Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine
14 giugno 2018
Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule NK sul ruolo e la funzione di specifici geni e percorsi che regolano la funzione delle cellule effettrici. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo alto tasso di successo rispetto agli approcci DNA-dipendenti, facilitando un knockout altamente efficiente di uno dei geni clinicamente più rilevanti nella terapia cellulare NK. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'immunoterapia dei tumori solidi e dei tumori cerebrali che esprimono il TGF-beta come mezzo di fuga immunitaria.
Per la trasduzione primaria delle cellule NK, incubare da tre a 10 delle cinque cellule NK appena isolate per millilitro di terreno RPMI integrato con 100 UI per millilitro di IL2 per fiasco T75 per quattro giorni, sostituendo il terreno a giorni alterni e il giorno prima della trasduzione. Per la trasduzione espansa delle cellule NK, stimolare le cellule NK primarie al giorno zero con cellule feeder K562 irradiate legate alla membrana che esprimono IL21 con un rapporto uno a uno, sostituendo il terreno a giorni alterni e il giorno prima della trasduzione. Il giorno dell'elettroporazione, riempire un pallone T25 con otto millilitri di terreno di coltura fresco integrato con 100 UI per millilitro di IL2 per condizione di cella sperimentale e posizionare i palloni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.
Mentre il terreno è in equilibrio, aggiungere da tre a quattro volte 10 alla sesta cellula per condizione per 26 microlitri di miscela di trasduzione in una provetta conica e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Quindi lavare le cellule tre volte in 12 millilitri di PBS sterile per lavaggio per rimuovere tutto l'FBS dalle sospensioni cellulari. Mentre le cellule vengono lavate, risospendere ciascun RNA CRISPR e tracrRNA a concentrazioni finali di 200 micromolari.
Mescolare 2,2 microlitri di ciascun RNA CRISPR con un volume di 200 micromolari di tracrRNA per campione e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente e conservare i complessi RNA/tracrRNA CRISPR a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al loro utilizzo. Per formare i complessi ribonucleoproteici, aggiungere l'endonucleasi Cas9 al corrispondente complesso CRISPR RNA/tracrRNA appropriato con roteazione nell'arco di 30-60 secondi e incubare i complessi ribonucleoproteici Cas9 risultanti a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere l'intero volume di integratore di elettroporazione del kit soluzione Nucleofector P3 e risospendere ogni pellet cellulare in 20 microlitri della soluzione primaria P3 4D-Nucleofector facendo attenzione a evitare bolle d'aria. Aggiungere immediatamente cinque microlitri di ciascun complesso ribonucleoproteico alla sospensione cellulare appropriata e aggiungere un microlitro di potenziatore di elettroporazione Cas9 da 100 micromolari alla miscela di cellule del complesso ribonucleoproteico Cas9. Trasferire 26 microlitri della soluzione cellulare di ribonucleoproteina Cas9 nei singoli pozzetti di una striscia di nucleocuvetta e picchiettare delicatamente la striscia per assicurarsi che i campioni coprano il fondo di ciascun pozzetto.
Quindi avviare il programma EN138 del sistema 4D-Nucleofector. Al termine della trasduzione, lasciare riposare le cellule per tre minuti. Quindi aggiungere 80 microlitri di terreno di coltura pre-bilanciato a ciascuna cuvetta e trasferire delicatamente i campioni in un pallone per condizione a un'incubazione di 37 gradi Celsius.
Dopo 48 ore di coltura, estrarre il DNA genomico da cinque volte 10 alle cinque cellule trasdotte per lo screening della delezione genica secondo i protocolli standard. Quindi stimolare il resto delle cellule trasdotte con cellule feeder fresche che esprimono IL21 legate alla membrana in un rapporto uno a uno ed estrarre l'RNA dopo cinque giorni di co-coltura secondo i protocolli standard per l'analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa. L'analisi della citometria a flusso rivela che il programma EN138 produce la più alta percentuale di vitalità cellulare ed efficienza di trasduzione rispetto ai programmi del sistema Nucleofector disponibili.
Ad esempio, utilizzando gli RNA guida forniti in commercio, l'HPRT1 umano viene eliminato con successo nelle cellule NK umane espanse. Inoltre, le ribonucleoproteine Cas9 contenenti RNA2 guida, RNA1 guida più RNA2 guida e RNA3 guida mostrano un knockout genico efficace del recettore TGF-beta a due ectodomini, mentre l'RNA1 guida da solo non induce alcuna dlezione di inserzione rilevabile T7E1. Infatti, l'utilizzo del programma EN138 per l'elettroporazione della ribonucleoproteina Cas9 determina una riduzione del 60% dell'espressione dell'mRNA del recettore TGF-beta 2 nelle cellule trasdotte tramite questo programma.
Inoltre, la co-coltura delle cellule trasdotte con TGF-beta e una linea cellulare di medulloblastoma primario umano non influisce significativamente sulla citotossicità delle cellule NK rispetto alle cellule trasdotte di controllo non trattate con TGF-beta, confrontandosi con una corrispondente mancanza della funzione del recettore 2 del TGF-beta nelle cellule modificate con ribonucleoproteina Cas9 a livello proteico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di progettare diversi RNA guida per trovare il miglior risultato di editing genetico.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento del DNA o il test della mutazione T7E1 per rispondere a ulteriori domande sull'efficienza dell'editing genetico o su come determinare potenziali mutazioni genetiche fuori bersaglio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunoterapia del cancro per esplorare il potenziale dell'utilizzo di cellule NK geneticamente modificate nel trattamento del cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'editing genetico delle cellule NK umane primarie.
Per ulteriori informazioni sull'espansione delle cellule NK dopo questo processo, consultare il nostro precedente articolo su Jove. Non dimenticare che lavorare con il sangue umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni universali per la salute e la sicurezza.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per modificare geneticamente le cellule natural killer (NK) umane utilizzando le Ribonucleoproteine Cas9 (Cas9/RNP). Il metodo permette la generazione di cellule NK carenti di TGFBR2 e HPRT1, facilitando la ricerca sulla biologia delle cellule NK e sull'immunoterapia.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Modifica genetica
Sfondo
- Le cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria.
- Comprendere le funzioni dei geni nelle cellule NK può migliorare gli approcci immunoterapici.
- I metodi attuali per la modifica genetica nelle cellule NK hanno delle limitazioni.
- Questo protocollo mira a migliorare l'efficienza del knockout genico nelle cellule NK.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per modificare le cellule NK.
- Indagare i ruoli di specifici geni nella funzione delle cellule NK.
- Esplorare le implicazioni per l'immunoterapia mirata ai tumori solidi.
Metodi utilizzati
- Isolamento e coltura di cellule NK primarie in mezzo RPMI.
- Trasduzione delle cellule NK utilizzando IL2 e cellule feeder.
- Elettroporazione per introdurre Cas9/RNP nelle cellule NK.
- Valutazione dell'efficienza e della funzionalità del knockout genico.
Risultati principali
- Generazione con successo di cellule NK carenti di TGFBR2 e HPRT1.
- Alto tasso di successo del knockout genico rispetto ai metodi tradizionali.
- Potenziali applicazioni nel miglioramento della terapia con cellule NK per i tumori.
- Approfondimenti sui meccanismi di fuga immunitaria nei tumori.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio robusto per la modifica delle cellule NK.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della biologia e della terapia delle cellule NK.
- Studi futuri possono sfruttare questa tecnica per applicazioni cliniche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
