Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia delle malattie trasmesse da vettori, come ad esempio, quale ruolo svolge il microbioma vettore nella dinamica dei patogeni e come si formano e variano i microbiomi vettori? I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente un'elevata replicazione e un'alta risoluzione e identificazione, consentendo all'utente di caratterizzare accuratamente il microbioma vettoriale in condizioni ecologiche e ambientali variabili. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante, poiché le fasi di configurazione del sequenziamento del microbioma sono difficili da imparare e ci sono molti prodotti e tecniche diverse, ma poche risorse disponibili per apprendere queste fasi.

Iniziare questa procedura con la raccolta delle zecche, come descritto nel protocollo di testo. Per rimuovere i contaminanti superficiali dalle zecche, aggiungere 500 microlitri di perossido di idrogeno e agitare per 15 secondi. Ripetere questo lavaggio con etanolo al 70%, quindi acqua distillata due volte.

Metti le zecche in una nuova provetta per PCR e lasciale asciugare all'aria. In questo tubo, disgregare meccanicamente i tessuti delle zecche schiacciando le zecche con un mortale e un pestello. Purificare il DNA dalle singole zecche, seguendo le istruzioni fornite in un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio.

Eluire fino a un volume finale di 100 microlitri. La creazione di un controllo negativo nella fase di estrazione è fondamentale per differenziare successivamente i contaminanti sospetti dai veri microbi vettori. L'uso di tecniche sterili durante la fase di estrazione e le successive fasi di PCR è necessario anche per ridurre al minimo l'impatto della contaminazione comune nel sequenziamento 16S.

Impostare l'amplicon PCR in una reazione da 27,5 microlitri contenente cinque microlitri di ciascun primer a un micromolare e 12,5 microlitri di miscela PCR disponibile in commercio. Includi anche cinque microlitri di DNA estratto da singole zecche a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitro. Spostare le provette su un termociclatore ed eseguire il programma elencato nel protocollo di testo.

Una volta terminata la PCR, visualizza il prodotto PCR caricando da quattro a sei microlitri per campione su un gel di agarosio all'1,5%. Cerca una banda a 460 coppie di basi per confermare l'amplificazione. Utilizzando una nuova provetta per PCR per ogni campione, combinare il prodotto PCR con acqua a doppia distillazione per ottenere un totale di 60 microlitri.

Per i campioni con basse concentrazioni di DNA, eseguire la PCR con amplicone in triplicato per ridurre la distorsione di amplificazione e raggruppare i campioni per concentrarli. Portare le perle paramagnetiche a temperatura ambiente e farle vorticare bene prima dell'uso. Aggiungere 48 microlitri di perle paramagnetiche a 60 microlitri di campione e incubare per cinque minuti.

Posizionare le provette su una griglia magnetica per cinque minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Quindi, rimuovere il surnatante. Con i tubi sul rack magnetico, aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80% appena preparato.

Immediatamente dopo aver aggiunto l'etanolo a tutte le provette, pipettare il liquido, non rimuovere le perline. Ripetere l'aggiunta e la rimozione dell'etanolo ancora una volta. Asciugare i campioni all'aria per rimuovere l'etanolo in eccesso lasciando le provette aperte sul rack magnetico per cinque minuti o fino a quando non sono visibili piccole crepe nelle perline.

Ora, aggiungere 20 microlitri di tampone TE e incubare i campioni dal magnete a temperatura ambiente. Dopo cinque-10 minuti, riposizionare i tubi sul magnete. Una volta separate le perle e il liquido, trasferire i surnatanti in una nuova provetta per ottenere il prodotto PCR pulito.

Assegna combinazioni di primer uniche a ciascun campione, selezionando i primer diretti o inversi o entrambi da un kit di indice della libreria disponibile in commercio. Per applicare i doppi primer o indici ai campioni, preparare una reazione PCR contenente 2,5 microlitri di ciascun primer, 12,5 microlitri di PCR Master Mix disponibile in commercio, cinque microlitri di acqua a doppia distillazione e 2,5 microlitri di prodotto amplicon pulito. Spostare le provette su un termociclatore programmato come descritto nel protocollo di testo.

Una volta terminata la PCR, visualizza il prodotto PCR caricando da quattro a sei microlitri per campione su un gel di agarosio all'1,5%. Cerca una banda a 550 coppie di basi per confermare l'amplificazione prima di eseguire la procedura di pulizia come prima. Per eseguire una quantificazione accurata di ciascun prodotto con codice a barre purificato, eseguire la qPCR su ciascun campione e lo standard in triplicato ed eseguire ogni campione a tre o più livelli di diluizione.

Preparare reazioni qPCR da 10 microlitri contenenti sei microlitri di qPCR Master Mix, due microlitri di acqua a doppia distillazione e due microlitri del campione o dello standard. Spostare la piastra qPCR su uno strumento PCR in tempo reale programmato come descritto nel protocollo di testo ed eseguire l'esecuzione. Dopo la quantificazione, creare la libreria combinata aggiungendo volumi uguali di tutte le singole librerie in un'unica provetta.

Dopo aver diluito e denaturato la libreria combinata e il controllo di sequenziamento, caricare la miscela combinata sulla cella a flusso di sequenziamento. Pulire accuratamente la cella di flusso prima del caricamento per un'ottica ottimale. Quindi, caricare la cella di flusso sul sequenziatore ed eseguire l'analisi della sequenza dell'amplicona.

Le curve di rarefazione per la normalizzazione del conteggio delle sequenze sono mostrate qui. Queste curve indicano che la rarefazione a 2000 sequenze per campione dovrebbe essere sufficiente per catturare l'intera diversità delle unità tassonomiche operative osservate. Dopo la rarefazione e il filtraggio di qualità delle letture della sequenza, viene eseguito l'output della diversità alfa e beta.

Qui è mostrato un grafico di analisi delle coordinate principali generato automaticamente che descrive come la composizione del microbioma delle zecche differisce in base al trattamento. Inoltre, la visualizzazione dei microbi presenti all'interno di ciascun campione, mostrata qui a livello di phylum, viene creata automaticamente per tutti i campioni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una tecnica sterile per ridurre al minimo l'effetto della contaminazione microbica che può influire in modo critico sull'interpretazione dei dati della sequenza.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione istologica per rispondere a ulteriori domande come: dove si trovano i microbi osservati all'interno del vettore? Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ecologia molecolare per esplorare il ruolo delle interazioni microbiche all'interno del vettore e studiare come questo possa influenzare la trasmissione dei patogeni.