Name: La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri come ricostituire oscillazioni mitotiche auto-sostenute in microemulsioni di estratti di uovo di Xenopus laevis. Questo metodo fornisce un framework ad alto rendimento per l'analisi quantitativa della dinamica del ciclo cellulare.

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Ringraziamo Madeleine Lu per la costruzione del plasmide securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu per una discussione sulla generazione della gocciolina, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr per la fornitura di CHE GFP-NLS costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (inizio carriera Grant n. 1553031), il National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e un assegno di ricerca di Sloan.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. preparazione dei materiali per il rilevamento e la ricostituzione del ciclo cellulare
<ol><li>
Assemblea di Gibson clonazione per la costruzione del DNA del plasmide e la purificazione di mRNA di securin-mCherry
	<ol>
<li>Preparare tre frammenti di DNA, tra cui una spina dorsale di vettore di pMTB2, securin e mCherry tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) e gel purificazione21,22.</li>
		<li>Misurare le concentrazioni di frammenti usando un fluorospectrometer. Combine 100 ng di dorsali con inserti securin e mCherry a un 1:1:1 rapporto molecolare e aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume totale di reazione a 5 µ l.</li>
		<li>Preparare 6 mL di tampone di reazione isotermica Assemblea: 5x con 3 mL di 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 µ l di 1 M MgCl2, 600 µ l di 10 mM dNTP, 300 µ l di 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000 e 20 mg di NAD23.</li>
		<li>Aggiungere i frammenti combinati a un 15 µ l di 1 tampone di reazione isotermica Assemblea x aliquota. Incubare la reazione in un tubo di reazione di PCR a 50 ° C per 15 minuti.</li>
		<li>Rendere un'agarosi 0,8% gel e funzionare con una tensione di 10 V/cm per verificare l'efficienza di ricottura di questi frammenti.</li>
		<li>Purificare il plasmide costruito ed eluire utilizzando 15 µ l di acqua RNAsi-libera. Trasformare 1 µ l del DNA del plasmide purificato in 50 µ l di competenti DH5α Escherichia coli cellule24 per un utilizzo futuro.</li>
		<li>Estrarre e purificare il plasmide del DNA di securin-mCherry dai competenti DH5α Escherichia coli cellule.</li>
		<li>Trascrivere il DNA del plasmide linearizzato securin-mCherry in mRNA e purificare il mRNA. Utilizzare uno spettrofotometro per verificare che la concentrazione del mRNA è più di 100 ng / µ l e il rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm è circa 2.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di demembranated DNA dello sperma di Xenopus laevis Nota: Adattato da Murray 19911.<ol>
<li>Eutanasia maschio adulto Xenopus laevis25 e sezionare i testicoli da quattro rane maschio26,27.</li>
		<li>Posto testicoli da quattro rane nella stessa mL 100 di Petri. Sciacquare i testicoli tre volte in 50 mL di soluzione fredda di x MMR 1 (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM di MgCl2, 2mm CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).</li>
		<li>Rimuovere il sangue in eccesso e il grasso dai testicoli in una capsula Petri 100 mL e poi lavare due volte nel buffer di preparazione nucleare fredda (NPB) (250 mM saccarosio, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, triidrocloruro di spermidina 0,5 mM, 0,2 mM spermina tetrahydrochloride).</li>
		<li>Rimuovere il buffer di preparazione nucleare (NPB) e tagliare i testicoli in pezzi con lunghezze inferiori a 0,2 cm utilizzando delle forbici affilate per dissezione in un 100ml di Petri. Aggiungere 8 mL di NPB freddo ai testicoli per ulteriore ripartizione.</li>
		<li>Maglia di nylon di uso tessuti con un diametro dei pori di 70 µm per filtrare i testicoli e prelevare il campione di sperma in una provetta conica da 15 mL. Rotazione verso il basso gli spermatozoi raccolti a 1.730 x g a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Fornire le cellule dello sperma con 1 mL di NPB e 50 µ l di 10 mg/mL lisolecitina e incubare a temperatura ambiente per 5 min a demembranate spermatozoi.</li>
		<li>Lavare il DNA dello sperma demembranated con 10 mL di NPB freddo con soluzione al 3% BSA tre volte.</li>
		<li>Misurare la densità del DNA spermatico con un emocitometro.</li>
		<li>Congelare il DNA dello sperma in aliquote di 5 µ l in azoto liquido e conservato a-80 ° C. La concentrazione ottimale del DNA spermatico è circa 105 nuclei / µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione della proteina del segnale di localizzazione nucleare-GFP (GFP-NLS)
	<ol>
<li>Trasformare il plasmide di GST-tagged GFP-NLS BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule5.</li>
		<li>Incubare le cellule senza antibiotici a 37 ° C per 1 h e poi diffusa su un piatto di agarosio LB con ampicillina di 100 µ g/mL.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 14 a 18 ore a crescere le cellule in singole colonie. Pick e inoculare singole colonie in 4 mL di terreno LB con ampicillina di 100 µ g/mL. Agitare le cellule a 37 ° C per 12 ore.</li>
		<li>Preparare il supporto di YT autoclavato (16 g di Bacto-tryptone, 10 g di Estratto di Bacto-lievito, 5 g di NaCl) e riscaldare i media di YT a 37 ° C.</li>
		<li>Inoculare 1 mL delle cellule incubate overnight LB media in 250 mL di media di YT preriscaldato con ampicillina di 100 µ g/mL e agitare per 2 ore aumentare la densità delle cellule.</li>
		<li>Misurare la densità ottica (OD) di cella ogni 30 minuti, utilizzando uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 600 nm. Aggiungere 0,1 mM IPTG nelle cellule per indurre l'espressione della proteina GFP-NLS, una volta che raggiunge il valore di OD 0,1.</li>
		<li>Agitare le cellule a 18 ° C durante la notte per ridurre il tasso di crescita delle cellule e consentire la sintesi e la migliore espressione della proteina.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule a 34.524 x g a 4 ° C per 5 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 40 mL di PBS buffer (fornito con 800 µ l di lisozima di 50 mg/mL, 100 µ l di 0,2 M PMSF, 13,2 µ l di una miscela di 10 mg/mL di leupeptina e pepstatina chymostatin e 8 µ l di EDTA 0.5 M) e incubare a 4 ° C per 20 minuti.</li>
		<li>Rompere giù celle utilizzando un sonicatore ad una frequenza di 20 kHz per 4 x 30 s, con intervalli di 30 s tra ogni sonicazione, di rilasciare espressa della proteina GFP-NLS.</li>
		<li>Spin a 20.000 x g per 35 minuti per rimuovere le cellule rotte.</li>
		<li>Cromatografia di affinità consente di estrarre e purificare la proteina GFP-NLS.</li>
		<li>Lavare i residui di perlina di 1,5 mL tre volte con 15 mL di tampone PBS e incubare 250ml di lisato con perline per 4 ore a 4 ° C con inversione.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le perline a 2000 x g per 5 min e aggiungere 10 mL di soluzione di lavaggio (25 mM Tris base, pH 7.5, NaCl, 500 mM e 5 mM DTT) perle. Incubare perline in 700 µ l di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20mm ridotto glutatione e 5 mM DTT) con rotazione a 4 ° C. Raccogliere un'aliquota dell'eluizione con un volume di 50 µ l.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di proteina raccolta eseguendo un gel blu di Coomassie28.</li>
		<li>Eluire le proteine usando PD-10 colonne con 3 mL di buffer di memoria (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerolo, pH 7,7) attraverso lo scambio di buffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del ciclismo Xenopus estratti
Nota: La procedura generale di preparare gli estratti è illustrata in Figura 1A. Adattato da Murray 19911.
<ol><li>Iniettare la femmina matura tre Xenopus laevis con 66 UI cavalla incinta del siero di gonadotropina (PMSG) 10 giorni prima di deporre le uova.</li>
	<li>Iniettare queste rane Xenopus con 500 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) per indurre 18 ore prima della preparazione del ciclismo estratti la deposizione delle uova.</li>
	<li>Scartare le uova deposte durante la notte. Basato su esperimenti (dati non mostrati), gli estratti preparati con le uova appena spremute di generano attività di più lunga durata rispetto gli estratti preparati da uova deposte dalla stessa femmina rana. Spremere le uova di ogni rana femmina in mm 100 capsule di Petri contenente 10 mL di buffer di x MMR 0,2 ed esaminare sotto un microscopio stereo.</li>
	<li>Scartare i lotti di uova che hanno poco chiari confini fra l'animale e vegetale poli o avere macchie bianche irregolari in cima a pali di animale.</li>
	<li>Scegliere il lotto di uova da una rana femmina che presenta una popolazione omogenea di uova con poli vegetale e animale chiaramente differenziate e trasferire le uova in un becher da 600 mL.</li>
	<li>Versare il tampone x MMR 0,2 in eccesso e delicatamente aggiungere 250 mL di 2 g / 100 mL cisteina (pH 7,7) in 1 x estrarre buffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1mm MgCl2, 10 mM HEPES, saccarosio 50 mM, pH 7,7) alle uova.</li>
	<li>Agitare vigorosamente le uova e rimuovere gli strati di gelatina di uova oltre tre lavaggi con un volume totale di 800 mL di cisteina nel buffer per 3 minuti o fino a quando le uova aggregazione e depositano sul fondo del becher, che indica che la gelatina cappotto rimozione è riuscito.</li>
	<li>Lavare le uova con 1 L di soluzione di x MMR 0,2 oltre quattro volte.</li>
	<li>Scegliere e scartare le uova che diventano bianche usando una pipetta di vetro.</li>
	<li>Versare il buffer di MMR e uova con 200 mL di 0,1 µ g/mL calcio ionoforo A23187 soluzione del 0,2 x MMR per l'attivazione di alimentazione.</li>
	<li>Utilizzare il lato di apertura di una pipetta di vetro per mescolare le uova delicatamente fino a quando le uova sono attivate e si rimuove la soluzione ionoforo del calcio.</li>
	<li>Verificare l'efficienza di attivazione dopo uova stabilirsi nella parte inferiore del bicchiere. Uova ben attivate hanno circa il 25% del polo animale e 75% del palo vegetal.</li>
	<li>Lavare le uova attivate due volte con 50 mL di tampone Estratto completati con inibitori della proteasi (10 µ g/mL ciascuno di leupeptina e pepstatina chymostatin) 1x.</li>
	<li>Trasferire con cautela le uova ad una microprovetta salvapercussore 0,4 mL e poi pack uova attraverso centrifugazione a 200 x g per 60 secondi e poi 600 x g per 30 secondi.</li>
	<li>Rimuovere il tampone extra sulla cima di uova usando un pipetta Pasteur di vetro per ridurre la diluizione degli estratti.</li>
	<li>Schiacciare le uova a 15.000 x g per 10 minuti a 4 ° C.</li>
	<li>Tagliare i tubi con una lama di rasoio per separare tre strati di uova tritate e tenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio.</li>
	<li>Trasferire il citoplasma grezzo in nuove provette di ultracentrifuga e completare con inibitori della proteasi e citocalasina B a 10 µ g/mL.</li>
	<li>Centrifugare il citoplasma greggio nuovamente a 15.000 x g a 4° C per 5 minuti per purificare ulteriormente il citoplasma rimuovendo il tuorlo d'uovo e dei lipidi in eccesso.</li>
	<li>Tenere gli estratti preparati sul ghiaccio.</li>
</ol>3. gocciolina generazione
<ol><li>
Preparazione di alloggiamento vetro 2D Nota: I tubi di vetro rettangolo servono come alloggiamenti che limitare le goccioline in un unico piano 2-dimensionale, consentendo una più facile osservazione e raccolta dei dati.<ol>
<li>Tagliare tubi di vetro di rettangolo con una dimensione interiore di 2 mm x 100 µm in mm 4 pezzi lunghi. Usa il bordo affilato di una pietra per affilare, segnano i confini desiderati sulla superficie esterna del tubo di vetro con incisioni di luce, quindi applicare una leggera pressione su entrambi i lati delle incisioni di rompere i pezzi di tubi di vetro.</li>
		<li>Pre-riscaldare un'incubatrice di bagno secco a 95 ° C. Estrarre il blocco riscaldante e posizionarlo in un essiccatore sotto vuoto in policarbonato.</li>
		<li>Posizionare una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 30 µ l di silano di tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani) nel blocco riscaldante. Posare i tubi di vetro tagliato all'interno di un essiccatore sotto vuoto a circa 5 cm al blocco riscaldante.</li>
		<li>Collegare un essiccatore a una pompa a vuoto. Accendere la pompa per un minuto raggiungere il livello di vuoto desiderato, quindi chiudere la valvola a 3 vie per sigillare un essiccatore e lasciare che il vapore di silano tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani) ricoprire la parete interna dei tubi di vetro. Questo creerà un ambiente idrofobico per stabilizzare le goccioline.</li>
		<li>Lasciare le provette di vetro all'interno di un essiccatore per rivestimento durante la notte. I tubi saranno pronti per l'uso il giorno successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging e generazione di goccia Nota: Le procedure di generazione di goccioline e di imaging sono illustrate nelle figure 1B e 1C.<ol>
<li>Fornire gli estratti preparati nel passaggio 2 con 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA per gli esperimenti di ciclo cellulare semplice solo citoplasmatici. In alternativa, fornitura estratti con cromatina di demembranated sperma (250 a µ l di estratto), proteina di GFP-NLS 10 µM e 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA per creare goccioline espositrici morfologia periodica nuclei cambia.</li>
		<li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, mix 20 µ l di Estratto fornito con proteina ricombinante o mRNA con 200 µ l di 2% perfluoropolieteri-polietilenglicole (PFPE-PEG) fluorotensioattivo in HFE7500 fluorurato ad olio.</li>
		<li>Generare goccioline utilizzando un miscelatore vortex. La gamma di formati di goccia può essere modulata dalla durata e dalla velocità di vortice. Per creare le goccioline con raggi che vanno da 50 a 200 µm, impostare la velocità di vortice a 56 x g (3.200 giri/min con un raggio di 4,9 mm) e premere delicatamente il tubo del microcentrifuge contenenti l'estratto e la miscela di tensioattivi sul mixer per 3,5 secondi. Controllare visivamente se le gocce sono di dimensioni uniformi.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta 20 µ l per trasferire le goccioline galleggiano sulla parte superiore e un volume uguale di tensioattivo PFPE-PEG in una provetta PCR. Immergere il tubo di vetro preparato dal passaggio nello strato gocciolina in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e aspettare fino a quando le goccioline hanno riempito circa il 75% del tubo, quindi spingono il tubo verso il basso nello strato tensioattivo fino a quando il tubo è riempito completamente. Consente di abbassare la densità delle gocce e consentire le goccioline a formare uno strato singolo all'interno della camera senza sovrapposizioni o forma distorsione causata dal sovraffollamento.</li>
		<li>Riempire un piatto fondo di vetro con un diametro di 40 mm con olio minerale. Immergere le provette piene di goccia in olio spingendo delicatamente verso il basso utilizzando una pinzetta bene.</li>
		<li>Dopo il caricamento tutti i campioni, uso un bicchiere pipettare per rimuovere eventuali detriti visibili o trapelate di goccioline. Se i tubi non sono o non saranno completamente immersi nel processo di imaging, aggiungere altro olio minerale.</li>
		<li>Condurre la formazione immagine di goccioline su un microscopio a epifluorescenza dotato di un palco di x-y motorizzati (Vedi Tabella materiali). Utilizzare un obiettivo 4x aria per tutte le immagini. Per l'imaging di fluorescenza, utilizzare un 130 W mercurio vapor breve lampada ad arco come sorgente di luce di fluorescenza per illuminazione e di un filtro GFP impostata (eccitazione 482/35 nm ed emissione 514/LP nm) e un filtro di mCherry impostata (eccitazione 562/40 nm ed emissione 641/75 nm) per l'imaging GFP-NLS e securin-mCherry segnali.</li>
		<li>Registrare video time-lapse nel campo luminoso e più canali di fluorescenza ogni 6-9 minuti fino a quando le goccioline perdono la loro attività.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elaborazione e analisi dei dati di immagine
<ol><li>
Segmentazione e tracking delle goccioline
	<ol>
<li>Importare i dati registrati nel formato "TIF" o ".oif" nel software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Segmento singole goccioline utilizzando il canale di campo luminoso. L'immagine di campo luminoso vi mostrerà le goccioline come cerchi luminosi con contorni scuri. Applicare la soglia per l'immagine. Aggiungere una superficie di rilevamento ogni gocciolina sintonizzando la soglia tra i pixel scuri e luminosi, affinché ogni superficie copre l'intera area della goccia corrispondente.</li>
		<li>Automaticamente traccia i segmenti tra fotogrammi adiacenti utilizzando l'algoritmo autoregressivo del movimento. Ottimizzare la distanza di viaggio massima accettabile di una goccia tra due fotogrammi adiacenti per essere più piccolo del raggio della maggior parte delle goccioline per monitorare con precisione piccole goccioline.</li>
		<li>Controllare visivamente che tutti i brani attraverso l'intero video per rilevare segmentazioni errati quel segmento di spazio vuoto tra gocce invece di goccioline effettive. Eliminare manualmente le tracce non corrette.</li>
		<li>Segmento e traccia area di sfondo senza eventuali gocce per ottenere l'intensità di fluorescenza di fondo. Per migliorare il segnale al rumore, sottrarre intensità di sfondo dall'intensità della fluorescenza delle goccioline a ogni intervallo di tempo.</li>
		<li>Esportare parametri misurati per ciascuna traccia nel tempo, compresi i media e la deviazione standard dell'intensità di fluorescenza e la zona di goccia in file ". csv".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati del periodo di dimensione e oscillazione della gocciolina
	<ol>
<li>Caricare i file ". csv" nella R per creare trame di intensità di fluorescenza nel tempo per ogni goccia. Gocciolina record ID in un file ". csv".</li>
		<li>Importare i file ". csv" esportati dal software di analisi e il file ". csv" con un elenco di ID di gocciolina di Matlab e salvare come file "Mat" per ulteriore analisi di dati.</li>
		<li>Calcolare il volume di una goccia compresso in base alle informazioni di zona gocciolina esportato dopo la segmentazione e l'altezza del vetro camera19. Utilizzare il volume per calcolare il raggio della gocciolina come una sfera.</li>
		<li>Estrarre i punti di tempo di picchi e le depressioni utilizzando l'algoritmo di rilevamento di picco/valle. Eseguire correzioni manuali sulla posizione di picchi e le depressioni per garantire che vengono rilevati con precisione.</li>
		<li>Per calcolare il periodo di ciclo cellulare, calcolare l'intervallo di tempo tra due picchi adiacenti. Prendere la media di tutti gli intervalli per ogni goccia come il periodo del ciclo cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla di divulgare.

Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola cellula. Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Uova di Xenopus in primo luogo, appena spremute con una buona qualità, rispetto alle uova deposte, tendono a produrre estratti con attività di più lunga durata di oscillazione. In s...

Estratti citoplasmatici preparati con uova di Xenopus laevis di rappresentano uno dei modelli più predominanti per lo studio biochimico dei cicli cellulari, dato il grande volume di ovociti, la progressione del ciclo cellulare rapida e la capacità di ricostituzione eventi mitotic in vitro1,2. Questo sistema ha permesso la scoperta iniziale e caratterizzazione meccanicistico di regolatori del ciclo cellulare essenziale come fattore di promozione di maturazione (MPF) così come i processi mitotici a valle tra cui spindle assembly e cromosoma segregazione1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Gli estratti di uovo di Xenopus sono stati utilizzati anche per la dissezione dettagliata delle reti regolatori del ciclo cellulare orologio8,12,13,14 e per gli studi del danno del DNA /Replication checkpoint15 e il fuso mitotico Assemblea checkpoint16,17,18.
Questi studi dei cicli cellulari usando gli estratti di uovo di Xenopus sono principalmente basati su misurazioni di massa. Tuttavia, analisi di reazione di massa convenzionale non possono imitare i comportamenti reali delle cellule, dati una discrepanza di maggiore dimensioni e subcellulare compartimentalizzazione spaziale delle molecole di reazione. Inoltre, misurazioni di massa di attività mitotica sono inclini a dare un numero limitato di cicli prima di smorzamento rapidamente8. Questi svantaggi delle reazioni di massa hanno impedito il sistema estratto per fornire ulteriore comprensione delle proprietà dinamiche complesse orologio e funzioni. Studi recenti hanno incapsulato senza cellula citostatico fattore-arrestato (CSF) Xenopus estrae19,20 in dimensione definita cellula-come compartimenti, che hanno contribuito a delucidare come dimensione del mandrino è modulata dalla volume citoplasmatico. Tuttavia, questo sistema in vitro è arrestato alla metafase della meiosi II dall'azione del fattore citostatico1, ed è necessario un sistema capace di oscillazioni sostenute a lungo termine a livello di singola cellula per ulteriori indagini del ciclo cellulare oscillatore.
Per studiare le oscillazioni del ciclo cellulare con cella singola risoluzione, abbiamo sviluppato una cella-scala, sistema ad alta produttività per la ricostituzione e la misura simultanea di più processi oscillatori mitotici autogestiti in microemulsione individuo goccioline. In questo protocollo dettagliato dei video, dimostriamo la creazione del sistema artificiale oscillazione mitotica incapsulando ciclismo citoplasma di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di dimensioni che vanno da 10 a 300 µm. In questo sistema, sono stati mitotiche oscillazioni tra cui condensazione cromosomica e de-condensazione, ripartizione busta nucleare e riforma e la degradazione e sintesi dei substrati anafase (ad es., securin-mCherry in questo protocollo) ricostituito con successo.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis rane</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 cellula competente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>Ionoforo di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Tricloro tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>tossico</td></tr> <tr><td>(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG tensioattivo</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare Glutatione Sepharose 4B perline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonna PD-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in vetro cavo miniaturizzato VitroCom</td><td></td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61 Microscopio stereo</td><td>Microscopio Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83</td> Microscopio confocale <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200</td><td>Spettrofotometro Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mL Microprovette con tappo a scatto</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit PureLink RNA</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore a vortice analogico</td><td>Fisher</td><td>Scientific 2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Versione 7.3</td> Software <td>di analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

la ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula xenopus estrae

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Misura in tempo reale delle oscillazioni a livello di singola cellula è importante scoprire i meccanismi di orologi biologici. Anche se alla rinfusa gli estratti preparati con uova di Xenopus laevis di sono stati potenti in reti biochimiche che sono alla base della progressione del ciclo cellulare di dissezione, loro misura media ensemble in genere porta ad un'oscillazione smorzata, nonostante ciascuno oscillatore individuale essendo sostenuta. Ciò è dovuto la difficoltà di sincronizzazione perfetta tra singoli oscillatori in sistemi biologici rumorosi. Per recuperare la cella singola dinamica dell'oscillatore, abbiamo sviluppato un sistema di cellula artificiale basata su goccia che può ricostituire mitotic cicli nei compartimenti di cellula-come incapsulare ciclismo estratti citoplasmatici di uova di Xenopus laevis . Queste semplici cellule solo citoplasmatici presentano oscillazioni sostenute per oltre 30 cicli. Per costruire più complicate cellule con i nuclei, abbiamo aggiunto della cromatina di sperma demembranated per attivare l'auto-assemblaggio nuclei nel sistema. Abbiamo osservato una progressione periodica del cromosoma condensazione/decondensazione e nuclei avvolgono ripartizione/riforma, come nelle celle reali. Questo indica che l'oscillatore mitotica funzioni fedelmente per guidare più a valle eventi mitotic. Contemporaneamente abbiamo rintracciato la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale e oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l'analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l'orologio.

In Figura 2, indichiamo che questo protocollo produce oscillazioni mitotiche in cellule semplici, senza nucleare così come complicate cellule con i nuclei, dove l'oscillatore spinge l'alternanza ciclica di formazione di nuclei e deformazione. Le goccioline privo di nuclei generano oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli undamped nell'arco di tempo di 92 ore, come indicato dal periodico sintesi e degradazione di una fluorescenza reporter securin-mCherry (<stron...

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi, come il meccanismo di regolazione dietro la rete mitotica e le proprietà e le funzioni dinamiche dell'orologio del ciclo cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genererà una grande quantità di goccioline con più cicli cellulari in ciascuno, fornendoci un framework ad alta produttività per la manipolazione e l'analisi quantitativa. Per iniziare, scartare lotti di uova che hanno confini poco chiari tra pali animali e vegetali o macchie bianche irregolari sopra i pali degli animali.Quindi, selezionare un lotto appropriato di uova da una rana femmina e trasferire le uova in un becher da 600 millilitri. Versare un eccesso di tampone MMR 0,2x e aggiungere delicatamente la cisteina in 1x tampone di estrazione alle uova. Dopo questo, agitare vigorosamente il becher a mano per rimuovere le meduse delle uova.Ripetere questo lavaggio tre volte con un totale di 800 millilitri di tampone di cisteina o fino a quando le uova si aggregano e si depositano sul fondo del becher. Dopo aver rimosso la medusa, lavare le uova quattro volte in un litro di soluzione MMR 0,2x. Usa una pipetta di vetro per raccogliere e scartare le uova che diventano bianche.Versare il tampone MMR dal becher e aggiungere 200 millilitri di soluzione di ionoforo di calcio nelle uova. Utilizzare una pipetta di vetro per mescolare delicatamente le uova fino a quando non vengono attivate e rimuovere la soluzione di ionoforo di calcio. Lasciare le uova in soluzione di ionoforo di calcio per troppo tempo inizierà l'apoptosi.Mescoliamo le uova per 1,5 minuti e controlliamo l'efficienza di attivazione. Se non vengono attivati, riprendere l'agitazione e controllare più frequentemente fino al 90% di attivazione. Dopo che le uova si depositano sul fondo del becher, controllare l'efficienza di attivazione.Le uova ben attivate hanno circa il 25% del polo animale e il 75% del polo vegetale. Successivamente, lavare le uova due volte con un volume totale di 50 millilitri di tampone di estrazione integrato con inibitori della proteasi. Quindi, trasferire attentamente le uova su un microtubo snap-cap da 0,4 millilitri.Centrifugare il microtubo per 60 secondi a 200 g e poi a 600 g per 30 secondi per imballare le uova. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere il buffer in eccesso sopra le uova dopo ogni passaggio. Dopo questo, schiacciare le uova a 15.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Utilizzare una lama di rasoio per tagliare i tubi per separare i tre strati di uova schiacciate e mantenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio. Quindi, trasferire il citoplasma grezzo per pulire i tubi ultracentrifugo. Integrare il citoplasma con inibitori della proteasi e citocalcasina B a 10 microgrammi per millilitro ciascuno.Centrifugare il citoplasma grezzo a 15.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo e mantenere il citoplasma nello strato intermedio. Mettere gli estratti appena preparati sul ghiaccio.In primo luogo, aggiungere l'mRNA di cartolarizzazione-mCherry agli estratti preparati. Aggiungere quindi 200 microlitri di fluorosurfactant PFPE-PEG al fluorosurfactant estratto. Utilizzate un mixer vortice per generare goccioline, regolando la velocità e la durata del vortice in base alle esigenze.Quindi, ispezionare visivamente le goccioline per assicurarsi che siano di dimensioni uniformi. Utilizzando una pipetta da 200 microliter, trasferire le goccioline che galleggiano sulla parte superiore e un volume uguale di tensioattivi su un tubo PCR. Immergere un tubo di vetro nello strato di goccioline e attendere che le goccioline riempiano circa il 75% del tubo.Quindi, spingere il tubo nello strato tensioattivi e riempire completamente il tubo. Quindi, riempire un piatto con fondo di vetro con olio minerale. Quindi, utilizzare una pinzetta fine per immergere il tubo pieno di goccioline nell'olio.Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere eventuali detriti visibili o goccioline trapelate. Per evitare movimenti e perdite di goccioline, il tubo di vetro pieno di goccioline deve essere immerso con cura sotto l'olio minerale. Possiamo spingere il tubo su entrambe le estremità con equilibrio o aggiungere alcune gocce di olio minerale sulle estremità del tubo contemporaneamente prima.Successivamente, utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di uno stadio xy motorizzato per immagini le goccioline. Registra video time-lapse nel campo luminoso e più canali di fluorescenza ogni sei-nove minuti fino a quando le goccioline perdono la loro attività. Utilizzando questo protocollo, sono state prodotte oscillazioni mitotiche sia in celle semplici e senza nucleare che in celle complicate con nuclei.Le goccioline senza nuclei hanno generato oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli non smorzati nell'over 92 ore. È stata anche esaminata la capacità dell'oscillatore mitotico di guidare eventi mitotici a valle. L'oscillatore mitotico auto-sostenuto ha guidato i cambiamenti della morfologia nucleare osservati attraverso l'alterazione autonoma di distinte fasi del ciclo cellulare.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare a mente il momento in cui si fa l'estratto, in quanto è sensibile al tempo, e tenere sempre le uova ed estrarre sul ghiaccio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei sistemi per esplorare i principi fondamentali delle proprietà complesse dell'orologio, come la tonnibilità e la stochasticity in Xenopus laevis.

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Greggio e frazionato estratti di uova di Xenopus può essere utilizzato per fornire ingredienti per la ricostituzione di processi cellulari per l'analisi morfologiche e biochimiche. Lisi uovo e centrifugazione differenziale vengono utilizzati per preparare l'estratto grezzo che a sua volta in utilizzato per preparare estratti frazionato e preparati membrana luce.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine ​​usando radioattivo e proteine ​​luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Descriviamo i metodi di manipolazione degli ovociti immaturi di Xenopus laevis, la maturazione in vitro degli ovociti in ovuli e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Questo protocollo consente la degradazione di alcune proteine materne e la sovraespressione di geni di interesse alla fecondazione, e quindi è prezioso per studiare il ruolo di fattori specifici nello sviluppo embrionale precoce.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

I meccanismi di ridimensionamento cellulare e intracellulare rimangono sfuggenti. L'uso di estratti di embrioni di Xenopus è diventato sempre più comune per chiarire i meccanismi di regolazione delle dimensioni degli organelli. Questo metodo descrive la preparazione dell'estratto embrionale e un nuovo saggio di scala nucleare attraverso il quale è possibile identificare i meccanismi di regolazione delle dimensioni nucleari.

Un test cellulare gratuitamente utilizzando<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; Embryo Estrae per studiare i meccanismi del regolamento Size nucleare

L'assemblaggio e il posizionamento del fuso mitotico dipendono dalle forze combinate generate dalla dinamica dei microtubuli, dalle proteine motorie e dai reticolanti. Qui presentiamo i nostri metodi recentemente sviluppati in cui il confinamento geometrico di goccioline di emulsione sferica viene utilizzato per la ricostituzione dal basso verso l'alto di fusi mitotici basici.

Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Viene fornito un protocollo per la coltura e la manipolazione del tessuto embrionale di topo su un chip microfluidico. Applicando impulsi di modulatori di percorso, questo sistema può essere utilizzato per controllare esternamente le oscillazioni di segnalazione per lo studio funzionale della somitogenesi del topo.

Un approccio microfluidico per l'indagine funzionale delle oscillazioni di segnalazione che governano la somitogenesi

Scopri come ricostituire oscillazioni mitotiche auto-sostenute in microemulsioni di estratti di uovo di Xenopus laevis. Questo metodo fornisce un framework ad alto rendimento per l'analisi quantitativa della dinamica del ciclo cellulare.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

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