Umanizzato NOD/SCID/IL2rγ^null (hu-NSG) Mouse modello per studi di latenza e di replicazione dell'HIV

Queste questioni possono aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sull'HIV/AIDS, come il meccanismo molecolare e la prognosi dell'infezione da HIV, e come e dove viene stabilito il serbatoio di latenza. Il vantaggio di questa tecnica è che non è invasiva e ha stabilito un topo hu-NSG che deve trattare uno sviluppo multi-lignaggio rispetto alle cellule staminali umane trapiantate che sono suscettibili all'infezione da HIV e sono ricettive al cART. Inizia filtrando un campione di tessuto digerito, umano, fetale, epatico, liquame attraverso uno sterile, 70 micrometri, nylon, filtro mesh per ottenere una sospensione a singola cella e arricchisci per CD34 + HSC mediante smistamento magnetico attivato delle celle secondo le istruzioni del produttore.

Dopo il conteggio, sospendere di nuovo l'HSC a una concentrazione di DPBS fresca su ghiaccio due volte dieci-al-settima cellule vitali per millilitro. Quindi posizionare un'intera lettiera di topo NOD/SCID/gamma o NSG umana neonatale in una gabbia di irradiazione sterile, a forma di torta, e trattare gli animali con da 200 a 250 gradi centigradi di raggi gamma da una sorgente di radiazione di cesio-137. Quindi caricare le cellule in una siringa Hamilton 80508 da 50 microlitri su misura dotata di un ago calibro 30 e iniettare ogni animale neonatale direttamente nel fegato con CD34+HSC umano cinque volte dieci-al-quinto praticabile e 25 microlitri di DPBS.

Da dieci a dodici settimane dopo l'infezione, spin-down retro-orbitale, periferico, campioni di sangue da ogni topo per centrifugazione, e trasferire i supernate plasmatiche in tubi di microcentrifugo per una conservazione negativa di 80 gradi Celsius come sperimentalmente appropriato. Per la convalida dell'innesto HSC, sospendere di nuovo i pellet con 200 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi e estrarre le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millimetri per un'incubazione di dieci minuti a temperatura ambiente. Quindi raccogliere i restanti globuli bianchi per centrifugazione per due lavaggi in 0,5 millilitri di albumina di siero bovino fresca dello 0,01%, o BSA, in DPBS per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, bloccare le cellule con 100 microlitri di cocktail bloccante per venti minuti a 4 gradi Celsius seguiti dall'etichettatura con l'appropriato cocktail anti-corpo di interesse a 2 microlitri di anti-corpo per concentrazione di cellule uno-per-uno-al-sesto. Dopo 30 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule due volte in DPBS più BSA fresco e valutare i campioni di sangue periferici per citometria a flusso secondo protocolli standard per quantificare la percentuale di cellule CD45+CD3+CD14+ o CD19+ umane per campione. Quindi calcolare il rapporto tra cellule CD4+ e CD8+T e valutare la carica virale con nei campioni di plasma secondo protocolli PCR standard, quantitativi, inversi.

Per valutare gli effetti dell'infezione da HIV, fornire il virus della balla HIV a topi anestetizzati, umani, NSG con una popolazione di CD45+ cellulare umana superiore al 20% nel sangue periferico, a 200 nanogrammi di P24 per concentrazione di topo tramite somministrazione intraperitoneale, raccogliendo campioni di sangue tramite sanguinamento retro-orbitale ogni due settimane e analizzare sia il rapporto CD4-CD8 che la carica virale plasmatica , come dimostrato. Per la convalida della soppressione virale fornire agli animali NSG infetti e umani una terapia fresca, combinatoria, antiretrovirale, o cART, in acqua zuccherata ogni settimana per 4 settimane, raccogliendo campioni di sangue tramite sanguinamento retro-orbitale ogni due settimane e analizzando sia il rapporto CD4-CD8 che la carica virale al plasma come dimostrato. Per valutare il rimbalzo virale quando i carichi virali del plasma sono al di sotto del limite di rilevamento e il rapporto CD4-CD8 viene ripristinato tra 1,5 e 2,5 raccogliere campioni di sangue periferici attraverso sanguinamento retro-orbitale ogni 2 settimane dopo il prelievo cART e valutare i campioni come dimostrato.

Durante la convalida iniziale dell'innesto, il numero umano di cellule CD45+ dovrebbe variare dal 20 all'80%, e i sottoinsiemi di leucociti umani dovrebbero apparire come popolazioni discrete dall'analisi citometrica del flusso. Il rapporto tra CD4+e CD8+cellule rimane compreso tra 1,5 e 2,5 in individui sani, mentre l'esaurimento significativo delle cellule CD4+T è tipicamente osservato quando si osserva un'infezione virale. In particolare, il rapporto sano viene ripristinato in risposta al trattamento cART.

Il rilevamento di carichi virali plasmatica da parte della RT PCR quantitativa durante tutto il corso dell'infezione e del regime cART può essere tracciato e utilizzato per valutare l'efficienza della consegna virale e del trattamento antivirali, rispettivamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli studi di virologia dell'HIV / AIDS e sullo sviluppo terapeutico, può anche essere applicato ad altri studi relativi alle malattie umane, come il cancro, il diabete e le malattie autoimmuni. Lo sviluppo del modello di topo hu-NSG ha spianato la strada ai ricercatori in immunologia e oncologia per esplorare una nuova disfunzione e patologia nell'uomo, in particolare studi meccanici e terapeutici mirati all'infezione cronica da HIV e al serbatoio di latenza.