Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Questa submittal può aiutare a rispondere a domande chiave nella sfera elettrofisiologia, come il flusso di fluido solo nelle normative dei canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stimare l'effettiva concentrazione di ioni nello strato limite non stimato della superficie della membrana per l'interpretazione dei dati relativi alla regolazione del flusso fluido dei canali ionici. Per iniziare questa procedura, piegare il tubo capillare in vetro sparato per formare una forma a U.

Il diametro interno del capillare dovrebbe essere abbastanza grande da ridurre la resistenza in serie durante la registrazione di grandi correnti ioniche. Successivamente, sciogliere tre grammi di agarosio in 100 millilitri di cloruro di potassio trimolare e posizionarlo su una piastra calda tra 90 e 100 gradi Celsius. Quindi, caricare il ponte con il cloruro di potassio agarosio, immergendo il ponte di vetro nella soluzione.

Tenerlo durante la notte a temperatura ambiente affinché l'agarosio si insopporti e si indurisca. Il giorno dopo, scavare con cura il ponte di vetro carico di cloruro di potassio di agarosio dal sale di agarosio indurito. Conservare il ponte in una bottiglia a collo largo di cloruro di potassio a tre molari in frigorifero.

In questa procedura, posizionare un contenitore caricato con soluzione di balneazione, sopra la camera patch-clamp. Quindi, riempire la camera patch-clamp con la soluzione di balneazione aspirazione del tubo. Per interrompere il flusso del fluido, ritagliare il tubo sul lato del contenitore, per bloccare il flusso del fluido.

Quindi agganciare il tubo sul lato di aspirazione per interrompere l'aspirazione allo stesso tempo. Questa è la condizione di controllo stazionario. Per applicare la forza di taglio del flusso del fluido, aprire entrambi i tubi sul contenitore e sui lati di aspirazione contemporaneamente.

Prima o dopo aver applicato la forza di taglio del flusso del fluido alla cella, calcolare la portata in millilitro al minuto misurando la diminuzione del volume del fluido in un dato tempo. Per misurare le variazioni del potenziale di giunzione liquido-metallo, preparare una normale salina fisiologico-salina per la camera di balneazione e confrontarle in assenza e presenza di ponte di cloruro di potassio agar. Quindi, posizionare una pipetta patch contenente soluzione di cloruro di potassio trimolare nella camera, per ridurre al minimo il potenziale spostamento di giunzione tra la pipetta e le soluzioni di balneazione.

Quindi impostare l'amplificatore del morsetto di tensione sulla modalità di bloccaggio della corrente. Dopo aver annullato il potenziale di offset iniziale, misurare le variazioni di tensione indotte variando le portate. Per verificare che le variazioni di tensione siano potenziali di giunzione liquido-metallo, riesaminare l'effetto del flusso del fluido sul potenziale di giunzione, utilizzando il ponte di sale di agarosio tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento.

Con i risultati delle variazioni del potenziale di giunzione liquido-metallo, disegnare le relazioni di portata potenziale della funzione e stimare il valore saturante dello spostamento del potenziale di giunzione per la portata sopra-fluido. Quindi, modificare la concentrazione di cloruro nel fluido di balneazione e disegnare la relazione di concentrazione potenziale di cloruro di giunzione. Si noti che la velocità del fluido deve essere costante e sufficientemente elevata da impedire la diminuzione della concentrazione di cloruro a quella dell'elettrodo di riferimento adiacente al cloruro argento-argento.

Dalle due curve di relazione, stimare le variazioni della concentrazione di cloruro rispetto allo spostamento potenziale di giunzione misurato. Le correnti VDCC-L sono state registrate nei miociti arteriosi mesenterici del ratto dispersi enzimaticamente, con registrazione del patch-clamp perforato alla nystatina. Con il ponte di cloruro di potassio di agarosio, il potenziale di giunzione tra l'elettrodo di riferimento e le soluzioni di balneazione potrebbe essere ridotto al minimo e il flusso del fluido ha aumentato la tensione della corrente VDCC-L in modo indipendente.

Tuttavia, quando l'elettrodo di riferimento del cloruro argento-argento era direttamente collegato al fluido da bagno, senza un ponte di cloruro di potassio di agarosio, la relazione IV in presenza di flusso di fluido si è spostata a destra, rispetto a quella delle correnti VDCC-L in condizioni statiche. L'aumento indotto dal flusso di fluido delle correnti di Kerr 2.1, che sono state registrate nelle cellule di leucemia basofila del ratto con il ponte di agarosio, può essere spiegato dall'effetto strato non stimato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nell'elettrofisiologia superiore.

Quindi è per la regolazione del flusso di fluido nelle correnti del canale ioniche. In termini di fenomeni elettrochimica, nello strato limite non stimato sulla superficie della membrana cellulare.