Uso di Autometallography per localizzare e semi-quantificare argento nei tessuti dei cetacei

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia ambientale sulle distribuzioni di sottoorgani e sulla concentrazione di metalli pesanti all'interno dei sistemi biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che AMG è una metodologia facile da usare ed economica, che è un prezioso coadiuvante per lo studio dei metalli pesanti nei tessuti. Usiamo i tessuti di delfini e balene per dimostrare il protocollo.

Tuttavia, riteniamo che il protocollo potrebbe essere utilizzato in una varietà di specie animali. A dimostrare la procedura con Wen-Ta Li sarà Shun Theng, un clinico del nostro istituto. Inizia raccogliendo tessuti epatici e renali abbinati a coppia per l'analisi AMG da un cetaceo spiaggiato e fissando il tessuto in 10 volte il volume di formalina tamponata neutra al 10% per 24-48 ore.

Successivamente, utilizzare lame di microtomo monouso in acciaio inossidabile per tagliare i tessuti epatici e renali fissi in formalina in sezioni di due centimetri per un centimetro e tre millimetri e posizionare sia sezioni epatiche che renali dallo stesso individuo nelle stesse cassette etichettate. Disidratare le sezioni in un processore tissutale attraverso una serie di immersioni classificate in etanolo e xilene, seguite da immersioni in paraffina di un'ora e due ore. Dopo l'immersione in paraffina di due ore, trasferire i tessuti sul fondo degli stampi istologico in acciaio e incorporare i campioni di tessuto disidratato con paraffina fresca fusa.

Raffreddare i blocchi di tessuto fissati con paraffina su una piastra fredda, fino a quando la paraffina non si solidifica, e tagliare ogni blocco al microtomo fino a quando la superficie del tessuto non è esposta. Raffreddare i campioni a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti e ottenere sezioni di tessuto di cinque micrometri sul microtomo. Usando pinzette e spazzole, sollevare i nastri di sezione tissutale man mano che vengono acquisiti e galleggiarli sulla superficie di un bagno d'acqua a doppia distillazione di 45 gradi Celsius, fino a quando non possono essere separati, e posizionarli su singoli vetrini al microscopio.

Quindi, posizionare le diapositive su uno scivolo più caldo per un'ora, a 60 gradi Celsius. Quindi, posizionare le diapositive in rack di scorrimento e de-paraffinare le sezioni in tre diversi piatti di colorazione contenenti da 200 a 250 millilitri di puro non-xilene per incubazioni di otto-cinque e tre minuti. Idratare i campioni de-parrafinizzati in diversi piatti di colorazione di soluzioni di etanolo graduato, seguito da risciacquo in acqua doppia distillata.

Risciacquare le sezioni una volta in PBS integrato con 5%Triton X 100, più volte nel solo PBS e una volta in acqua fresca a doppia distillazione per 30 secondi per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare ogni campione con 300 microlitri di soluzione di kit di miglioramento dell'argento misto, per non più di 15 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con acqua doppia distillata e contro-macchiare le sezioni in 300 microlitri di ematossilina per scivolo, per 10 secondi.

Lavare gli scivoli con acqua corrente del rubinetto. Asciugarli e montare le sezioni con mezzo di montaggio. Quindi, cattura 10 immagini istologiche casuali di ogni sezione tissutale, sotto l'obiettivo 40X di un microscopio a luce.

Per analizzare l'autometallografia, o AMG, positività dei campioni, aprire le immagini in un programma software di analisi delle immagini appropriato e selezionare l'immagine, il tipo e lo stack RGB, per dividere la prima immagine nei canali di colore rosso, blu e verde. Nel canale blu, selezionare immagine, regolare e soglia, per misurare la percentuale dell'area con segnali AMG positivi in ogni immagine, regolando manualmente il valore di cut-off per la soglia di ogni immagine in base alla presenza di aree false positive nei nuclei, o globuli rossi. Fare clic su analizza e impostare le misure e controllare la frazione di area per specificare che la frazione di area viene registrata.

Fare clic su analizza e misura per visualizzare l'area percentuale positiva di ogni colonna dell'area percentuale immagine istologica della finestra dei risultati. Per valutare la correlazione tra i risultati della spettroscopia di massa plasmatica accoppiata induttivamente e i valori positivi all'AMG, aprire l'apposito software di grafica. Creare un nuovo file di progetto e selezionare XY e correlazione.

Inserire i risultati della spettroscopia di massa plasmatica accoppiata induttivamente e delle analisi AMG, e selezionare l'analisi, e la correlazione, per analizzare la forza di associazione tra i risultati dell'analisi mediante l'analisi di correlazione di Pearson. Nella finestra parametri di regressione non lineare selezionare un modello di regressione diverso nella pagina di adattamento e selezionare i metodi di confronto nella pagina di confronto. Includi la somma extra del test F dei quadrati e il criterio informativo di Akaike.

Secondo i risultati dei metodi di confronto, selezionare un modello di regressione relativamente appropriato nel saggio istologico dell'argento cetaceo e utilizzare il saggio per stimare le concentrazioni d'argento del fegato cetaceo e dei tessuti renali, con concentrazioni di argento sconosciute. I segnali positivi all'AMG includono granuli da marroni a neri di dimensioni variabili nel citoplasma degli epatociti e delle cellule di Kupffer, e occasionali segnali amorfo, dal giallo dorato al marrone AMG positivi nel lume e nella membrana basale di alcuni tubuli renali prossimali. Esiste una correlazione positiva tra i risultati della spettroscopia di massa plasmatica accoppiata induttivamente e i valori di positività AMG nei tessuti epatici e renali analizzati, con una regressione lineare preferita attraverso l'origine, secondo la somma extra del test F dei quadrati, e il criterio informativo di Akaike.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il metodo AMG è un metodo adiuvante e deve essere utilizzato con altri metodi specifici, come l'ICPMS, per monitorare l'effettiva composizione dei metalli pesanti nei tessuti.