Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica PCSK9, come ad esempio quali farmaci o cambiamenti genetici influenzano la funzione proteolitica di PCSK9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una lettura rapida e amplificabile di un evento biochimico intrinsecamente a bassa frequenza. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla cardiopatia aterosclerotica perché la funzione proteolitica di PCSK9 è necessaria per il suo effetto finale sui livelli sierici di colesterolo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su PCSK9 stesso, può essere applicato anche ad altri sistemi biochimici come altre proteasi con attività proteolitica intrinsecamente bassa. Per iniziare, aspirare il terreno da ciascuna cellula T HEK293. Lavare con PBS e trattare con il volume minimo di 0,5% di tripsina-EDTA.

E incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti per dissociare le cellule dal pallone genitore. Aggiungere due volumi di DMEM integrati con il 10% di FBS per inattivare la tripsina-EDTA. Quindi pipettare più volte il liquido nel pallone, rimuovendo le cellule aderenti e trasferendo le cellule in una provetta sterile.

Quindi, rimuovi una piccola aliquota di cellule. Colorare con un volume uguale di blu di tripano e trasferire le cellule colorate su un vetrino, quindi utilizzare un contatore di cellule automatizzato per contare le cellule. Centrifugare la provetta a 500 volte G per cinque minuti per recuperare le cellule.

Successivamente, aspirare il terreno e ricostituire le cellule e il terreno di coltura alla concentrazione desiderata. Utilizzando una pipetta multicanale e un trogolo sterile, trasferire 100 micrometri di cellule in ciascun pozzetto in una piastra bianca da 96 pozzetti. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Quindi, preparare la piastra di plasmidi alla concentrazione desiderata per la trasfezione, inclusi quattro pozzetti ciascuno per il plasmide di controllo positivo, il plasmide di controllo negativo e il tampone privo di plasmidi. Innanzitutto, preparare una miscela master di reagente di trasfezione lipidica diluita e una miscela master di reagente di pre-complessazione del DNA. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale e un trogolo sterile, aliquotare 16,8 microlitri di reagente di pre-complessazione del DNA diluito in ciascun pozzetto di una piastra a pozzetti profondi.

Successivamente, utilizzare la pipetta multicanale per trasferire 3,2 microlitri di ciascun plasmide dalla piastra master a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi. Quindi, utilizzare la pipetta per aggiungere 20 microlitri della miscela di reagenti per la trasfezione dei lipidi diluiti a ciascun pozzetto della piastra e mescolare accuratamente. Copri le piastre e lasciale riposare a temperatura ambiente per 10-15 minuti per formare complessi di DNA lipidico.

Successivamente, utilizzare la pipetta multicanale per rimuovere delicatamente il terreno dalle 293 cellule T nella piastra a 96 pozzetti. Quindi, sostituire il Medium con 95 microlitri di DMEM integrati con il 10% di FBS. Quindi, utilizzare la pipetta multicanale per aggiungere 10 microlitri della miscela di trasfezione a ciascun pozzetto appropriato.

Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Innanzitutto, preparare le soluzioni madre necessarie per produrre il reagente per il saggio della celenterazina a doppia potenza, tra cui tre molari di ascorbato di sodio in PBS, cinque molari di cloruro di sodio in acqua distillata, 10 milligrammi per millilitro di BSA in PBS e due millimolari di celenterazina in metanolo acidificato. Successivamente, preparare una quantità sufficiente di reagenti per la lettura della luciferasi.

Con un reagente separato per le cellule nel terreno. Quindi, mescolare tutti i reagenti previsti per la celenterazina. Filtrare la miscela attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri.

E poi, dopo la filtrazione, aggiungere la celenterazina. Rimuovere le cellule dall'incubatore 24 ore dopo la trasfezione. Quindi, utilizzare la pipetta multicanale per trasferire 50 microlitri di terreno condizionato da ciascun pozzetto a una piastra bianca a 96 pozzetti fresca.

Utilizzare la pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente celeterazina non litica a doppia dose alla piastra contenente solo terreno condizionato. Quindi, agitare delicatamente il piatto al buio per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere questo passaggio aggiungendo il reagente celeterazina litica a doppia forza alla piastra contenente le cellule.

Dopo l'incubazione, misurare la luminescenza della piastra solo terreno e della piastra contenente cellule in un lettore di piastre. Infine, scartare le piastre e salvare i file per un'ulteriore analisi dei dati. È importante incubare il reagente luciferasi con la piastra solo medium e la piastra contenente cellule per lo stesso periodo di tempo perché i dati di queste piastre vengono confrontati direttamente.

In questo protocollo, la specificità della sequenza di clivaggio della proteasi PCSK9 nei siti di substrato da P6 a P6 Prime è stata valutata mediante un saggio di luciferasi. I cambiamenti nella sequenza di scissione nelle posizioni P6 e da P4 a P1 Prime sono scarsamente tollerati dalla proteasi. Ma le posizioni da P5 e P2 Prime a P6 Prime sono più flessibili da cambiare.

Inoltre, i risultati mostrano che le sequenze di scissione ottimali sono essenzialmente le stesse della sequenza di tipo selvaggio. L'attività di scissione relativa di una libreria di cesoie di dissenso trovate nella clinica è stata confrontata con la proteasi di tipo selvatico. Degli 84 snip valutati, oltre la metà ha dimostrato cambiamenti significativi nell'attività rispetto alla proteasi wild type, suggerendo che alterazioni nell'attività della proteasi sono frequentemente osservate nella popolazione clinica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la citometria a flusso o i saggi di captazione del colesterolo negli epatociti, per valutare le alterazioni della capacità proteolitica di PCSK9 sull'effetto di PCSK9 sul recettore LDL.