Name: Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Impara a generare cellule NK umane primarie ed espanse con knockout genico utilizzando ribonucleoproteine Cas9. Questo metodo ad alta efficienza facilita la ricerca sull'immunoterapia dei tumori solidi.

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Riconosciamo Brian Tullius per il suo gentile aiuto nella redazione del manoscritto.

Buffy coats donatore sano sono stati ottenuti come materiale di partenza da Central Ohio regione American Red Cross. Questa ricerca è stata determinata per essere esentato ricerca ospedale pediatrico Nationwide di Board Review istituzionale.
1. espansione e purificazione delle cellule NK umana
<ol><li>Isolare i PBMCs da Buffy-Coat12.<ol>
<li>Livello 35 mL di campione di buffy-coat su 15 mL di Ficoll-Paque.</li>
		<li>Centrifugare a 400 x g per 20 minuti senza freno e raccogliere i PBMC dall'interfaccia.</li>
		<li>Lavare i PBMC recuperati tre volte con l'aggiunta di almeno un volume uguale di PBS, centrifugazione a 400 x g per 5 minuti e aspirando il PBC lavare. Cellula NK può essere isolata in questa fase di RosettesSep13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espandere le cellule NK stimolando con irradiati 10 x 106 mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore ai giorni 0, 7 e 14. Sostituire il supporto con fresco RPMI contenente 10% FBS, 1% glutammina, 1% penicillina streptomicina e 100 UI/mL del-2 per il volume intero media ogni altro giorno.</li>
</ol>2. gRNA progettazione e selezione
<ol><li>Scegliere i loci genomici specifici su target, utilizzando gli strumenti online, ad esempio, NCBI, Ensemble. Esempio. Descrizione: Trasformando il fattore di crescita recettore beta 2 (TGFBRR2) ectodomain Visualizzare record: PF08917 Mostra InterPro: IPR015013 Posizione: 49-157 aa Sequenza di mirati: Essone 4 del gene TGFBR2 (ENSG00000163513)</li>
	<li>Per progettare il gRNAs, utilizzare strumenti di web design CRISPR come http://crispr.mit.edu e 'Benchling.'<ol>
<li>Immettere nella sequenza del DNA scelta nel passaggio 2.1. Scegliere umani (hg 19) come un genoma di destinazione. CRISPR Guide (20 nucleotidi seguirono da una sequenza di PAM: NGG) verranno analizzati dalla sequenza inserita in precedenza. Viene inoltre illustrato possibili fuori bersaglio corrispondenze in tutto il genoma selezionato.</li>
		<li>Scegliere i migliori tre gRNAs che hanno il punteggio più alto, basato sulle loro tariffe on target e fuori bersaglio. Ad esempio, la tabella 1 Mostra il RNAs CRISPR progettato per indirizzare essone 4 del gene TGFBR2 suggerito da strumenti di web design CRISPR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordinare il RNAs CRISPR come sintetica sequenza-specifico crRNAs.</li>
	<li>Ordinare un conservato, transattivanti RNA (tracrRNA) per interagire attraverso parziale omologia con il crRNA.</li>
</ol>3. progettazione eliminazione primer di Screening
<ol><li>Disegnare primers che abbracciano i siti di fenditura gRNA per analisi di mutazione di T7E1.</li>
	<li>Uso primer almeno 100 bp lontano dal sito di clivaggio previsto affinché piccola inserzione-omissione (indels) presso il sito di destinazione sgRNA apparirà su gel di agarosio 1.5% seguendo l'analisi di mutazione. La tabella 2 Mostra i primer che sono utilizzati per amplificare il ectodomain TGFBR2.</li>
</ol>4. trasduzione di cellule NK umane primario e ampliato
Nota: Trasduzione degli elementi Cas9/RNP in NK avviene mediante elettroporazione con sistema 4D come segue.
<ol><li>
Cella Preparazione
	<ol>
<li>
Per primario delle cellule NK, incubare appena isolate cellule NK nel medium RPMI in presenza di 100 UI/mL del-2 per 4 giorni ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5. Sostituire il supporto ogni altro giorno, come descritto in precedenza e il giorno prima di trasduzione.</li>
		<li>
Per cellule NK espanse, stimolano le cellule al giorno 0 con cellule di alimentatore irradiati con un rapporto di 1:1 ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5 o 6 o 7. Sostituire il supporto ogni altro giorno, come descritto in precedenza e il giorno prima di trasduzione.</li>
		<li>Il giorno dell'elettroporazione, preparare una boccetta di T25 riempita con 8 mL di RPMI freschi contenenti 100 UI/mL del-2 per le cellule in fase di elettroporazione e boccette pre-incubate in un 37 ° C e 5% CO2 incubatrice umidificata. Nota: Le celle scongelate o che hanno subito 2nd o 3rd stimolazione può essere individulamente in qualsiasi momento dopo il loro recupero come descritto.</li>
		<li>Prendere 3-4 × 106 cellule per condizione per 26 µ l di miscela di trasduzione. Nota: Altissima concentrazione di cellule NK in soluzione di elettroporazione migliora il tasso di trasduzione.</li>
		<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere tutti i FBS, che contiene comunemente RNasi attività. Spin loro giù ogni volta a 300 x g per 8 minuti. Nota: Considera 7 condizioni di elettroporazione per Cas/RNP come singolo gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e una combinazione di due gRNAs (gRNA1 + gRNA3, gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2) e un controllo con nessun Cas9/RNP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formare il crRNA:tracerRNA / complessi
	<ol>
<li>Risospendere crRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e tracerRNA in 1 x TE soluzione a concentrazioni finali di 200 μM. 2.2 mix μL di ogni gRNA di 200 μM con 200 μM tracerRNA, come mostrato nella tabella 3.</li>
		<li>Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5 minuti e lasciare per raffreddare sulla parte superiore del banco a temperatura ambiente (15-25 ° C). Archivio risospese RNAs e crRNA: tracerRNA/complesso a-20 ° C per un uso successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formano il complesso RNP Nota: per risparmiare tempo, formare il RNP complesso durante il lavaggio punto 4.1.5.
	<ol>
<li>Per crRNA:tracrRNA singola reazione duplex, diluire Cas9 endonucleasi a 36 μM, come mostrato nell'esempio in tabella 4.</li>
		<li>Per la trasduzione di combinazione dei crRNA:tracrRNA duplex, diluire Cas9 endonucleasi a 36 μM come mostrato nell'esempio in tabella 5.
</li>
		<li>Aggiungere dell'endonucleasi Cas9 crRNA:tracrRNA duplex lentamente mentre agitando la punta della pipetta, oltre 30 s a 1 minuto.</li>
		<li>Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15-20 min. Se non è possibile utilizzare la miscela dopo incubazione, mantenere la miscela sul ghiaccio fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elettroporazione
	<ol>
<li>Aggiungere il supplemento intero alla soluzione di elettroporazione P3 e tenerlo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare (3-4 × 106 cellule dal punto 4.1.5) in 20 μL di soluzione di elettroporazione 4D primaria P3. Evitare le bolle d'aria durante il pipettaggio. Nota: le celle non devono essere lasciate per lungo tempo nella soluzione di P3.</li>
		<li>Immediatamente aggiungere 5 µ l di RNP complesse (punto 4.3) alla sospensione di cellule.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL 100 del rinforzatore di elettroporazione Cas9 μM a Cas9/RNP/cella di mescolare.</li>
		<li>Trasferimento mix Cas9/RNP/celle in 20 μL elettroporazione strisce.</li>
		<li>Picchiettare delicatamente le strisce per assicurarsi che il campione copre la parte inferiore delle strisce.</li>
		<li>Avviare il sistema di elettroporazione 4D e scegliere il programma EN-138 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. post trasduzione
<ol><li>Lasciare che le celle riposare per 3 minuti nelle strisce.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l di terreno di coltura pre-equilibrato per la cuvetta e trasferire delicatamente il campione in palloni.</li>
	<li>48 ore dopo la trasduzione, estrarre il DNA genomico da 5 × 105 celle per le eliminazioni di gene di screening.</li>
	<li>Amplificare il gene di interesse utilizzando il primer disegnati nel passaggio 3.2 con kit di Taq DNA polimerasi.</li>
	<li>Formare eteroduplici amplicone PCR per T7EI digestione e incubare il prodotto per 30-60 minuti con un enzima di T7EI a 37 ° C. Nota: Il T7EI assay è comodo per lo screening di quanto è veloce, semplice e fornisce pulito risultati elettroforesi rispetto all'utilizzo di analisi surveyor. Tuttavia, questo metodo non può rilevare inserimenti ed eliminazioni di < 2 basi che vengono generate dal non-omologo fine entrare in attività (NHEJ) nel Cas9 RNP esperimenti14.</li>
	<li>Eseguire il DNA digerito il 1,5% del gel dell'agarosi a 110 V per 30-45 minuti, ogni 15 minuti visualizzare il gel.</li>
	<li>Stimolare il resto delle cellule con il mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore con un rapporto di 1:1.</li>
	<li>Cinque giorni dopo stimolazione estrarre il RNA per livello di espressione genica mediante qPCR.</li>
	<li>Saggi di calceina condotta come precedentemente segnalato12. Brevemente, caricare le cellule bersaglio con calceina (nell'esempio illustrato, è stato utilizzato 3 celle DAOY µ g/mL/1.000.000). Preparare le cellule NK per saggi di citotossicità di una notte di riposo in IL2 (100 UI/mL) più o meno 10 ng/mL TGFβ solubile. Condurre la calceina saggi nelle stesse citochine come le cellule NK erano riposate in una notte.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
<li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li>
<li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%3A+Techniques+and+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266(2015).</li>
<li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9(2018).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li>
<li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261(2017).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li>
<li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition%2C+preparation%2C+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL serve/ha servito come consulente per corriere Therapeutics, ossidiana Therapeutics, Intellian Therapeutics, Merck Research Laboratories e Miltenyi Biotec e dispone di equità/Leadership in CytoSen Therapeutics.

Modificazione del DNA-dipendente delle cellule di NK è stato impegnativo4,9. Abbiamo, pertanto, introdotto direttamente un complesso ribonucleoproteico sinteticamente preformati (RNP) e la proteina Cas9 come proteina purificata nel primario ed espansa di cellule NK8. Questo metodo ci ha permesso di eliminare la tappatura, alle costole, e altri processi trascrizionali e traslazionali iniziato dalla RNA polimerasi II, che può causare l'apopt...

Immunoterapia del cancro è stato avanzato negli ultimi anni. Le cellule di T del recettore (auto) antigene chimerica geneticamente modificati sono un ottimo esempio di cellule immuni ingegnerizzate distribuito correttamente nell'immunoterapia del cancro. Queste cellule sono stati recentemente approvate dalla FDA per il trattamento contro CD19 + B delle cellule maligne, ma successo finora è stata limitata a malattie cuscinetto alcuni antigeni indirizzabile e targeting tale limitato repertorio antigenico è incline al fallimento di fuga immune. Inoltre, le cellule di T di auto sono state concentrate sull'uso di cellule T autologhe a causa del rischio di malattia dell'innesto - contro - ospite causata da cellule T allogeniche. Al contrario, le cellule NK sono in grado di uccidere il tumore obiettivi in maniera antigene-indipendente e non causano GvHD, che li rende un buon candidato per l'immunoterapia del cancro6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnologia è stata usata recentemente in ingegneria cellule immuni, ma geneticamente riprogrammazione delle cellule NK con plasmidi è sempre stato impegnativo. Questo è stato a causa di difficoltà nella consegna del transgene in un modo dipendente dalla DNA come trasduzione retrovirali e lentivirali causando sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK e la produzione limitata di geneticamente le cellule NK4 , 9.
Molte cellule immuni innate esprimono alti livelli di recettori per pattern molecolari associati come Retinoic acid inducible gene ho (RIG-io), che consentono maggiore riconoscimento di DNA estraneo. Soppressione di queste vie ha permesso una maggiore efficienza di trasduzione in cellule di NK quando si utilizzano metodi basati sul DNA per modificazione genetica10.
Qui descriviamo il metodo per l'utilizzo di un editing genomico privo di DNA di cellule NK primarie ed espanse utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Cas9/RNP è composto da tre componenti, ricombinante Cas9 proteina complessata con RNA di singolo-guida sintetico composto da complessato crRNA, tracerRNA. Questi Cas9/RNP sono capaci di scissione target genomici con maggiore efficienza rispetto agli approcci di DNA-dipendente stranieri a causa della loro consegna come funzionali complessi. Inoltre, uno sdoganamento rapido di Cas9/RNP dalle cellule può ridurre gli effetti di fuori bersaglio come induzione di apoptosi. Così, essi può essere utilizzati per generare il knock-out o knock-in quando combinato con il DNA per ricombinazione omologa6,7. Abbiamo mostrato che l'elettroporazione di Cas9/RNP è un metodo facile e relativamente efficiente che consente di superare i vincoli precedenti di modificazione genetica in cellule di NK.
TGFβ è una citochina immunosoppressiva principale, che inibisce l'attivazione e le funzioni delle cellule NK. È stato suggerito che il pathway TGFβ di targeting può aumentare le funzioni delle cellule immuni. Siamo presi di mira la regione codifica ectodomain di TGBR2 che lega TGFβ11. I risultati rappresentativi mostrano una diminuzione significativa del livello di espressione di mRNA di questo gene e dimostrano ulteriormente che le cellule NK modificate diventano resistenti a TGFβ. Inoltre, le celle modificate mantenere vitalità e potenziale proliferativo, come essi sono in grado di essere espanso post-elettroporazione utilizzando cellule di alimentatore irradiati. Di conseguenza, il metodo seguente è un promettente approccio per manipolare geneticamente le cellule NK per qualsiasi ulteriore clinico o scopi di ricerca.

<table><tbody><tr><td>RosettaSep&commercio; Cocktail di arricchimento delle cellule NK umane</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>15065</td><td>La rosettaSep&trade; Il cocktail di arricchimento delle cellule NK umane è progettato per isolare le cellule NK dal sangue intero mediante selezione negativa.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Scienze della vita</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072532</td><td>TracrRNA che contiene modifiche chimiche proprietarie che conferiscono una maggiore resistenza alla nucleasi. Si ibrida al crRNA per attivare l'enzima Cas9</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Tecnologie</td><td></td> DNA integrate <td>Prodotto sinteticamente come Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA, basato sulla sequenza di gRNA progettato che ha come bersaglio il gene dell'interesse</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Kit di rilevamento per l'editing del genoma</td><td>Tecnologie del DNA integrate</td> 1075931 <td>Ogni kit contiene l'endonucleasi T7EI, il tampone di reazione T7EI e i controlli del saggio T7EI.</td><td></td></tr><tr><td>Platino&reg; Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Sistema</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Proteina IL-2 ricombinante umana</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector&commercio; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>Contiene pmaxGFP&trade; Vettore, Nucleofector e commercio; Soluzione, Supplemento, 16 pozzetti Nucleocuvette&trade; Strisce</td></tr><tr><td>Non targeting: siRNA personalizzato, standard 0,05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nucleasi 3NLS</td><td>Tecnologie integrate del DNA</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nucleasi</td></tr><tr><td>DNeasy® Sangue & Manuale dei tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Kit di controllo CRISPR-Cas9,</td> Human <td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072554</td><td>include tracrRNA, crRNA a controllo positivo HPRT, crRNA a controllo negativo#1, miscela di primer HPRT e tampone duplex privo di nucleasi.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (soluzione 1X TE)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Potenziatore di elettroporazione Cas9</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>1075915</td><td>Potenziatore di elettroporazione Cas9</td></tr></tbody></table>

generazione di cellule knock-out nk umano primario ed espansa utilizzando cas9 ribonucleoproteine

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 tecnologia sta accelerando ingegneria genoma in molti tipi cellulari, ma finora, consegna del gene e modificazione genetica stabile sono stati impegnativi in cellule primarie di NK. Ad esempio, consegna di transgene mediante trasduzione lentivirale o retrovirali ha provocato una resa limitata delle cellule NK geneticamente a causa della sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK. Descriviamo qui un metodo privo di DNA per l'editing genomico umane primarie e ampliate delle cellule di NK utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Questo metodo ha permesso efficiente knockout del TGFBR2 e HPRT1 geni in cellule di NK. Dati di RT-PCR ha mostrato una diminuzione significativa nel livello di espressione genica, e un'analisi di citotossicità di un prodotto rappresentativo delle cellule ha suggerito che le cellule NK RNP-modificato è diventato meno sensibile di TGFβ. Cellule geneticamente modificate potrebbero essere espansa post-elettroporazione dalla stimolazione con irradiato mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore.

Efficienza di elettroporazione
Per ottimizzare l'elettroporazione di Cas9/RNP, abbiamo testato 16 programmi diversi con trasduzione di GFP non-targeting siRNA e plasmide del DNA in cellule NK. Analisi di citometria a flusso ha mostrato che l' EN-138 aveva la più alta percentuale di efficienza attuabilità e la trasduzione delle cellule (35% GFP positive cellule vive) per entrambe le particelle (...

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule NK sul ruolo e la funzione di specifici geni e percorsi che regolano la funzione delle cellule effettrici. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo alto tasso di successo rispetto agli approcci DNA-dipendenti, facilitando un knockout altamente efficiente di uno dei geni clinicamente più rilevanti nella terapia cellulare NK. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'immunoterapia dei tumori solidi e dei tumori cerebrali che esprimono il TGF-beta come mezzo di fuga immunitaria.Per la trasduzione primaria delle cellule NK, incubare da tre a 10 delle cinque cellule NK appena isolate per millilitro di terreno RPMI integrato con 100 UI per millilitro di IL2 per fiasco T75 per quattro giorni, sostituendo il terreno a giorni alterni e il giorno prima della trasduzione. Per la trasduzione espansa delle cellule NK, stimolare le cellule NK primarie al giorno zero con cellule feeder K562 irradiate legate alla membrana che esprimono IL21 con un rapporto uno a uno, sostituendo il terreno a giorni alterni e il giorno prima della trasduzione. Il giorno dell'elettroporazione, riempire u

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Questo video dimostra una tecnica per la modificazione genetica mediata da ribonucleoproteine Cas9 di cellule natural killer primarie (NK). Una ribonucleoproteina Cas9, costituita da un'endonucleasi Cas9 legata a un RNA guida (gRNA) formata dall'accoppiamento di basi di un RNA CRISPR (crRNA) e di un crRNA transattivante (tracrRNA), viene introdotta nelle cellule natural killer primarie tramite elettroporazione. La ribonucleoproteina prende di mira e scinde il DNA ospite nel sito bersaglio,...

Una tecnica per l'editing genetico nelle cellule natural killer utilizzando CRISPR Cas9

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed economico per caricare complessi di ribonucleoproteine Cas9/single-guide RNA (sgRNA) all'interno di particelle simili a virus. Queste particelle, chiamate "Nanoblades", consentono una consegna efficiente del complesso Cas9/sgRNA in cellule immortalizzate e primarie e in vivo.

Somministrazione del complesso ribonucleoproteico Cas9/sgRNA in cellule immortalizzate e primarie tramite particelle simili a virus ("Nanoblades")

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

Il protocollo descrive come generare mioblasti knock-out utilizzando CRISPR/Cas9, partendo dalla progettazione di RNA guida alla clonazione cellulare e alla caratterizzazione dei cloni knock-out.

Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus

Man mano che i protocolli relativi a CRISPR diventano sempre più utili e accessibili, possono ancora sorgere complicazioni e ostacoli in specifiche condizioni sperimentali. Questo protocollo delinea la creazione di una linea cellulare umana knockout per serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK1/RIP1) che interagisce con il recettore utilizzando CRISPR/Cas9 ed evidenzia le potenziali sfide incontrate durante questo processo.

Generazione di una linea cellulare RIP1 knockout U937 utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Impara a generare cellule NK umane primarie ed espanse con knockout genico utilizzando ribonucleoproteine Cas9. Questo metodo ad alta efficienza facilita la ricerca sull'immunoterapia dei tumori solidi.

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

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