Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

Questo protocollo descrive un metodo innovativo e semplice basato su stampi per la creazione di tessuto cardiaco tridimensionale, che utilizza gli sferoidi come strumento per la creazione di tessuto cardiaco senza scaffold . Nei nostri esperimenti sono stati isolati tre tipi di cellule, cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, fibroblasti cardiaci umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana e utilizzate per generare una sospensione cellulare. Con il 70% di cardiomiociti, il 15% di fibroblasti e il 15% di cellule endoteliali, in una provetta conica da 50 ML.

Quindi distribuiamo la sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un sistema di gocce sospese a bassissimo attacco, che si tradurrà nella formazione spontanea di centinaia di sferoidi battenti dopo tre giorni. Gli sferoidi vengono quindi raccolti e inseriti in una nuova cavità dello stampo. Il tessuto viene quindi mantenuto in un contenitore sterile con terreno, su uno shaker nell'incubatrice per diversi giorni.

Lo stampo viene successivamente rimosso, ottenendo un cerotto di tessuto privo di impalcatura con integrità meccanica. Il dispositivo di caduta per appendere è un pozzetto di fissaggio riutilizzabile e ultra basso con 850 micro pori, ciascuno con un diametro di 350 micron. La goccia sospesa è compatibile con le piastre standard a sei pozzetti.

Dopo aver realizzato la sospensione cellulare, distribuiamo quattro millilitri di sospensione cellulare contenente 10 milioni di cellule, in ciascun pozzetto del sistema a goccia sospesa. I dispositivi sono coltivati a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità. Dopo 72 ore si osserva la formazione spontanea di sferoidi battenti, con un diametro medio di 350 micron.

Gli sferoidi vengono raccolti posizionando il dispositivo di caduta sospesa in un altro piatto con mezzo e roteando delicatamente per rilasciare gli sferoidi e consentire loro di scivolare attraverso i pori nella parte inferiore del sistema di gocce sospese. Questo è uno schema del nuovo stampo per la creazione di tessuto cardiaco tridimensionale, senza impalcature. Include il tappetino di movimentazione, la base di riempimento e il nuovo stampo.

Il nuovo stampo è composto da una base, una piastra quadrata inferiore, una rete inferiore, 10 strati di reti laterali realizzate con rebbi in acciaio inossidabile fine. Una rete superiore, una piastra quadrata superiore, i tubi di tenuta e i perni di arresto. Il sistema Novel Mold può creare tessuti di diverse dimensioni, tra cui due per due millimetri, quattro per quattro millimetri e sei per sei millimetri.

La piastra quadrata inferiore di base e la rete inferiore vengono impilate e allineate utilizzando i montanti angolari. 10 strati di reti laterali vengono quindi impilati in direzioni alternate per creare una rete di rebbi sottili in acciaio inossidabile, con l'aiuto di un paio di pinze sterili. La base di riempimento viene quindi lavata con una soluzione tampone fosfato 1X, o PBS, per ridurre la tensione superficiale prima di inserire gli sferoidi nel nuovo stampo.

Dopo aver bagnato la nuova cavità dello stampo nello stesso metano, gli sferoidi vengono inseriti nella cavità presupposta della dimensione desiderata. Una volta posizionato, il fluido in eccesso defluisce attraverso lo stampo a rete, consentendo agli sferoidi di riempirsi e assumere la forma della cavità predefinita. La rete superiore e la piastra quadrata superiore vengono quindi assemblate sui montanti angolari e vengono fissati i perni di arresto e i tubi di tenuta, per evitare il dilavamento degli sferoidi.

Il nuovo sistema di stampi riempito viene trasferito su una piastra a sei pozzetti, con sei millimetri di terreno integrato con B-27, e quindi mantenuto nell'incubatore su un agitatore oscillante per sette-dieci giorni, a 30-40 giri/min. La durata dell'incubazione può essere modificata, a seconda delle dimensioni del cerotto cardiaco. Dopo l'incubazione, il sistema viene estratto e il tubo di contenimento, i tappi, la piastra quadrata superiore e la rete superiore vengono rimossi.

Le reti laterali stratificate vengono quindi fatte scorrere con cura una ad una, facendo attenzione a non rompere il tessuto. Dopo la rimozione di tutte le reti laterali, si ottiene un cerotto cardiaco intatto sulla parte superiore della rete inferiore. Il battito sincrono funzionale si osserva entro 24 ore.

Questo nuovo metodo basato su stampi è un metodo efficiente e semplice per creare tessuti cardiaci tridimensionali privi di impalcature, con il minimo sforzo manuale. I tessuti multistrato risultanti sono costituiti da sferoidi fusi con integrità strutturale soddisfacente e comportamento di battimento sincrono. Questo nuovo metodo basato su stampi rappresenta un'alternativa economica e scalabile agli attuali metodi di biofabbricazione di tessuti ingegnerizzati.