Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo
30 ottobre 2018
Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) nel cervello. Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul morbo di Alzheimer, in particolare i primi eventi coinvolti nel collasso del cono di crescita. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di rendere possibile visualizzare e analizzare i coni di crescita assonale immediatamente dopo il trattamento beta amiloide. Inizia usando micro-forbici per tritare cortici cerebrali appena isolate da topi embrionali day-14 in mezzo di coltura neuronale senza antibiotici.
Raccogliere i tessuti e centrifugare i tessuti a 87G per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri dello 0,05% di triptina al pellet. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius e mescolare toccando ogni cinque minuti.
Dopo 15 minuti, aggiungere quattro millilitri di A medio per neutralizzare la tripina e mescolare toccando. Quindi centrifugare i tessuti a 178 volte G per tre minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere la soluzione inibitore della DNASI e della soia tripside e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius con miscelazione ogni cinque minuti come prima.
Quando il tempo di incubazione è trascorso, aggiungere quattro millilitri di medio A.Mescolare e centrifugare come prima. Dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere quattro millilitri di medio A e triturare i tessuti con una pipetta Pasteur lucida fino a quando non si osservano detriti. Quindi, filtrare i tessuti triturati con una rete delle dimensioni di un poro da 70 micron.
Dopo la filtrazione, contare le cellule con un emocitometro e calcolare la densità cellulare. Pipetta 0,8 per 10 alla quarta celle nel mezzo A in ogni pozzo di una diapositiva di coltura di otto pozzi. Quindi incubare in un'atmosfera umidificata del 10%CO2 a 37 gradi Celsius.
Dopo quattro ore di coltura, cambiare il mezzo di coltura a medio B.La purezza dei neuroni che utilizzano questo metodo è di circa il 75%Inizia questo saggio con almeno una settimana di anticipo aprendo una fiala fresca di A beta 42 a figura intera ottenuta commercialmente e sciogliendo il contenuto in acqua sterile distillata a una concentrazione di 0,5 millimolare. Incubare a 37 gradi Celsius per sette giorni per indurre aggregazione e tossicità. Preparare le aliquote di A beta 1-42 aggregato e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.
Il quarto giorno della coltura neuronale, trattare i pozzi con 100 microlitri di 0,5 micromolari aggregati A beta 1-42 o soluzione del veicolo nel mezzo B per un'ora come precedentemente dimostrato. Trascorso l'ora, rimuovere il mezzo di coltura e fissare immediatamente i neuroni con paraformaldeide al 4% contenente il 4% di saccarosio in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius su una piastra calda. La fissazione è molto importante in quanto mantenere la forma dei coni di crescita è fondamentale per questo protocollo.
Dopo la fissazione, lavare i neuroni tre volte con PBS. Quindi, dopo aver rimosso la camera, montare i neuroni con un mezzo di montaggio acquoso. Asciugare il mezzo di montaggio a quattro gradi Celsius per due o quattro giorni.
Cattura l'intera area di ogni pozzo con una lente obiettivo a secco 20X su un microscopio invertito. Catturare e analizzare l'intera area in ogni pozzo è importante per evitare la soggettività. Classificare i neuriti più lunghi di ciascun neurone nello stadio tre o quattro come assoni.
I coni di crescita assonali privi di lamellipodia o che possiedono meno di tre filopodi sono considerati coni di crescita collassati. Un oligomero beta 1-42, mostrato qui prima dell'incubazione, si aggrega dopo sette giorni di incubazione a 37 gradi Celsius. Dopo il trattamento con A beta 1-42 aggregato, l'immunostaining con un anticorpo per l'oligomero tossico di A beta mostra una colorazione positiva in rosso su neuroni trattati con A beta 1-42, ma non neuroni trattati con veicoli.
I primi fenomeni indotti dal trattamento A beta 1-42 sono stati analizzati dopo quattro giorni di coltura. Gli assoni identificati sono stati confermati come tali dall'immunostaining positivo per il marcatore assonale tau-1 mostrato in rosso e negativo immunostaining per il marcatore dendritico, MAP-2, mostrato in verde. Dopo un'ora di trattamento del veicolo, i coni di crescita avevano diffuso lamellipodia e diversi filopodi.
Questi sono stati identificati come coni di crescita sani. Al contrario, un'ora di trattamento con Beta 1-42 ha portato a coni di crescita rimpiccioliti, che non hanno sviluppato lamellipodia o filopodia. Questi sono stati identificati come coni di crescita crollati.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di correggere al meglio le celle con 4%PFA e 4% di saccarosio a 37 gradi Celsius per il mio protocollo di fissazione. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging a cellule vive e la trasfezione genica per rispondere a domande aggiuntive come quando e come i coni di crescita dell'assone vengono collassati e come vengono recuperati i coni di crescita collassati.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo progettato per valutare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) sui coni di accrescimento assonali nei neuroni. Lo studio utilizza cortecce cerebrali di topi embrionali, dimostrando che l'Aβ induce l'endocitosi mediata da clatrina e porta al collasso dei coni di accrescimento. Questa ricerca è fondamentale per comprendere i meccanismi iniziali che potrebbero contribuire alla malattia di Alzheimer.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Ricerca sul Morbo di Alzheimer
Sfondo
- L'Aβ è implicato nella patogenesi della malattia di Alzheimer, in particolare nella degenerazione neuronale.
- Comprendere gli effetti dell'Aβ sui neuroni potrebbe rivelare informazioni fondamentali sul decorso della malattia di Alzheimer.
- Il collasso dei coni di accrescimento assonali è un evento precoce nel danno neuronale.
- Lo studio fornisce una metodologia essenziale per visualizzare e analizzare questi cambiamenti in risposta all'Aβ.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi attraverso cui l'Aβ influenza i coni di accrescimento assonali.
- Facilitare la comprensione degli eventi patofisiologici precoci nella malattia di Alzheimer.
- Sviluppare un protocollo per osservare gli effetti immediati dell'Aβ sulla struttura neuronale.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza una piattaforma di coltura cellulare con neuroni derivati dalle cortici cerebrali di topi al giorno embrionale-14.
- Dopo l'isolamento, i neuroni vengono trattati con Aβ aggregato per valutarne l'impatto sui coni di accrescimento.
- I passaggi principali includono la preparazione e l'incubazione delle colture neuronali, seguite da fissazione e immunomarcatura per valutare la morfologia dei coni di accrescimento.
- Il protocollo descrive i tempi critici di incubazione per l'aggregazione dell'Aβ e le tempistiche di trattamento per le colture neuronali.
- Le osservazioni vengono effettuate mediante microscopia per classificare i coni di accrescimento in base alle caratteristiche strutturali.
Risultati principali
- Il trattamento con Aβ ha provocato il collasso dei coni di accrescimento, caratterizzato dall'assenza di lamellipodi e dalla riduzione dei filopodi.
- I neuroni di controllo mostravano una morfologia normale dei coni di accrescimento, in netto contrasto con quelli trattati con Aβ.
- L'immunomarcatura ha confermato l'identità assonale e gli effetti tossici di Aβ sulla struttura neuronale.
- I risultati supportano l'ipotesi che Aβ influenzi negativamente lo sviluppo neuronale nelle fasi iniziali.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un protocollo utile per chiarire gli effetti dell'Aβ sui coni di accrescimento assonali.
- La metodologia consente l'esplorazione dei meccanismi di risposta neuronale al trattamento con Aβ.
- Comprendere queste alterazioni precoci nei coni di accrescimento può contribuire a sviluppare strategie per la prevenzione e il trattamento della malattia di Alzheimer.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la rilevazione precoce del collasso del cono di crescita assonale indotto dall'amiloide-β, un evento meccanicistico chiave che precede la disfunzione sinaptica nella malattia di Alzheimer. Visualizzando in tempo reale l'endocitosi mediata da clatrina e la degenerazione strutturale, esso supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci per le malattie neurodegenerative. L'approccio fornisce un sistema rilevante per la patologia, utile per valutare interventi terapeutici volti a bloccare la tossicità downstream dell'Aβ prima che si manifesti il declino cognitivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi secondo cui l'endocitosi indotta da Aβ provoca il collasso del cono di crescita, consentendo la validazione meccanicistica del bersaglio.
- Valore operativo: Utilizza la marcatura immunoistochimica per marcatori assonali (tau-1) e dendritici (MAP-2) per confermare l'identità neuronale e la specificità del fenotipo.
- Valore predittivo: Dimostra che l'inibizione dell'endocitosi previene la tossicità di Aβ, fornendo un'indicazione simile a un biomarcatore per il coinvolgimento della via.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce letture quantitative di parametri morfologici (presenza di lamellipodi/filopodi) per l'analisi ad alto contenuto degli effetti dei composti.
- Riproducibilità: La fissazione standardizzata con PFA al 4% e saccarosio preserva la struttura del cono di crescita, riducendo al minimo la variabilità nella valutazione basata sull'immagine.
- Scalabilità: Compatibile con vetrini per colture in pozzetti multipli, consentendo il test in parallelo di aggregati di Aβ e potenziali inibitori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la tossicità precoce degli oligomeri di Aβ in neuroni primari di topo, riflettendo eventi fisiopatologici precedenti al deterioramento della memoria.
- Continuità traslazionale: Collega la degenerazione assonale alla rottura della rete neurale, sostenendo la giustificazione per interventi precoci nella malattia di Alzheimer.
- De-risking meccanicistico: Identifica l'endocitosi come un nodo farmacologicamente bersagliabile a monte della neurodegenerazione, guidando la selezione dei target.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, fornendo informazioni meccanicistiche dopo l'interazione con il bersaglio ma prima dello screening fenotipico in modelli di malattia complessi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione dell'Aβ attraverso la visualizzazione diretta della dinamica dei coni di crescita.
- Screening: Genera dati morfologici standardizzati e quantitativi adatti alla miniaturizzazione e all'automazione dei saggi.
- Analisi: Si basa sulla classificazione, mediante microscopia, degli stati dei coni di crescita, consentendo un confronto oggettivo tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Permette una valutazione allineata ai biomarcatori di composti che inibiscono l'endocitosi o ripristinano il collasso del citoscheletro.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di oligomeri dell'Aβ e di altri neurotossici in colture primarie di neuroni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando l'esposizione all'Aβ a modifiche citoscheletriche definite nei coni di crescita.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di imaging standardizzati e dipendenti dalla fissazione, compatibili con le infrastrutture neurobiologiche esistenti.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione identificando composti in grado di bloccare i primi danni strutturali indotti dall'Aβ.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei trattamenti mirati ai meccanismi pre-sinaptici nella malattia di Alzheimer, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura primaria di neuroni, nell'immunomarcatura e nella microscopia a fluorescenza.
- Presuppone l'accesso a microscopi invertiti, emocitometri e camere di coltura ambientali (10% CO2, 37°C).
- Necessita di protocolli standardizzati di aggregazione dell'Aβ (incubazione di 7 giorni a 37°C) per garantire la coerenza degli oligomeri tossici.
- Comporta un'ottimizzazione in base ai livelli di purezza neuronale (~75% in questo protocollo) e una potenziale variabilità nella morfologia dei coni di crescita.
- È limitato a saggi endpoint, a meno che non venga abbinato a imaging su cellule vive, poiché la fissazione esclude il monitoraggio longitudinale.
