Name: Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per lidentificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Scopri come identificare fattori virali immunomodulatori e meccanismi antivirali dell'ospite nelle infezioni da arbovirus utilizzando saggi di luminescenza e fluorescenza in cellule di insetto lepidottero.

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D.G. è stato sostenuto da finanziamenti da dotato Scholars Program dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Gli autori ringraziano Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) e Sean Whelan (Harvard Medical School) per la fornitura di VSV-DsRed e VSV-LUC. Gli autori ringraziano anche Gary Luker (University of Michigan Medical School) per il gentile dono del ceppo VACV-FL-GFP.

1. generale Lymantria dispar (LD652) cella e cultura del Virus
<ol><li>
Cella LD652 coltura e placcatura
	<ol>
<li>Alla cultura dispar L.-derivata LD652 cellule, mantenere un monostrato di cellule in un mezzo di crescita (Tabella materiali) incubate a 27 ° C in atmosfera normale. Mantenere le cellule in piatti di tessuto-cultura-trattati di 10cm e passaggio le cellule giunti confluency di 80%.</li>
		<li>Piastra, sloggiare le cellule aderenti LD652 dalla piastra pipettando i media ripetutamente sul monostrato (queste cellule non hanno bisogno di trypsinization per sloggiare) e diluire il campione in coltura ad una densità approssimativa di 1 x 105 cellule/mL. Pipettare 1 mL di diluito cultura/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Un minimo di tre pozzi replica/trattamento di tipo per ogni punto di tempo (un massimo di otto trattamenti/piastra) del seme.</li>
		<li>Permettono alle cellule di stabilirsi per un minimo di 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di vaccinia virus
	<ol>
<li>Per preparare le scorte di VACV, amplificare il virus in HeLa cells20 o cellule di rene di scimmia verde africana (cellule BSC-1 o BSC-40)20,21,22. Nota: Ceppo VACV Western Reserve (VACV-WR) funziona bene nelle analisi descritte qui.</li>
		<li>Titolare il saggio del ceppo via della placca VACV su BSC-1 o BSC-40 cellule20,22. Nota: Tutti indicati molteplicità VACV di infezione (MOI) descritto qui per LD652 infezioni di cella si basano su titoli ottenuti da saggi di placca BSC-40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del virus di stomatite vescicolare
	<ol>
<li>Per preparare scorte VSV, amplificare il virus, cellule BHK23.</li>
		<li>Titolare VSV di saggio della placca il BSC-40 o BHK cella monostrati13,23. Nota: Tutti i VSV MOIs descritto qui per LD652 infezioni di cella si basano su titoli ottenuti da saggi di placca BSC-40.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. base di fluorescenza VSV Rescue analisi usando co-infezione e Live cell Imaging
<ol><li>
Semina e l'infezione delle cellule LD652
	<ol>
<li>LD652 40.000 cellule/pozzetto di una camera di 8 pozzetti della piastra.</li>
		<li>Per acquisizione di immagini di cellule vive basata sulla fluorescenza, utilizzare ceppi VSV codifica proteine fluorescenti. Gli esperimenti presentati qui utilizzano VSV-DsRed17, un ceppo batterico di VSV che esprime la proteina DsRed libera che non è fuso a qualsiasi altra proteina VSV. Nota: VSV infezione delle cellule di LD652 non è citopatico da hpi 96 e, quindi, la morte delle cellule non è un fattore di confusione quando si valutano replica VSV entro questo lasso di tempo.</li>
		<li>Preparare VSV-DsRed e VACV-FL-GFP in un supporto privo di siero (SFM; Tabella materiali) presso un MOI 1 e 25, rispettivamente. Nota: VACV-FL-GFP è un ceppo batterico di VACV che esprime una fusione tra LUC e GFP24. Utilizzando un MOI di 25 o superiore per i ceppi VACV assicura che tutte le cellule LD652 sono infetti13. Se si utilizza un virus coinfecting diverso, il MOI dovrà essere determinata empiricamente dall'utente. Ogni trattamento di infezione devono essere configurate in pozzetti duplicati e includono trattamenti mock-infettati in cui solo SFM è aggiunto alle cellule.</li>
		<li>Incubare le cellule in 0,2 mL di inoculo per 2 ore a 27 ° C.</li>
		<li>Lavare le cellule con 0,5 mL/bene di crescita media.</li>
		<li>Incubare le cellule a 25 μM della tintura di attuabilità delle cellule (Tabella materiali) nei mezzi di crescita per 45 min a 27 ° C.</li>
		<li>I media di aspirare e lavare i pozzetti 1 x con 0,5 mL/bene a rimuovere il colorante in eccesso.</li>
		<li>Mantenere le cellule in 0,3 mL/bene dei media crescita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vivere la cattura delle immagini di cella
	<ol>
<li>Girare su un microscopio confocale 30 min di anticipo e un piatto di 8 pozzetti camera di carico. Nota: Le cellule LD652 possono essere imaged a temperature ambiente che vanno da 20 – 25 ° C, ma per condizioni ottimali, la temperatura della stanza deve essere regolata a 27 ° C.</li>
		<li>Configurare le impostazioni di eccitazione/emissione appropriato per ogni proteina marcatore fluorescente essere imaged, nonché le impostazioni di immagine contrasto di fase.</li>
		<li>Regolare l'intensità del laser per ogni canale. Nota: Ciò può richiedere l'esecuzione di un esperimento pilota per determinare la gamma di intensità di segnale fluorescente osservati durante il corso di tempo per essere utilizzato nell'esperimento finale.</li>
		<li>Utilizzando l'obiettivo 10x, catturare le immagini di fluorescenza e contrasto di fase di ogni bene ogni 1 – 5 ore per la durata dell'infezione fino a un punto di tempo desiderato (ad es., 48 – 72 hpi). Nota: È importante acquisire molteplici campi di vista in ogni pozzetto per stimare con precisione i tassi di infezione in tutta la cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dell'immagine
	<ol>
<li>Utilizzare software di analisi di immagine per l'analisi di immagine automatizzato dei canali fluorescente appropriati (ad es., 405 nm, 488 nm, 568 nm).</li>
		<li>Per calcolare la percentuale di cellule che sono infettati, dividere il numero totale di cellule fluorescenti che indica infezione VSV (ad es., cellule DsRed-positive per infezioni VSV-DsRed) per il numero totale di cellule vitali con l'etichetta di tintura di attuabilità delle cellule per ogni campo visivo attraverso tutti i trattamenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. generale infezione virale protocollo per basata su luminescenza VSV Rescue saggi in cellule di LD652
<ol><li>
Preparazione dell'inoculo
	<ol>
<li>30 min prima dell'infezione, scongelare le scorte di VSV-LUC16 (un recombinant VSV ceppo che esprime libero firefly luciferase proteina fusa non a qualsiasi altra proteina VSV). Se analizzando per salvataggio VSV-LUC durante il coinfection VACV, anche scongelare il virus VACV-WR sul ghiaccio. Nota: Altri virus (oltre VACV-WR) può salvare VSV-LUC durante la coinfezione, ma questo dovrà essere determinata empiricamente da ciascun utente.</li>
		<li>Preparare l'inoculo diluendo VSV-LUC in presenza o assenza di VACV-WR in SFM, tale che un MOI di 10 e 25, rispettivamente, si ottiene quando si aggiunge un volume totale di inoculo di 0,2 mL/bene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infezione delle cellule
	<ol>
<li>Maturo LD652 supporti con cautela per evitare di disturbare il monostrato di aspirare e inoculare con 0,2 mL di virus per pozzetto. Questo tempo è definito come 0 hpi. Aggiungere sterile SFM ulteriori pozzi per servire come "mock-infetto" trattamenti di controllo negativo.</li>
		<li>Incubare le cellule nell'inoculo per 2 ore a 27 ° C.</li>
		<li>Alle 2 hpi, rimuovere inoculo dall'aspirazione e sostituire con 1 mL/bene LD652 crescita media.</li>
		<li>Permettere che l'infezione di procedere hpi 24 – 72.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. luciferase Assay
<ol><li>
Preparazione dei lisati cellulari
	<ol>
<li>Attentamente, aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) / bene.</li>
		<li>Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 mL, raschiare le cellule in DPBS.</li>
		<li>Trasferire le cellule in un tubo del microcentrifuge e centrifuga a 400 x g per 20 min a 4 ° C.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare 1 x diluizione di 5 x buffer di lisi di reporter (RLB) in sterile H2O.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il DPBS senza disturbare il pellet cellulare.</li>
		<li>Ogni risospendere in 150 µ l di 1 x RLB.</li>
		<li>Congelamento-scongelamento dei campioni 1 x utilizzando un'incubazione di 5 min in un congelatore-80 ° C seguito da un rapido disgelo in un bagno di acqua temperatura ambiente. Memorizzare i lisati a-80 ° C fino al momento di analizzare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di luciferase
	<ol>
<li>Scongelare i lisati sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 20 μL di lisato in un pozzo di una micropiastra a 96 pozzetti solido bianco o nero.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di reagente di saggio di luciferasi in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Immediatamente misurare l'intensità della luce utilizzando un luminometro (impostazioni appropriate per Luminometri specifico dovrà essere determinata empiricamente dall'utente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi del saggio di luciferasi
	<ol>
<li>Normalizzare LU segnali per ogni trattamento per letture di LU ottenuti dai trattamenti di controllo (Rappresentante risultati). Dopo almeno tre esperimenti indipendenti sono stati eseguiti, la media che Lu ottenuti da ciascun gruppo di trattamento/controllo può essere analizzata mediante test statistici appropriati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunoblot
<ol><li>Utilizzare lisati estratte per i saggi LUC per SDS-PAGE e immunoblotting successivo, utilizzando Strumentazione e reagenti appropriati.</li>
</ol>6. titolo di VSV dalle colture delle cellule LD652
<ol><li>Piastra LD652 cellule secondo punto 1.1.</li>
	<li>Virale infettare le cellule secondo passaggio 3.</li>
	<li>Intervalli di tempo desiderato, è possibile raccogliere i surnatanti in microcentrifuga sterile.</li>
	<li>Appallottolare le celle utilizzando 1.000 x g per 10 min a 4 ° C e trasferire i surnatanti in nuove provette.</li>
	<li>Memorizzare i surnatanti a-80 ° C o procedere con titolazione di saggio della placca sulle cellule BSC-40. Nota: Se la titolazione VSV da colture di cellule LD652 che conteneva VACV, è consigliabile aggiungere 100 μg/mL citosina arabinoside (AraC) per i terreni di coltura di BSC-40 entro 2 hpi, per impedire la formazione di placche su BSC-40 strati monomolecolari13di particelle residue di VACV. AraC è un inibitore della polimerasi del DNA virale che blocca VACV DNA replica25 ma non influisce sulla replica di VSV.</li>
</ol>7. variazioni di VSV basata su luminescenza salvataggio saggi in cellule di LD652: RNAi e gli esperimenti di transfezione del plasmide
<ol><li>
Preparazione di dsRNA per atterramento di RNAi-mediata di virale o ospitare trascrizioni
	<ol>
<li>Gli iniettori di gene-specific design dalla coda all'estremità 5' con la sequenza del promotore T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) fare riferimento il virus coinfecting (ad es., VACV) o dispar L. trascrizioni del mRNA di interesse. Questi iniettori dovrebbero produrre un prodotto PCR di 400 – 600 bp per atterramento di RNAi-mediata efficace. Vedere Gammon et al. 13 per sequenze dell'iniettore usato sotto per atterramento VACV o dispar L. trascrizioni di dsRNA-mediata RNAi in cellule di LD652. Nota: Dispar L. mRNA trascritti possono essere identificati da pubblicato dispar L. transcriptome database26,27,28.</li>
		<li>Generare un DNA modello tramite RT-PCR (sintesi del cDNA: 1 ciclo di 50 ° C per 30 min; PCR: 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 50 ° C per 30 s e 68 ° C per 45 s ciascuno).</li>
		<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione di PCR.</li>
		<li>Utilizzando il prodotto PCR purificato come modello, in vitro trascrivere e purificare dsRNA utilizzando un kit di purificazione e di trascrizione in vitro .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfezione di dsRNA o plasmide DNA nelle cellule LD652
	<ol>
<li>Semi 1 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e lasciare che le celle di stabilirsi per almeno 1 h.</li>
		<li>Per ciascun pozzetto per transfettate, diluire 4 μL di reagente di transfezione in 100 μL di SFM. Incubare per fino a 15 min a temperatura ambiente. Questo può essere scalato per rendere un mix master per tutte le transfezioni deve essere eseguita.</li>
		<li>Diluire fino a 1 μg di dsRNA o DNA plasmidico totale con 100 μL di SFM per ciascun pozzetto per essere transfected. Incubare per fino a 15 min a temperatura ambiente. Nota: Precedentemente abbiamo trovato che una trasfezione di 1 μg di dsRNA/105 LD652 celle è sufficiente per > 80% atterramento di sia virale o ospitare trascrizioni13, ma dsRNA dosi necessarie per modificato sperimentale set-ups/condizioni dovrà essere determinata empiricamente.</li>
		<li>Combinare le diluizioni di transfezione reagente e dsRNA/plasmide DNA con un rapporto 1:1 (ad esempio, 100 μL di dsRNA diluito è mescolato con 100 μL di reagente di transfezione diluito) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Nel frattempo, lavare i pozzetti con 1 mL/bene di SFM e quindi aggiungere 500 μL di SFM in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere lentamente la transfezione reagente dsRNA (o DNA plasmidico) miscela goccia a goccia in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare il reagente di transfezione con le cellule per 5 h.<ol>
<li>Per RNAi esperimenti che coinvolgono l'atterramento delle trascrizioni codificate da un virus coinfecting (ad es., VACV), sostituire il reagente di transfezione dopo il periodo di incubazione di 5-h transfezione con inoculo di virus contenente VSV-LUC (con o senza VACV o un altro virus coinfecting) (passaggio 3). Successivamente, sostituire l'inoculo di virus contenente VSV-LUC con completa crescita media 2 hpi. Saggi di LUC (passaggio 4) quindi possono essere eseguite su lisati estratti a vari intervalli di tempo per determinare se l'atterramento di coinfecting trascrizioni del virus conduce ad una perdita di salvataggio VSV-LUC.</li>
			<li>Per esperimenti di RNAi che coinvolgono RNAi delle trascrizioni dispar L. , sostituire il mix di transfezione con media crescita completa e consentire atterramento di derivare per 24 h prima dell'infezione con VSV-LUC (passaggio 4). Saggi di LUC (passaggio 4) quindi possono essere eseguite su lisati estratti a vari intervalli di tempo per determinare se l'atterramento delle trascrizioni dispar L. promuove salvataggio VSV-LUC.</li>
			<li>Per gli esperimenti che coinvolgono transfezioni di vettori di espressione plasmidici esprimendo candidati immunomodulatori, sostituire il reagente di transfezione e consentire l'espressione della proteina per 24 h prima dell'infezione con VSV-LUC (passaggio 4). Saggi di LUC (passaggio 4) quindi possono essere eseguite su lisati estratti a vari intervalli di tempo per determinare se l'espressione delle proteine di immunomodulatori candidato promuove salvataggio VSV-LUC. Nota: Le condizioni di transfezione descritte qui con 1 μg/pozzetto di risultato DNA plasmidico in efficienza di trasfezione di 40 – 60%13.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo descritto analisi semplice di fluorescenza e luminescenza basata allo schermo per condizioni che replica VSV in colture cellulari di lepidotteri restrittive di soccorso. L'infezione abortita di VSV in cellule di lepidotteri crea un eccellente rapporto segnale-rumore quando analizzando per espressione genica VSV. Ad esempio, sono stati i segnali di LU rilevati nei lysates dalle singole infezioni VSV-LUC ~ 1.000 superiore a nei lysates mock-infettati, eppure questi segnali solo cambiato circa duplice sopra un c...

La capacità di un virus di replicare in modo produttivo in un particolare host è in parte regolata dalla disponibilità di fattori di cellula ospite che supportano entrata virale e replica1. La gamma di virus-ospite può essere dettata anche dalla capacità di un virus a contatore antivirale le difese cellulari che altrimenti impedirebbero la replicazione virale2,3. Esso è il risultato di queste interazioni virus-ospite complessi che in ultima analisi, decidere se un virus sarà in grado di completare il suo ciclo di vita in un particolare host. Dato le conseguenze potenzialmente patogene per l'host se ne deriva la replicazione virale, è fondamentale per sviluppare strategie sperimentali per avanzare la nostra comprensione delle interazioni virus-ospite chiave che l'ago della bilancia tra abortiti e produttivo infezioni. Chiarire le caratteristiche molecolari di interazione virus-ospite sarà determinante nello sviluppo di strategie terapeutiche antivirali nuove e alternative.
Con l'avvento di RNA interferenza (RNAi)4,5 e strumenti di modifica del genoma (ad es., CRISPR-Cas9, zinco dito nucleasi, TALENs)6,7, è diventato sperimentalmente fattibile per alterare la espressione di fattori cellulari sul genoma scale ed esplorare l'impatto di queste alterazioni sulla replicazione del virus. Infatti, sono stati condotti numerosi RNAi e genoma di editing basati su schermi in tipi di cellule ospite invertebrati e vertebrati che hanno svelato nuove sfaccettature del virus-ospite interazioni8,9,10, 11 , 12. queste schermate di solito impiegano virus codifica reporter, come la luciferasi di lucciola (LUC) o proteine fluorescenti (ad es., GFP, DsRed), che forniscono comodo mezzo per valutare quantitativamente l'espressione genica virale come una lettura per la replicazione virale9,12. Questa strategia permette ai ricercatori di identificare fattori ospite che sia promuovono o antagonizzano replicazione virale, come evidenziato da aumenti o diminuzioni, rispettivamente, virale Reporter segnala9,12. Tuttavia, nella stragrande maggioranza dei casi, questi schermi sono stati condotti usando i virus che si siano ben adattati al tipo di cellula ospite in cui stanno studiandi. Mentre questa strategia può essere importante per comprendere le relazioni coevolutionary tra agenti patogeni virali e loro ospiti naturali, pongono fondamentali preoccupazioni per quanto riguarda il loro uso in scoprendo fattori antivirali dell'ospite. In questi casi, un miglioramento in reporter di virus segnale di RNAi atterramento è ricercato, o l'inattivazione di un fattore cellulare che normalmente impedisce la replicazione virale. In primo luogo, se un virus è già in grado di replicare con fermezza nella cellula ospite all'esame in condizioni di controllo, la gamma dinamica dello schermo (cioè, la capacità di distinguere tra sfondo e segnali reporter virale avanzata) può essere limitata. In secondo luogo, questo problema è ulteriormente aggravato dalle situazioni in cui il virus è ben adattato alla cellula ospite ed efficace nel contrastare le vie di difesa ospite che sono presi di mira nella schermata.
A causa delle preoccupazioni di cui sopra per quanto riguarda l'interazione virus-ospite tradizionali metodi di screening, abbiamo sviluppato un nuovo paradigma per lo studio delle interazioni virus-ospite che sfruttano le infezioni da arbovirus naturalmente abortiti in cellule di insetto lepidottero. Questa strategia deriva da un'osservazione che l'arbovirus umano ben studiata, VSV, subisce un'infezione abortita in cellule derivate dal lepidottero zingaresco (L. dispar)13. VSV è naturalmente trasmessa da insetti Ditteri (cioè, flebotomi) agli host dei mammiferi e ha dimostrato sperimentalmente di infettare una vasta gamma di invertebrati e vertebrati host sia in cella cultura ed in vivo14. Il genoma di 11-kb-senso single-stranded RNA di VSV codifica cinque mRNAs subgenomic che ciascuno si traducono in proteine che compongono il virione avvolta. Tuttavia, sistemi di genetica inverso VSV hanno permesso la creazione di ceppi replica-competente codifica LUC o proteine fluorescenti, oltre le cinque naturale VSV gene prodotti15,16,17. Poiché queste proteine reporter non sono incorporate nel virione VSV, forniscono una lettura comoda per l'espressione genica VSV che si verifica post-voce. Utilizzo di ceppi VSV codifica GFP o LUC, precedentemente abbiamo indicato che l'espressione genica VSV è severamente limitato al momento dell'entrata delle cellule LD652 e che i titoli VSV non aumentano da post-infezione 72 ore (hpi). Al contrario, la coinfezione di cellule LD652 con VSV e mammiferi di poxvirus, virus vaccinico (VACV), conduce ad un aumento logaritmico sia espressione genica VSV ed i titoli da questo punto di tempo. VACV subisce precoce espressione genica, la replicazione del DNA e tardi espressione genica nelle infezioni delle cellule LD652, ma il ciclo di replica VACV è in definitiva abortito a causa di incompleta virione morfogenesi18. Il grande genoma DNA ~ 192 kb di VACV codifica proteine > 200, molti dei quali visualizzare proprietà immunomodulatorie che promuovono la replicazione virale attraverso la soppressione di host le risposte immunitarie19. Di conseguenza, abbiamo supposto che il "salvataggio" di replica VSV in cellule LD652 da coinfezione VACV probabilmente è stato mediato da immunomodulatori VACV che ha inibito dispar L. risposte normalmente limitando replica VSV. A sostegno di ciò, il trattamento delle cellule di LD652 con l'inibitore di host RNA polimerasi II actinomicina D salva anche replica VSV in cellule di LD652, che indica che la risposta dell'ospite di trascrizione-dipendente blocco VSV replica post-voce13.
Queste osservazioni indicano che la natura naturalmente restrittiva delle cellule di LD652 all'infezione di VSV può fornire uno sfondo relativamente basso quando lo screening per le condizioni che migliorare i segnali reporter VSV-codificati (cioè, quelli che inibiscono host difese antivirali). Qui, mettiamo a disposizione i metodi per l'utilizzo di fluorescenza o saggi basati su LUC alla schermata per condizioni che alleviano la restrizione di VSV in cellule di lepidotteri. In primo luogo, vi mostriamo come queste analisi possono essere utilizzate per identificare i fattori immunomodulatori viralmente codificato che rompono restrizione VSV durante entrambi gli esperimenti di coinfezione o attraverso l'espressione ectopica di fattori virali candidato. Ad esempio, vi illustriamo come abbiamo usato queste tecniche di screening per identificare proteine codificate poxvirus di A51R come una nuova famiglia di fattori immunomodulatori che replica VSV in assenza di altri fattori di poxvirus13di soccorso. In secondo luogo, vi illustriamo come RNAi di screening nelle infezioni di cella restrittive VSV-LD652 può essere utilizzato per identificare direttamente coinvolti da arbovirus restrizione13fattori dell'ospite eucariotica.

<table><tbody><tr><td>piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>CELLTREAT</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale da 10 cm</td><td>Corning</td><td>C430167</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>G8142</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 420</td><td>Sigma</td><td>14420C</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td><td>di crescita 1:1 miscela di Grace's Insect Medium e EX-Cell 420 Terreno privo di siero contenente anche l'1% di soluzione antibiotica-antimicotica e il 10% di siero fetale bovino</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica (100&volte;)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td>Terreni privi di siero <td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>(SFM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td></td></tr><tr><td>Citosina arabinoside</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>Cella di Corninggro DMSO (Dimetilsolfossido)</td><td>Corning</td><td>25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi reporter 5x</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per il dosaggio della luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1483</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG di topo</td><td>Wako</td><td>014-22383</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo luciferasi anti-lucciola di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab21176</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-actina di topo</td><td>Sigma</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-VSV M</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. John Connor (Boston University)</td></tr><tr><td>Topo anti-VACV I3L</td><td>N/A</td><td>N/A Dr</td><td>. David Evans (Università di Alberta)</td></tr><tr><td>Piatto camerato a 8 pozzetti</td><td>Lab-Tek II</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Colorante per vitalità cellulare</td><td>Thermo Fisher</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar lettore di micropiastre</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Olympus</td><td>v1.18</td><td>cellSens software</td></tr><tr><td>Eppendorf 5702 centrifuga ventilata</td><td>Eppendorf</td><td>22628102</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Infrared Imaging System</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Odyssey Fc</td><td></td></tr><tr><td>LD652 cells</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)</td></tr><tr><td>Celle BSC-40 Celle</td><td>ATCC</td><td>CRL-2761</td><td></td></tr><tr><td>Celle BHK</td><td>Celle ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>Celle HeLa</td><td>Celle ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Celle BSC-1 Celle</td><td>ATCC</td><td>CCL-26</td><td></td></tr><tr><td>in vitro Kit di purificazione e purificazione</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Qiagen</td><td>Codice 28104</td><td></td></tr></tbody></table>

infezioni da arbovirus come strumenti di screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e host antivirale

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Interferenza di RNA - e genoma editing basato su piattaforme di screening sono stati ampiamente usati per identificare fattori di cellula ospite che limitano la replicazione del virus. Tuttavia, questi schermi sono in genere condotti in cellule che sono naturalmente permissive al patogeno virale in fase di studio. Di conseguenza, la robusta replicazione del virus in condizioni di controllo può limitare la gamma dinamica di queste schermate. Inoltre, questi schermi potrebbero essere Impossibile identificare facilmente i percorsi di difesa cellulare che limitano la replicazione del virus, se il virus è in grado di contrastare le difese antivirali e ben adattati all'host. In questo articolo, descriviamo un nuovo paradigma per esplorare le interazioni virus-ospite attraverso l'uso di schermi che centro a naturalmente abortite infezioni da arbovirus come virus della stomatite vescicolare (VSV). Nonostante la capacità di riprodursi in una vasta gamma di insetti Ditteri e ospita mammiferi dei VSV, VSV subisce un'infezione post-voce, abortita in una varietà di linee cellulari derivate da lepidotteri insetti come il bombice dispari (Lymantria dispar). Tuttavia, queste infezioni VSV abortive possono essere "salvate" quando le difese antivirali di cellula ospite sono compromesse. Descriviamo come VSV ceppi codifica geni reporter conveniente e restrittive dispar L. linee cellulari possono essere accoppiate agli schermi di messa a punto per identificare fattori dell'ospite coinvolti nella restrizione da arbovirus. Inoltre, mostriamo anche l'utilità di questi strumenti di screening nell'identificazione dei fattori viralmente codificati che replica VSV durante il coinfection o attraverso l'espressione ectopica, compresi quelli codificati dal virus dei mammiferi di soccorso. La limitazione naturale della replica di VSV in dispar L. cellule fornisce un elevato rapporto segnale-rumore quando lo screening per le condizioni che favoriscono il salvataggio VSV, consentendo in tal modo l'uso di metodi semplicistici luminescenza e fluorescenza-basata per monitorare le modifiche nella replica di VSV. Queste metodologie sono utili per comprendere l'interazione tra risposte antivirali ospite e fattori virali evasione immune.

Come un esempio di applicazioni di imaging di cellule vive per monitorare salvataggio VSV su coinfection VACV, LD652 cellule erano placcate in un piatto chambered 8 pozzetti e poi mock-infettati o infettate con VSV-DsRed (MOI = 1) in presenza o assenza di VACV-FL-GFP (MOI = 25). Perché VSV-DsRed esprime DsRed come una proteina libera e non è fusa delle proteine strutturali di VSV (Figura 1A), viene rilevato solo dopo avvia VSV voce e l'espressione genica. Tut...

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia virale, come ad esempio, quali fattori dell'ospite limitano la replicazione dell'arbovirus e, a loro volta, quali proteine di evasione immunitaria codificate dal virus superano questi meccanismi di restrizione dell'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di utilizzare la luminescenza semplicistica e i saggi spaziali fluorescenti per definire le condizioni cellulari che consentono agli arbovirus di replicarsi in un'infezione altrimenti abortita nelle cellule di insetti lepidotteri. Poiché la replicazione di fondo degli arbovirus nelle cellule di lepidotteri è minima, diventa relativamente semplice rilevare le condizioni che consentono la replicazione degli arbovirus.Per iniziare, mantenere le cellule LD652 in piastre trattate con coltura tissutale di 10 centimetri e far passare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza. Pipettare ripetutamente il terreno sul monostrato cellulare per rimuovere le cellule, quindi diluire il campione nel terreno di crescita fino a una densità approssimativa di 100 mila cellule per millilitro. Successivamente, trasferire un millilitro della coltura diluita in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Quindi, lasciare che le cellule si stabilizzino per almeno un'ora. 30 minuti prima dell'infezione, scongelare i gambi di VSV luciferasi e virus vaccinico sul ghiaccio. Quindi, diluire la luciferasi VSV con e senza virus vaccinico in SFM, in modo tale da ottenere un MOI di 10 e 25, rispettivamente.Aspirare attentamente il terreno LD652 maturo, per evitare di disturbare il monostrato cellulare, e inoculare ogni pozzetto con 0,2 millilitri di virus. Successivamente, aggiungere SFM sterile a pozzetti aggiuntivi per fungere da controlli negativi finti infetti. Incubare le cellule in inoculo per due ore a 27 gradi Celsius.Quindi, rimuovere l'inoculo tramite aspirazione e sostituirlo con un millimetro di terreno di coltura LD652 in ciascun pozzetto. Dopodiché, lasciare che l'infezione proceda per altre 24-72 ore. Per prima cosa, aspirare con cura il surnatante e aggiungere un millilitro di DPBS a ciascun pozzetto.Usando uno stantuffo della siringa, raschiare le cellule in DPBS. Quindi, trasferire le celle in una provetta da microcentrifuga e centrifugare per 20 minuti a 400 volte la gravità e quattro gradi Celsius. Nel frattempo, diluire cinque volte il tampone di lisi del reporter in acqua sterile.Dopo la centrifugazione, aspirare il DPBS senza disturbare il pellet. Quindi, risospendere il pellet in 150 microlitri di una volta RLB. Quindi, incubare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, seguito da un rapido scongelamento in un bagno d'acqua a temperatura ambiente.Successivamente, conservare i lisati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per ulteriori analisi. Scongelare i lisati con ghiaccio e pipettare 20 microlitri di lisato nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di regione del saggio della luciferasi a ciascun pozzetto della piastra.Misurare immediatamente l'intensità della luce utilizzando un lumenometro. In condizioni di singola infezione, le cellule LD652 limitano la replicazione della luciferasi VSV. Pertanto, si osserva solo un piccolo segnale di luciferasi.La co-infezione, tuttavia, provoca segnali di luciferasi significativamente più elevati. In condizioni di singola infezione, le cellule LD652 limitano anche la replicazione di VSV dsRED, quindi solo un piccolo numero di cellule mostra un segnale dsRED. La co-infezione con il virus vaccinia, tuttavia, fa sì che la maggior parte delle cellule mostri segnali dsRED entro la fine del decorso temporale.Circa il 2% delle cellule delle singole infezioni era positivo per dsRED entro 65 ore dall'infezione. Al contrario, circa il 77% delle cellule co-infettate era dsRED positivo nello stesso momento. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare i punti temporali in cui verranno eseguiti i saggi della luciferasi o i punti temporali dell'imaging di cellule vive al fine di consentire al VSV di replicarsi e produrre un segnale rilevabile.Seguendo questa procedura, possono essere condotti altri metodi, come il knockdown dei fattori dell'ospite mediato dall'interferenza dell'RNA, al fine di identificare potenziali fattori antivirali dell'ospite che limitano la replicazione dell'arbovirus. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia virale per definire il ruolo delle proteine A51R codificate dal virus del vaiolo nel promuovere la replicazione e la patogenesi del virus del vaiolo. Non dimenticare che lavorare con i virus eucariotici può essere estremamente pericoloso ed è importante prendere le dovute precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.

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