Name: Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Scopri la caratterizzazione del microbioma degli zecche mediante sequenziamento 16S rRNA di nuova generazione. Questo protocollo bioinformatico consente alta replicazione e risoluzione per studiare le dinamiche dei patogeni trasmessi da vettori.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation concede a A.S. (DEB n. 1427772, 1745411, 1750037).

1. Selezionare raccolta e sterilizzazione superficiale
<ol><li>Raccogliere le zecche trascinando un 1m2 bianco panno sopra un habitat tick-collegata, rimuovere le zecche collegato a specie ospite o allevamento le zecche in laboratorio15,16. Utilizzare una pinzetta per manipolare le zecche e conservarli a-80 ° C.</li>
	<li>Posizionare le zecche dei singoli tubi di PCR e rimuovere contaminanti di superficie nel Vortex per 15 s successivamente con 500 μL di perossido di idrogeno (H2O2), etanolo al 70% e ddH2O.</li>
	<li>Inserire i segni di graduazione in un nuovo tubo PCR e lasciarli asciugare all'aria.</li>
	<li>In questo tubo, meccanicamente distruggere tessuti tick schiacciando le zecche con un mortaio e pestello (utilizzato in questo studio), utilizzando piccole perle in un battitore di tallone, o il segno di spunta di taglio con un bisturi.</li>
</ol>2. purificazione DNA
<ol><li>Purificare il DNA da singole zecche, seguendo le istruzioni fornite in un kit di estrazione di DNA disponibile in commercio. Eluire per un volume finale di 100 μL. Nota: Fare riferimento alla Figura 1 per una panoramica dei passaggi 2.2-2.8. Metodi di estrazione alternativi includono fenolo-cloroformio estrazione17,18, etanolo precipitazioni19o estrazione con un chelante del materiale20,21.</li>
	<li>Confermare il successo purificazione del DNA usando un fluorimetro o spettrofotometro. Per fluorimetria, utilizzare 10 μL della mascherina del DNA in un dosaggio di DNA double-stranded μL 190. Il rendimento atteso è 0.1-1.0 ng/μL22. Per spettrofotometria, utilizzare 1 μL della mascherina del DNA in una quantificazione degli acidi nucleici. Il rapporto A260/280 previsto è di circa 1,823.</li>
	<li>In caso contrario procedere immediatamente all'amplificazione, conservare i campioni a-20 ° C.</li>
</ol>3. amplificazione del Gene del rRNA 16S
<ol><li>Impostare l'amplicone PCR in una reazione di 27,5 μL contenente: 5 μL di ogni primer 1 μm; 12.5 μL di miscela di PCR commercialmente disponibile; e 5 μL di DNA Estratto da singole zecche ad una concentrazione di 5 ng/μL. Nota: Utilizzare i seguenti primer per l'amplificazione della regione ipervariabile V3-V4 del 16S rRNA gene13: 5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3', 5' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'</li>
	<li>Spostare i tubi in un termociclatore programmato per: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 25 cicli di 1) 95 ° C per 30 s, 2) 57 ° C per 30 s, 3) 72 ° C per 30 s; un'estensione finale a 72 ° C per 5 min; e una stretta finale a 10 ° C.</li>
	<li>Una volta fatto la PCR, è possibile visualizzare il prodotto PCR caricando μL di 4-6/campione su un gel di agarosio al 1.5%. Cercare una band a 460 bp per confermare l'amplificazione. Nota: Amplicone PCR prodotto potrebbe non essere visibile sul gel se la concentrazione del campione è troppo bassa (< 10 ng). Presenza di dimero di primer è comune nei campioni a bassa concentrazione. Se le altre bande non bersaglio sono presenti, regolare la temperatura di ricottura o diminuire il numero di cicli.</li>
	<li>In caso contrario procedere immediatamente alla purificazione, conservare i campioni a 4 ° C.</li>
</ol>4. 16S amplicone purificazione
<ol><li>Usando un nuovo tubo PCR per ogni campione, combinare il prodotto PCR con ddH2O ottenere 60 μL totale. Per campioni con basse concentrazioni di DNA, è possibile eseguire amplicone PCR in triplice copia per ridurre i pregiudizi di amplificazione e i campioni di concentrare della piscina.</li>
	<li>Portare paramagnetici perline a temperatura ambiente e agitare che bene prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 48 μL di perline paramagnetici a 60 μL del campione e incubare per 5 min posto i tubi su un rack magnetico per 5 minuti fino a quando la soluzione diventa chiaro. Eliminare il surnatante. Nota: Questa concentrazione di perlina rivolge la rimozione di dimeri dell'iniettore (< 60 bp). Se necessario, regolare la concentrazione di tallone per rimuovere altre bande non specifiche.</li>
	<li>Con tubi su rack magnetico, aggiungere 500 μL di preparate 80% EtOH. Immediatamente dopo l'aggiunta di EtOH a tutte le provette, dispensare il liquido. Non rimuovere le perline. Ripetere l'EtOH aggiunta e la rimozione una volta di più.</li>
	<li>Asciugare i campioni per rimuovere l'eccesso EtOH lasciando i tubi aperti sul rack magnetico per 5 minuti, o fino a piccole crepe sono visibili nelle perle.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di buffer di TE e incubare i campioni fuori il magnete, a temperatura ambiente per 5-10 min.</li>
	<li>Posizionare i tubi indietro sul magnete. Una volta che le perline e i liquidi sono separati, è possibile trasferire il surnatante in una nuova provetta per ottenere il prodotto PCR pulito.</li>
	<li>(Opzionale) Visualizzare il prodotto per confermare il successo amplicone purificazione caricando μL di 4-6/campione su un gel di 1,5%. La band di bp 460 dovrebbe essere visibile, e non ci dovrebbe essere nessun dimero di primer.</li>
	<li>Se non procedere immediatamente all'indice PCR, conservare i campioni 4 ° C.</li>
</ol>5. codici a barre e purificazione del campione
<ol><li>Assegnare combinazioni di primer univoco a ciascun campione selezionando primer avanti o indietro, o entrambi, da un kit di indice di libreria disponibili in commercio. Nota: In modo univoco etichettatura campioni permette differenziazione dopo la sequenziazione. Kit in genere forniscono abbastanza primer per 96-384 campioni di sequenza.</li>
	<li>Allegare il primer dual o indici, ai campioni eseguendo PCR in una reazione di 25 μL contenente 2,5 µ l di ciascun primer (N7xx e S5xx), 12,5 μL di mix master di PCR commercialmente disponibili, 5 μL di ddH2O e 2,5 µ l di prodotto pulito amplicon.</li>
	<li>Spostare i tubi in un termociclatore programmato per: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 8-14 cicli di 1) 95 ° C per 30 s, 2) 55 ° C per 30 s, 3) 72 ° C per 30 s; un'estensione finale a 72 ° C per 5 min; e una stretta finale a 10 ° C.</li>
	<li>Una volta fatto la PCR, è possibile visualizzare il prodotto PCR caricando μL di 4-6/campione su un gel di agarosio al 1.5%. Cercare una band a 550 bp per confermare l'amplificazione. Nota: Utilizzare i risultati di visualizzazione per informare condizioni ciclismo Indice PCR. Abbassare il numero di cicli di mitigare il legame non specifico o aumentare il numero di cicli per ottenere bande visibili per ogni campione.</li>
	<li>Ripetere la procedura di pulizia elencata nel passaggio 4. Per evitare la diluizione durante la pulizia, eseguire Indice PCR in duplicato e piscina il prodotto qui.</li>
	<li>In caso contrario procedere immediatamente alla quantificazione di biblioteca e normalizzazione, conservare i campioni a 4 ° C.</li>
</ol>6. normalizzazione e quantificazione biblioteca
<ol><li>Stimare la concentrazione di ogni prodotto purificato, con codice a barre dal passaggio 5.5 utilizzando un fluorimetro o spettrofotometro (Vedi punto 2.2). Diluire i campioni in buffer di TE per ottenere concentrazioni di circa 13. Nota: La quantificazione di libreria è necessaria per raggiungere il concentrazione raccomandata per la piattaforma di sequenziamento di carico del campione. Quantificazione di biblioteca è raggiunta attraverso qPCR, ma stimare la concentrazione del campione prima della qPCR di risparmiare tempo e reagenti. La concentrazione di 13 è consigliata per massimizzare la precisione di quantificazione di libreria, come questo è la concentrazione media degli standard qPCR fornito nella quantificazione kit24.</li>
	<li>Eseguire qPCR in una reazione di 10 μL contenente 6.0 μL di mix master qPCR (dal kit di quantificazione di biblioteca), 2.0 μL di ddH2O e 2.0 μL di campione o standard. Eseguire ogni campione e standard in triplice copia per una maggiore accuratezza e precisione. Eseguire ogni campione a tre o più livelli di diluizione (ad es., 12:01, 1 pm e 22 per le concentrazioni di partenza stimate) per garantire la quantificazione accurata. Nota: Informazioni dettagliate sui primer fornito e le norme variano a seconda del kit di quantificazione utilizzato e sono disponibili nella scheda tecnica prodotti. Fare riferimento alla Tabella materiali per il kit di quantificazione utilizzato in questo studio.</li>
	<li>Spostare la piastra qPCR o tubi a uno strumento PCR in tempo reale programmato per: una denaturazione iniziale di 95 ° C per 5 min; 35 cicli di 1) 95 ° C per 30 s e 2) 60 ° C per 45 s; e un passo di dissociazione di 1) 95 ° C per 15 s, 2) 60 ° C per 30 s e 3) 95 ° C per 15 s.</li>
	<li>Calcolare la media a partire di concentrazione per ciascun campione, utilizzando i valori di quantificazione ottenuti dai risultati qPCR e i livelli di diluizione del campione utilizzati. Nota: per esempio, una concentrazione media di 14 per un campione diluito 1: 100 000 produce una concentrazione di partenza originale di 200 nM. Se nessuno dei livelli di diluizione per un dato campione cade all'interno della gamma delle curve standard, quantificazione risultati potrebbero non essere accurati; in questo caso, regolare i livelli di diluizione e ri-eseguire qPCR.</li>
	<li>Diluire ogni campione purificato, con codice a barre a 4 nM nel buffer di TE, basato sulle concentrazioni media calcolato nel passaggio 7.5. Nota: ad esempio, per una concentrazione di campione medio di 200 nM, diluire il campione 01:50 in TE buffer per raggiungere una concentrazione di 4 nM. La concentrazione del campione precisi variano in base del kit di sequenziamento sistema e reagente utilizzato. Consultare la Guida utente sistema di sequenziamento per la concentrazione consigliata.</li>
	<li>Creare la libreria combinata aggiungendo volumi uguali (in genere 5-10 µ l) di tutte le singole librerie in un unico tubo. Nota: come tutti i campioni dovrebbero essere ad una concentrazione di nM 4, aggiungendo volumi uguali raggiunge una concentrazione uguale di tutti i campioni nella libreria in pool.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 6.2-6.4 sulla libreria combinata per confermare la concentrazione di nM 4.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di libreria combinata e diluire o ri-costituiscono la libreria finale, pool utilizzando tampone Tris come necessario per ottenere 4 nM.</li>
	<li>In caso contrario procedere immediatamente al caricamento del campione, conservare i campioni a-20 ° C. Eseguire il sequenziamento eseguito poco dopo la quantificazione per ridurre al minimo perdite o modifiche alla concentrazione di DNA durante la conservazione.</li>
</ol>7. Biblioteca denaturazione e diluizione e il sequenziamento eseguire (eseguire nello stesso giorno)
<ol><li>Denaturare la libreria combinata di 4 nM dal punto 6.9 con NaOH. Nota: Questa procedura di preparazione finale biblioteca variano per ogni sistema di sequenziamento. Consultare la Guida utente sistema di sequenziamento per protocolli più dettagliati e aggiornati. Nuovi utenti saranno probabilmente bisogno di essere addestrati sull'utilizzo della piattaforma di sequenziamento o possono inviare loro librerie ad un impianto di sequenziamento di nucleo.</li>
	<li>Diluire la libreria denaturata alla concentrazione di caricamento desiderato utilizzando il buffer fornito il kit di reagenti di sequenziamento (Tabella materiali). Nota: Le concentrazioni di carico ottimale variano da sistema di sequenziamento e in genere vanno da 1-250 pM25.</li>
	<li>Denaturare e diluire il controllo di sequenziamento. Nota: L'aggiunta di un controllo di sequenziamento corregge problemi di sequenza derivanti dalle librerie di bassa diversità. Denaturare il controllo di sequenza usando NaOH e diluire alla stessa concentrazione della libreria.</li>
	<li>Combinare la biblioteca e il controllo di sequenziamento. Nota: Il rapporto del controllo di sequenziamento per libreria combinata dipenderà la biblioteca diversità e sequenziazione utilizzato, ma è in genere 1:126.</li>
	<li>Caricare la libreria combinata e la sequenziazione controllo miscela nella cella di flusso di sequenziamento.</li>
</ol>8. degli ampliconi analisi
<ol><li>Valutare il successo globale dell'esecuzione esaminando le metriche di esecuzione sull'ambiente di cloud computing corrispondente al sistema di sequenziamento utilizzato. Nota: Le metriche di esecuzione, ad esempio il numero di letture di sequenziamento, variano in base il sequenziamento kit piattaforma e reagente utilizzato. I valori di destinazione per i sistemi di ordinamento comuni sono elencati nella tabella 1.</li>
	<li>Scaricare i dati di sequenziamento crudo e bioinformatica desiderato software open source, intuizioni quantitativa di ecologia microbica (QIIME)27 o Mothur28. Nota: Entrambi QIIME e Mothur sono open source e gratuito da scaricare. Istruzioni dettagliate sull'utilizzo di questi programmi si possono trovare online e sono sufficientemente dettagliate per gli utenti inesperti. La procedura riportata di seguito fornita un'ampia panoramica di una pipeline di bioinformatica condotta in QIIME. Familiarità con python non è necessaria ma faciliterà l'attuazione dei seguenti script</li>
	<li>Creare e convalidare il file di mapping utilizzando lo script "validate_mapping_file.py" nel QIIME. Nota: Il file di mapping contiene tutti i metadati necessari per eseguire analisi di dati, tra cui ID campione, amplicone sequenze dell'iniettore e descrizione del campione. Il passaggio di convalida controlla che tutti i dati necessari sono stati immessi nel formato corretto.</li>
	<li>Demultiplex e filtrare sequenze utilizzando lo script "split_libraries.py" (Figura 1). Nota: Questo script assegna letture con codice a barre per i campioni in base alle combinazioni di primer indice e ID campione in ingresso nel file di mapping. Esegue anche diverse qualità passi al controllo per la sequenziazione di errore basato su cut-off definito dall'utente per il Punteggio di qualità minima, lunghezze di sequenza e fine-taglio di filtraggio.</li>
	<li>Assegnare unità tassonomica operative (OTUs) a sequenze utilizzando lo script "pick_open_references_otus.py". Nota: In questo passaggio, le sequenze sono raggruppate contro un insieme di sequenza di riferimento basato su una soglia di identità (in genere 97%). Letture che non corrispondono la collezione di sequenza di riferimento sono ragruppate uno contro l'altro. Sono inoltre disponibili de novo e chiuso-riferimento OTU opzioni di prelievo, ma Apri-riferimento picking è consigliato dagli sviluppatori di QIIME.</li>
	<li>Normalizzare la tabella OTU utilizzando lo script "alpha_rarefaction.py" o "normalize_table.py". Nota: Questo passaggio corregge per variazione in somme di colonna o sequenza totale legge per campione, che derivano da tecnologie di sequenziamento moderno. Normalizzazione può essere eseguita utilizzando tradizionali rarefazione, o attraverso metodi alternativi come lo scaling somma cumulativa.</li>
	<li>Eseguire diversi alfa-diversità, beta-diversità e analisi di diversità di composizione tassonomica contemporaneamente utilizzando lo script "core_diversity_analysis.py". Nota: In alternativa, queste analisi possono essere eseguite separatamente utilizzando i singoli script (per esempio, "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Prossima generazione sequenziamento del 16S rRNA è diventato un approccio standard per identificazione microbica e attivato lo studio di come vettore microbiomi influenzano la trasmissione dell'agente patogeno. Il protocollo descritto qui dettagli l'uso di questo metodo per indagare l'Assemblea della comunità microbica in I. pacificus, una specie vettore per la malattia di Lyme; Tuttavia, può essere applicato facilmente per studiare altre specie del battito o specie artropodi vettori.
<p class="jove_content"...

La rinascita e la diffusione di malattie trasmesse da vettori negli ultimi decenni una minaccia seria alla salute globale di umani e animali selvatici. Vaccini efficaci sono carenti per la maggior parte di queste malattie, e gli sforzi di controllo sono ostacolati dalla natura biologica complessa di vettori e interazioni ospite-vettore. Comprensione del ruolo delle interazioni microbiche all'interno di un vettore nella trasmissione dell'agente patogeno può consentire lo sviluppo di nuove strategie che eludere queste sfide. In particolare, interazioni tra vettore associato microbiche commensali, simbionti e patogeni, indicati come il microbioma, possono avere conseguenze importanti per la trasmissione di agenti patogeni. Prove schiaccianti ora supporta questa asserzione, con esempi che dimostrano un collegamento tra il vettore microbiome e competenza per malattie come la malaria, virus di Zika e malattia di Lyme1,2,3. Tuttavia, tradurre questi risultati in strategie per il controllo della malattia richiede una comprensione molto più dettagliata della struttura, funzione e origine del vettore microbiomi. Identificazione e caratterizzazione della comunità microbica vettoriale sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentali costituiscono un importante percorso in avanti in questo campo.
Qui è disponibile una procedura per identificare i residenti microbici di un vettore patogeno utilizzando il Western battito nero-fornito di gambe, pacificus di Ixodes, una specie di vettore dell'agente patogeno la malattia di Lyme Borrelia burgdorferi. Mentre le zecche del porto più tipi di agenti patogeni umani rispetto a qualsiasi altri artropodi, relativamente piccolo è conosciuto circa l'ecologia biologia e comunità di tick microbiomi4. È evidente che le zecche harbor una gamma diversificata di virus, batteri, funghi e protozoi sono commensali, endosimbionti e residenti microbica transitoria5,4. Lavoro precedente ha dimostrato forti variazioni in Ixodes microbiomi associati di geografia, specie, sesso, fase di vita e di farine di sangue fonte6,7,8. Tuttavia, i meccanismi alla base di questa variazione rimangono sconosciuti e garantiscono che più dettagliate indagini sull'origine e l'assemblaggio di queste comunità microbiche. Le zecche possono acquisire i microbi attraverso trasmissione verticale, contatto con padroni di casa e l'assorbimento dall'ambiente attraverso gli spiracoli, bocca e poro anale9. Comprendere i fattori che determinano la formazione iniziale e lo sviluppo del microbioma tick, in particolare il contributo relativo di trasmissione verticale e ambientale, è importante per comprendere i modelli naturali e le variazioni in segno di graduazione microbioma diversità e come queste comunità interagiscono durante la trasmissione di agenti patogeni, con possibili applicazioni per controllo di malattia o vettoriale.
Potenti tecniche molecolari, come ad esempio il sequenziamento di nuova generazione, ora esistono per identificare le comunità microbiche e possono essere impiegati per caratterizzare vettoriale microbiomi sotto diverse condizioni ambientali o sperimentale. Prima dell'avvento di questi approcci di sequenziamento ad alte prestazioni, l'identificazione di microbi invocata principalmente la microscopia e la cultura. Mentre la microscopia è una tecnica rapida e facile, i metodi morfologici per l'identificazione di microbi sono inerentemente soggettivo e grossolana e limitato dalla bassa sensibilità e rilevamento di10. Metodi basati sulla cultura sono ampiamente utilizzati per identificazione microbica e possono essere utilizzati per determinare la suscettibilità dei microbi al farmaco trattamenti11. Tuttavia, questo metodo soffre anche di bassa sensibilità, come è stato stimato che meno del 2% dei microbi ambientali possono essere coltivato in un laboratorio impostazione12. Approcci di macchiatura istologici sono stati impiegati anche per rilevare e localizzare i microbi specifici all'interno di vettori, attivare indagini di varie distribuzioni di taxa all'interno il segno di spunta e studiare ipotesi circa le interazioni microbiche. Tuttavia, previa conoscenza dell'identità microbica è necessaria per la selezione le macchie appropriate, rendendo questo approccio inadatte per l'identificazione e caratterizzazione microbica. Inoltre, macchiatura istologica è un processo laborioso ad alta intensità di tempo e non si adatta bene per campioni di grandi dimensioni. Approcci molecolari tradizionali quali Sanger sequenziamento similmente sono limitati nella loro sensibilità e l'individuazione delle diverse comunità microbiche.
Sequenziamento di nuova generazione consente la rapida identificazione di microbi da un gran numero di campioni. La presenza di geni marcatori standard e consente maggiori database di riferimento enhanced risoluzione tassonomica, spesso a livello di genere o specie. Piccola unità secondaria ribosomal RNA sono frequentemente usati per raggiungere questo obiettivo, con 16S rRNA è il più comune a causa della presenza delle regioni conservate e variabile all'interno del gene, che permette la creazione di primers universali con ampliconi univoco per ogni batterico specie13,14. Questo rapporto dettaglia una procedura per l'identificazione dei taxa nel microbioma tick tramite sequenziamento del 16S rRNA generazione. In particolare, questo protocollo sottolinea i passaggi coinvolti nella preparazione dei campioni per il sequenziamento. Più generalizzata, dettagli sul sequenziamento e bioinformatica passaggi sono forniti, così come ci sono una varietà di piattaforme di sequenziamento e analisi programmi attualmente disponibili, ciascuno con ampia documentazione esistente. La fattibilità complessiva di questo approccio di sequenziamento di nuova generazione è dimostrata applicandolo ad un'indagine dell'Assemblea della comunità microbica all'interno di un vettore di malattia chiave.

<table><tbody><tr><td>Nome dell'articolo del materiale/attrezzatura</td><td>Catalogo dell'azienda</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood & Kit Tessuto</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 Fluorimetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>Spettrofotometro NanoDrop 8000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>perline AMPure XP</td><td>Agen Court</td><td>A63880&nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>Rack magnetico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>tampone TE</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Kit indice Nextera</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>Kit di quantificazione libreria KAPA</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>Sistema MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>Kit reagenti 10</td><td>MiSeq v3&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 mM Tris-HCl con 0,1% Tween 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

tick microbiome caratterizzazione ordinando amplicon del rrna 16s di prossima generazione

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Negli ultimi decenni, malattie trasmesse da vettori sono riemerse e ampliato a tassi, causando una notevole morbilità e mortalità in tutto il mondo in modo allarmante. Per la maggior parte di queste malattie, che richiedono lo sviluppo di strategie di mitigazione del romanzo malattia stanno difettando di vaccini efficaci e ampiamente disponibili. A tal fine, una strada promettente di controllo della malattia coinvolge il microbioma vettoriale, la comunità di microbi che abitano il vettore di targeting. Il microbioma vettore svolge un ruolo fondamentale nelle dinamiche di agente patogeno, e manipolazioni del microbioma hanno portato a vector ridotta trasmissione di abbondanza o di agenti patogeni per una manciata di malattie trasmesse da vettori. Tuttavia, tradurre questi risultati in applicazioni di controllo di malattia richiede una conoscenza approfondita dell'ecologia microbica di vettore, storicamente limitato dalla tecnologia insufficiente in questo campo. L'avvento di approcci di sequenziamento di nuova generazione ha permesso sequenza rapida, altamente parallelo di diverse comunità microbiche. Gene del rRNA 16S altamente conservata di targeting ha facilitato caratterizzazioni di microbi presenti all'interno di vettori sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentale. Questa tecnica comporta l'amplificazione del gene del rRNA 16S, codici a barre campione tramite PCR, caricamento campioni su una cella di flusso per il sequenziamento, e bioinformatica si avvicina per abbinare i dati di sequenza con informazioni filogenetiche. Specie o identificazione a livello di genere per un numero elevato di repliche in genere può essere raggiunto attraverso questo approccio, aggirando così le sfide di rilevamento basso, ad alta risoluzione e uscita da coltura tradizionale, microscopia o macchiatura istologica tecniche. Pertanto, questo metodo è particolarmente adatto per la caratterizzazione di microbi di vettore in condizioni diverse, ma attualmente non può fornire informazioni sulla funzione microbica, posizione all'interno del vettore, o risposta al trattamento antibiotico. Nel complesso, la generazione 16S è una tecnica potente per comprendere meglio l'identità e il ruolo dei microbi di vettore nelle dinamiche di malattia.

Un totale di 42 tick dall'uovo separato tre frizioni e due periodi di esposizione ambientale, 0 e 2 settimane nel terreno, sono stati elaborati per il microbioma sequenziamento. Ciascun gruppo di trattamento, considerato una sola volta di frizione e l'esposizione, contenuta 6-8 tick campioni replicati. Questi estratti di graduazione trasformati sono stati caricati su un sequencer di prossima generazione e ha reso 12,885,713 fine accoppiato letture passando il filtro. Incluso in questa ese...

Qui presentiamo un protocollo di sequenziamento di nuova generazione per rRNA 16S che consente l'identificazione e la caratterizzazione delle comunità microbiche all'interno di vettori. Questo metodo prevede l'estrazione di DNA, amplificazione e codici a barre dei campioni mediante PCR, sequenziamento su una cella di flusso e la bioinformatica per abbinare i dati di sequenza filogenetica informazioni.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia delle malattie trasmesse da vettori, come ad esempio, quale ruolo svolge il microbioma vettore nella dinamica dei patogeni e come si formano e variano i microbiomi vettori? I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente un'elevata replicazione e un'alta risoluzione e identificazione, consentendo all'utente di caratterizzare accuratamente il microbioma vettoriale in condizioni ecologiche e ambientali variabili. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante, poiché le fasi di configurazione del sequenziamento del microbioma sono difficili da imparare e ci sono molti prodotti e tecniche diverse, ma poche risorse disponibili per apprendere queste fasi.Iniziare questa procedura con la raccolta delle zecche, come descritto nel protocollo di testo. Per rimuovere i contaminanti superficiali dalle zecche, aggiungere 500 microlitri di perossido di idrogeno e agitare per 15 secondi. Ripetere questo lavaggio con etanolo al 70%, quindi acqua distillata due volte.Metti le zecche in una nuova provetta per PCR e lasciale asciugare all'aria. In questo tubo, disgregare meccanicamente i tessuti delle ze

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Caratterizzare la comunità microbica è stato un obiettivo di lunga data nella microbiologia ambientale. I metodi di sequenziamento di nuova generazione consentono ora la caratterizzazione delle comunità microbiche a una profondità senza precedenti, con costi e manodopera minimi. Descriviamo qui il nostro approccio al sequenziamento dei geni dell'RNA ribosomiale batterico 16S utilizzando un sequenziatore da banco.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito (BSAS) è un metodo per quantificare la metilazione della citosina in regioni genomiche mirate di interesse. Questo metodo utilizza la conversione del bisolfito abbinata all'amplificazione PCR delle regioni target prima del sequenziamento di nuova generazione per produrre una quantificazione assoluta della metilazione del DNA a livello base-specifico.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Scopri la caratterizzazione del microbioma degli zecche mediante sequenziamento 16S rRNA di nuova generazione. Questo protocollo bioinformatico consente alta replicazione e risoluzione per studiare le dinamiche dei patogeni trasmessi da vettori.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

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