Name: Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Impara un metodo a stampo per creare tessuti cardiaci tridimensionali senza impalcatura utilizzando sferoidi. Questa tecnica garantisce integrità strutturale e battito sincrono per studi di ingegneria tissutale cardiaca.

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Gli autori riconoscono la seguente fonte di finanziamento: il fondo di questioni che magia per ricerca cardiovascolare.

1. preparazione dei cardiomiociti
<ol><li>Piastre da 6 pozzetti cappotto con membrana basale matrix e cultura umana indotta cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) come precedentemente descritto17.</li>
	<li>Differenziarsi hiPSCs in hiPSC-CMs utilizzando metodi precedentemente descritti18.</li>
	<li>Alla post-differenziazione 16-18 d, sospendere i cardiomiociti risciacquando ogni pozzetto con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x senza calcio o magnesio, seguita da incubazione con 1 mL/bene di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi tabella di Materiali) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) cell supporti completati con B-27 (27/B-RPMI cell supporti). Pipettare su e giù per allentare eventuali cellule aderite.</li>
	<li>Raccogliere i cardiomiociti sospesi con una pipetta sierologica di 10 mL e trasferirli in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di RPMI/B-27 cell supporti.</li>
	<li>20 µ l di sospensione cellulare si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Utilizzare un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.</li>
</ol>2. preparazione dei fibroblasti
<ol><li>Avviare una coltura di una linea cellulare di (tipo adulto ventricolare) fibroblasti cardiaci umani (HCF) come descritto in precedenza16.</li>
	<li>Sospendere il HCF incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente16. Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato.</li>
	<li>Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, quindi trasferire il campione in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pellet.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di sviluppo del fibroblasto (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>20 µ l di sospensione cellulare HCF si combinano con una quantità uguale di soluzione di blu di trypan 0,4% e mescolare delicatamente.</li>
	<li>È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o manuale emocitometro per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule nuove.</li>
</ol>3. preparazione delle cellule endoteliali
<ol><li>Avviare una coltura di una linea di cellule endoteliali (HUVEC) di vena ombelicale umana come descritto in precedenza17. Sospendere il HUVECs incubando li con una quantità appropriata di tripsina o cella reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali) per 3 min a temperatura ambiente17. Neutralizzare il reagente di dissociazione tripsina o cella (Vedi Tabella materiali) utilizzando un volume uguale di mezzo, poi il trasferimento in una provetta conica da 50 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una pallina. Nota: Per un pallone T175, 10 mL di reagente di dissociazione di tripsina o cella è stato usato.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Combinare 20 µ l della sospensione HUVEC e macchia con una pari quantità di soluzione di blu di Trypan 0,4% e mescolare delicatamente.</li>
	<li>È possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro manuale per contare e ottenere la vitalità delle cellule e di concentrazione della sospensione delle cellule.</li>
</ol>4. creazione di appendere goccia sferoidi
<ol><li>Posizionare l'impiccagione dispositivo di discesa che contiene 850 micropori (ciascuna con un diametro di 350 µm) in piastre da 6 pozzetti sterili.</li>
	<li>Isolare i tre tipi di cellule, come descritto in precedenza: hiPSC-CMs, HCF e HUVECs. Combinarle in un rapporto di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in una provetta conica da 50 mL con RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL.</li>
	<li>Dispensare 4 mL della sospensione delle cellule (2.475.000 cellule / mL) in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato sistema goccia, (con un diametro di micropori di 350 µm), seduto in una piastra a 6 pozzetti d'attaccatura.</li>
	<li>Sferoidi formeranno spontaneamente entro 12 h di erogazione la sospensione cellulare nell'impiccagione dispositivo goccia. Continuare alla cultura per un totale di 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità per la maturazione di sferoidi.</li>
	<li>Dopo 72 h di cultura, raccogliere le sferoidi attraverso i pori nella parte inferiore dell'impiccagione goccia sistema posizionando il dispositivo in un piatto con il mezzo e agitando delicatamente per rilasciare le sferoidi da appendere goccia dispositivo.</li>
</ol>5. 3D Patch creazione usando il romanzo muffa netta
<ol><li>La base, piatto quadrato fondo, fondo netto e 10 lato a strati le reti vengono assemblate per creare lo stampo romanzo con l'aiuto di un paio di pinze sterili. In primo luogo, impilare e allineare la base, piatto quadrato fondo e fondo rete utilizzando i paletti d'angolo. Quindi, stack e le reti di 10 lato in direzione per creare una rete di fine acciaio inossidabile rebbi alternata di strato.</li>
	<li>Sciacquare il ripieno base con PBS o mezzo per ridurre la tensione superficiale e, quindi, trasferire lo stampo montato sulla base di riempimento.</li>
	<li>Bagnare la cavità dello stampo netto con PBS o mezzo nello stesso metodo. Riempire lentamente gli sferoidi nella cavità presupposta della dimensione desiderata (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, o 6 x 6 x 1 mm). Nota: Assicurarsi che il 120% del volume previsto di sferoidi è alimentato nella cavità affinché gli aggregati di cellule sono in stretto collegamento e rimanere statici.</li>
	<li>Assemblare la parte superiore netto e piastra superiore quadrata sul post di angolo e fissare i tappi e tubi di detenzione per prevenire un washout di sferoidi.</li>
	<li>Trasferire il sistema di stampo netto riempito su una piastra a 6 pozzetti con 6 mL di RPMI/B-27 cell supporti o in un contenitore sterile con abbastanza medio per coprire lo stampo intero assemblato.</li>
	<li>Incubare la piastra a 6 pozzetti con il sistema di stampo riempito con un agitatore oscillante per 7-10 giorni a 3.000-4.000 x g. Nota: La durata dell'incubazione è decisa dalle dimensioni delle patch cardiaci. Con le patch più grande, il tempo di incubazione dovrà essere aumentato per maturazione di patch cardiaci.</li>
</ol>6. rimozione del cerotto dallo stampo netto romanzo
<ol><li>Rimuovere il sistema di stampo dal supporto e posizionarlo sulla stuoia di movimentazione sterilizzati in un piatto di 10 cm sterile.</li>
	<li>Rimuovere il tubo di supporto, tappi, la piastra superiore quadrata e la rete superiore. Sfilare con attenzione le reti di lato a strati uno con un paio di pinze sterili. Dopo il decannulation, è ottenere un patch cardiaci intatto in cima a fondo netto.</li>
	<li>Pick up il fondo netto con la patch utilizzando pinze sterili e trasferire il fondo netto in un piatto di 35 mm con 5 mL di terreno RPMI/B27. Allentare leggermente la patch dal fondo netto agitando lentamente la rete nel piatto, o con un raschietto di cellule sterili. Dopo il distacco dal fondo netto, il tessuto cardiaco possa essere coltivato con RPMI/B27 media.</li>
	<li>Continuare a incubare la patch cardiaca 3D digalleggiante nel piatto 35 mm. Pestaggio sincrono funzionale può essere osservato più presto 24 h dopo la rimozione dallo stampo.</li>
	<li>Dopo aver rimosso la patch dallo stampo netto, osservare che la sua forma è mantenuta con l'integrità e l'intensità del battito sincrono aumenta con il tempo. Nota: Il netto 3D basati su stampo cardiaco patch ha esibito integrazione elettrica della componente cardiosfere dopo il decannulation. Abbiamo osservato una frequenza di battito che variano da 60 a 80 battiti al minuto che ha persistito per più di 60 giorni.</li>
</ol>

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<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
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<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
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<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il significato di questo metodo risiede nella sua riproducibilità e l'efficacia del tessuto cardiaco multistrato risultante. Nel campo dell'ingegneria del tessuto cardiaco, uno degli attuali obiettivi è quello di identificare un metodo per costruire palpitante, multistrata e funzionale 3D patch cardiache. Segnaliamo un metodo efficace e riproducibile di creare tessuti cardiaci multistrati di semina diretta manuale di sferoidi composti di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti in un romanzo stampo netto. Lo stam...

L'obiettivo di ingegneria del tessuto cardiaco attuale è quello di sviluppare una terapia per sostituire o riparare la struttura e la funzione del tessuto del miocardio danneggiato1. Metodi per creare modelli 3D del tessuto cardiaco che esibiscono le importanti proprietà contrattili ed elettrofisiologiche del tessuto cardiaco nativo sono stati rapidamente in espansione2,3. Una varietà di strategie sono stati esplorati e utilizzati in studi4,5. Questi vanno di metodi dall'uso di specifici idrogeli bioattivi naturali e sintetici, come gelatina, collagene, fibrina e peptidi6, a bio-inchiostro deposizione tecnologie2 e multimateriali tecnologie7.
È stato dimostrato che senza impalcatura metodi possono produrre tessuti paragonabile come metodi basati su biomateriale, senza gli svantaggi di incorporare ponteggi stranieri materiale8. Oren Caspi et al hanno dimostrato che l'incorporazione di vari tipi di cellule consente la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano altamente vascularized9. Mento et al ha sviluppato un metodo di stampa 3D per la creazione di patch cardiaci di sferoidi. Le patch risultante sono composte di cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali in un rapporto di 70:15:1510. Sferoidi sono stati indicati per essere efficaci "building blocks" della creazione del tessuto cardiaco senza impalcatura, come essi sono resistenti contro ipossia e possedere sufficiente integrità meccanica per l'impianto11,12. Gli studi precedenti hanno dimostrato parecchi metodi di fabbricazione per la creazione di sferoide, compreso l'uso dell'impiccagione drop metodo, spinner boccette13, di sistemi microfluidici14e antiaderente cultura superfici non rivestite o rivestite con agarosio micro-stampi15. In questo protocollo, usiamo l'impiccagione dispositivo di discesa, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta.
Questo studio presenta un romanzo e l'efficiente metodo senza impalcatura per la creazione di tessuto cardiaco, che comprende il seeding manualmente sferoidi in una cavità dello stampo quadrato e incubando il tessuto su un agitatore per maturazione. In condizioni di coltura statica usuale, diffusione dell'ossigeno è limitato agli aspetti esterni del costrutto del tessuto, con conseguente necrosi centrale. Tuttavia, con la muffa netta, tutte le sferoidi seminati nello stampo sono immersi nei media con un costante movimento fluidico, consentendo per la maggiore diffusione di sostanze nutritive e di ossigeno. Inoltre, questo metodo basato su stampo consente la creazione simultanea di patch di tessuto di diverse dimensioni con il minimo sforzo manuale e il tessuto risultante può essere facilmente rimosso dallo stampo. Questo nuovo metodo consente la creazione efficiente e riproducibile di patch cardiache senza impalcatura, multistrata.

<table><tbody><tr><td>Fibroblasti cardiaci umani (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Consiste in terreno di coltura basale</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF</td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC terreno di coltura</td></tr><tr><td>E8 media&nbsp;</td>Terreno di coltura <td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Tripsina e reagente di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Terreni RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>terreni RPMI con integratore di B-27 sono terreni di coltura hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Integratore di B-27 (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>terreni RPMI con integratore di B-27 sono terreni di coltura hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Soluzione, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nuovo stampo a rete&nbsp;</td><td>TissueByNet Co., Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di goccia sospesa</td><td>Kuraray Co., Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Questo protocollo descrive un romanzo e facile metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci di tridimensionale (3D) senza materiale aggiuntivo impalcatura. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs), fibroblasti cardiaci umani (HCF) e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) sono isolate e utilizzate per generare una sospensione cellulare con 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs. Sono co-coltivate in un sistema di "appendere goccia" attacco ultra-basso, che contiene micropori per condensazione centinaia di sferoidi in una sola volta. Le cellule di aggregazione e spontaneamente formano sferoidi pestaggio dopo 3 giorni di co-coltura. Sferoidi sono raccolte, seminati in una cavità dello stampo novello e coltivate su un agitatore in incubatrice. Sferoidi diventano un tessuto funzionale maturo circa 7 giorni dopo la semina. I tessuti multistrati risultanti è costituito da sferoidi fusi con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio. Questo nuovo metodo ha un potenziale promettente come un metodo riproducibile ed economico per creare tessuti ingegnerizzati per il trattamento dello scompenso cardiaco in futuro.

Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato una sospensione cellulare di 70% iPSC-CMs, HCF 15% e 15% HUVECs in RPMI/B-27 media delle cellule ad una concentrazione di 2.475.000 cellule per mL. Dopo aver creato la sospensione cellulare, abbiamo erogato 4 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un bassissimo allegato blocco sistema goccia, come descritto al punto 4.3 del protocollo. L'uso dell'impiccagione goccia sistema ha provocato la formazione spontanea di centinaia di battere ...

Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Questo protocollo descrive un metodo innovativo e semplice basato su stampi per la creazione di tessuto cardiaco tridimensionale, che utilizza gli sferoidi come strumento per la creazione di tessuto cardiaco senza scaffold . Nei nostri esperimenti sono stati isolati tre tipi di cellule, cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, fibroblasti cardiaci umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana e utilizzate per generare una sospensione cellulare. Con il 70% di cardiomiociti, il 15% di fibroblasti e il 15% di cellule endoteliali, in una provetta conica da 50 ML.Quindi distribuiamo la sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un sistema di gocce sospese a bassissimo attacco, che si tradurrà nella formazione spontanea di centinaia di sferoidi battenti dopo tre giorni. Gli sferoidi vengono quindi raccolti e inseriti in una nuova cavità dello stampo. Il tessuto viene quindi mantenuto in un contenitore sterile con terreno, su uno shaker nell'incubatrice per diversi giorni.Lo stampo viene successivamente rimosso, ottenendo un cerotto di tessuto privo di impalcatura con integrità meccanica. Il dispositivo di caduta per appendere è un pozzetto di fissaggio riutilizzabile e ultra basso con 850 micro pori, ciascuno con un diametro di 350 micron. La goccia sospesa è compatibile con le piastre standard a sei pozzetti.Dopo aver realizzato la sospensione cellulare, distribuiamo quattro millilitri di sospensione cellulare contenente 10 milioni di cellule, in ciascun pozzetto del sistema a goccia sospesa. I dispositivi sono coltivati a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità. Dopo 72 ore si osserva la formazione spontanea di sferoidi battenti, con un diametro medio di 350 micron.Gli sferoidi vengono raccolti posizionando il dispositivo di caduta sospesa in un altro piatto con mezzo e roteando delicatamente per rilasciare gli sferoidi e consentire loro di scivolare attraverso i pori nella parte inferiore del sistema di gocce sospese. Questo è uno schema del nuovo stampo per la creazione di tessuto cardiaco tridimensionale, senza impalcature. Include il tappetino di movimentazione, la base di riempimento e il nuovo stampo.Il nuovo stampo è composto da una base, una piastra quadrata inferiore, una rete inferiore, 10 strati di reti laterali realizzate con rebbi in acciaio inossidabile fine. Una rete superiore, una piastra quadrata superiore, i tubi di tenuta e i perni di arresto. Il sistema Novel Mold può creare tessuti di diverse dimensioni, tra cui due per due millimetri, quattro per quattro millimetri e sei per sei millimetri.La piastra quadrata inferiore di base e la rete inferiore vengono impilate e allineate utilizzando i montanti angolari. 10 strati di reti laterali vengono quindi impilati in direzioni alternate per creare una rete di rebbi sottili in acciaio inossidabile, con l'aiuto di un paio di pinze sterili. La base di riempimento viene quindi lavata con una soluzione tampone fosfato 1X, o PBS, per ridurre la tensione superficiale prima di inserire gli sferoidi nel nuovo stampo.Dopo aver bagnato la nuova cavità dello stampo nello stesso metano, gli sferoidi vengono inseriti nella cavità presupposta della dimensione desiderata. Una volta posizionato, il fluido in eccesso defluisce attraverso lo stampo a rete, consentendo agli sferoidi di riempirsi e assumere la forma della cavità predefinita. La rete superiore e la piastra quadrata superiore vengono quindi assemblate sui montanti angolari e vengono fissati i perni di arresto e i tubi di tenuta, per evitare il dilavamento degli sferoidi.Il nuovo sistema di stampi riempito viene trasferito su una piastra a sei pozzetti, con sei millimetri di terreno integrato con B-27, e quindi mantenuto nell'incubatore su un agitatore oscillante per sette-dieci giorni, a 30-40 giri/min. La durata dell'incubazione può essere modificata, a seconda delle dimensioni del cerotto cardiaco. Dopo l'incubazione, il sistema viene estratto e il tubo di contenimento, i tappi, la piastra quadrata superiore e la rete superiore vengono rimossi.Le reti laterali stratificate vengono quindi fatte scorrere con cura una ad una, facendo attenzione a non rompere il tessuto. Dopo la rimozione di tutte le reti laterali, si ottiene un cerotto cardiaco intatto sulla parte superiore della rete inferiore. Il battito sincrono funzionale si osserva entro 24 ore.Questo nuovo metodo basato su stampi è un metodo efficiente e semplice per creare tessuti cardiaci tridimensionali privi di impalcature, con il minimo sforzo manuale. I tessuti multistrato risultanti sono costituiti da sferoidi fusi con integrità strutturale soddisfacente e comportamento di battimento sincrono. Questo nuovo metodo basato su stampi rappresenta un'alternativa economica e scalabile agli attuali metodi di biofabbricazione di tessuti ingegnerizzati.

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Bioingegneria

In questo protocollo, dimostriamo la fabbricazione di substrati di coltura cellulare cardiaca biomimetica realizzati con due materiali polimerici distinti utilizzando la litografia a forza capillare.  I metodi descritti forniscono una tecnica scalabile ed economica per ingegnerizzare la struttura e la funzione dei tessuti cardiaci macroscopici per applicazioni in vitro e in vivo.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

Questo protocollo descrive la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

I modelli specifici del paziente migliorano la fiducia del chirurgo e dei colleghi durante lo sviluppo o l'apprendimento di piani chirurgici. Le stampanti tridimensionali (3D) generano dettagli adeguati per la preparazione chirurgica, ma non riescono a replicare la fedeltà tattile dei tessuti. Viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio la creazione di modelli cardiaci in silicone specifici per il paziente, combinando la precisione della stampa 3D con il tessuto siliconico simulato.

Creazione di modelli cardiaci in silicone specifici per il paziente con applicazioni in piani pre-chirurgici e formazione pratica

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Impara un metodo a stampo per creare tessuti cardiaci tridimensionali senza impalcatura utilizzando sferoidi. Questa tecnica garantisce integrità strutturale e battito sincrono per studi di ingegneria tissutale cardiaca.

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

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