/AgCl elettrodi agisce come un elettrodo Cl– , scanalature dello ione possono funzionare anche come un elettrodo iono-selettivi. La situazione di uno strato di contorno unstirred tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl si verifica durante il movimento di ioni tra le soluzioni extracellulare e intracellulare attraverso i canali ionici di membrana. Ciò implica che l'attenzione dovrebbe essere usato quando interpretare il regolamento dello ione di canali di flusso del fluido. Come discusso nel nostro precedente studio11, il movimento di ioni attraverso una soluzione in cui è presente un gradiente elettrochimico può verificarsi tramite tre meccanismi distinti: convezione, dove la diffusione è il movimento, la migrazione e diffusione indotta da gradiente di concentrazione, migrazione è il movimento guidato dal gradiente elettrico, e la convezione è il movimento attraverso il flusso di fluido. Tra questi meccanismi di tre trasporto, modalità convezione contribuisce la maggior parte al movimento di ioni11 (> 1.000 volte maggiore diffusione o migrazione sotto impostazioni solite patch-clamp). Questo costituisce la base teorica del perché giunzione potenziali tra la balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl può molto sotto diverse condizioni statiche e flusso fluido11.
Secondo l'ipotesi proposta sopra, alcuni effetti facilitatory del flusso del liquido sul canale dello ione corrente possono essere dedotta dal restauro convettivo di concentrazioni di ioni reale adiacente all'ingresso del canale sulla superficie di membrana (strato di contorno unstirred) 10. In questo caso, gli effetti indotta da flusso fluidi sulle correnti di canale ionico sono semplicemente sorti da eventi elettrochimici, non dal regolamento di ioni canale gating. Un'idea simile è stata suggerita in precedenza da Barry e colleghi12,13,14,15 basato su considerazioni teoriche rigorose e la prova sperimentale, anche conosciuto come lo strato unstirred o trasporto numero effetto. Se alcuni canali ionici hanno sufficiente conduttanza del singolo canale e abbastanza a lungo tempo aperto per fornire sufficiente trasporto velocità attraverso i canali (un più veloce tasso di trasporto nella membrana che in superficie della membrana unstirred), un effetto di strato di contorno possono sorgere . Quindi, il trasporto di convezione-dipendente può contribuire alle eventuali agevolazioni indotta da fluido-flusso di ioni corrente10,12,13,14,15.
In questo studio, sottolineiamo l'importanza di utilizzare un agar o agarosio sale-ponte mentre studiava regolamento indotta da fluido-flusso di correnti di ioni. Forniamo anche un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred adiacente per i canali di ioni Ag/AgCl elettrodi e membrana di riferimento. Inoltre, l'interpretazione teorica di fluido modulazione indotta da flusso di correnti di canale ionico (vale a dire, ipotesi di convezione o effetto numero di unstirred livello trasporto) possa fornire informazioni preziose per la progettazione e interpretare gli studi su il taglio forza-regolamento dei canali ionici. Secondo l'effetto numero di trasporto unstirred strato di contorno, prevediamo che le correnti del canale ionico attraverso tutti i tipi di canali ionici di membrana possono essere facilitate dal flusso del fluido, indipendente della loro sensibilità biologica a forza di taglio di flusso del fluido, ma solo se i canali ionici sono sufficienti monocanale conduttanza e lungo tempo aperto. Maggiore densità di corrente del canale di ioni può aumentare l'effetto di unstirred strato limite sulla superficie della membrana cellulare.

<table><tbody><tr><td>Camera a bagno aperto RC-11</td><td>Warner instruments, USA</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl elettrodo in pellet</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore a morsetto</td><td>di tensione HEKA, Germania</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore a morsetto di tensione</td><td>Molecular Devices, Stati Uniti</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per liquidi</td><td>KNF Flodos, Svizzera</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite unstirred con pipetta aperta patch-clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Flusso del fluido è un importante stimolo ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici, quali vasodilatazione indotta da flusso fluido. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di flusso fluido/taglio completamente non sono capiti, fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating può contribuire criticamente. Di conseguenza, sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici è stato studiato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, i risultati e l'interpretazione dei dati può essere errate. Qui, presentiamo la prova sperimentale e teorica per errori relativi al flusso di fluido e fornisce metodi per la stima, la prevenzione e la correzione di questi errori. Cambiamenti nella giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione sono stati misurati con una pipetta aperta riempita con 3M KCl. flusso del fluido potrebbe quindi spostano la giunzione liquido/metallo potenziali per circa 7 mV. Al contrario, misurando lo spostamento di tensione indotto dal flusso del fluido, abbiamo stimato la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred. In condizioni statiche, le concentrazioni di ione reale adiacente all'ingresso di canale Ag/AgCl riferimento elettrodo o ione alla superficie della membrana cellulare possono raggiungere come basso come approssimativamente il 30% di quello nella condizione di flusso. Ponendo un'agarosi 3M ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione può impedire questo problema di spostamento potenziale di giunzione. Tuttavia, l'effetto di unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare non poteva essere risolto in questo modo. Qui, forniamo un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred con una pipetta aperta patch-clamp, sottolineando l'importanza dell'utilizzo di un sale di agarosio-ponte mentre studiava fluido regolamento indotta da flusso di correnti di ioni. Pertanto, questo nuovo approccio, che prende in considerazione le reali concentrazioni di ioni nello strato limite unstirred, può fornire la comprensione utile il disegno sperimentale ed interpretazione di dati legate alla sollecitazione di taglio fluido regolazione dei canali ionici .

A cellula intera tensione-dipendente tipo L Ca2 + canale (VDCCL) correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto, come descritto in precedenza11. I miociti arteriosi sono stati dializzati con una soluzione di pipetta Cs-ricco sotto la configurazione nistatina-perforato con soluzione di balneazione privo di cationi bivalenti per facilitare il flusso di corrente attraverso VDCCL<sup class...

Canali ionici mechanosensitive sono spesso studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con registrazione di patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, l'esito il fluidi flusso-regolamenti dei canali ionici possa essere errata. Qui, forniamo metodi per prevenire e correggere tali errori con una base teorica.

Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Questa submittal può aiutare a rispondere a domande chiave nella sfera elettrofisiologia, come il flusso di fluido solo nelle normative dei canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stimare l'effettiva concentrazione di ioni nello strato limite non stimato della superficie della membrana per l'interpretazione dei dati relativi alla regolazione del flusso fluido dei canali ionici. Per iniziare questa procedura, piegare il tubo capillare in vetro sparato per formare una forma a U.Il diametro interno del capillare dovrebbe essere abbastanza grande da ridurre la resistenza in serie durante la registrazione di grandi correnti ioniche. Successivamente, sciogliere tre grammi di agarosio in 100 millilitri di cloruro di potassio trimolare e posizionarlo su una piastra calda tra 90 e 100 gradi Celsius. Quindi, caricare il ponte con il cloruro di potassio agarosio, immergendo il ponte di vetro nella soluzione.Tenerlo durante la notte a temperatura ambiente affinché l'agarosio si insopporti e si indurisca. Il giorno dopo, scavare con cura il ponte di vetro carico di cloruro di potassio di agarosio dal sale di agarosio indurito. Conservare il ponte in una bottiglia a co

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Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

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Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi...

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

I trasportatori nelle membrane cellulari consentono la segregazione differenziale degli ioni attraverso le membrane cellulari o gli strati cellulari e svolgono un ruolo cruciale durante la fisiologia, la riparazione e la patologia dei tessuti. Descriviamo il microelettrodo autoreferenziale iono-selettivo che consente la misurazione di flussi ionici specifici in singole cellule e tessuti in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l'attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l'attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.

Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per misurare direttamente l'attività dei canali ionici sulle vescicole intracellulari utilizzando un sistema manuale di patch-clamp endolisosomiale. Illustriamo il metodo che prevede l'ingrandimento degli endolisosomi e l'isolamento manuale di queste vescicole. Questo approccio garantisce che i ricercatori possano replicare e applicare accuratamente la procedura.

Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Questo manoscritto descrive come preparare i gangli delle radici dorsali intatti per le registrazioni con patch clamp. Questo preparato mantiene il microambiente per i neuroni e le cellule gliali satelliti, evitando così i cambiamenti fenotipici e funzionali osservati utilizzando i neuroni DRG dissociati.

Bloccare Registrazioni patch intatta dei gangli dorsali da ratti adulti

Scopri come misurare la concentrazione ionica nello strato limite unstirred con patch-clamp a pipetta aperta. Questa tecnica elettrofisiologica consente di stimare accuratamente gli effetti del flusso fluido sui canali ionici meccanosensibili.

Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso (Video) | JoVE Journal

Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

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