Name: Unanalisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come valutare l'attività proteolitica di PCSK9 con un saggio di luciferasi ad alto rendimento utilizzando cellule HEK293 T. Questo metodo consente letture rapide e amplificabili di eventi biochimici a bassa frequenza, fondamentale per lo sviluppo di terapie contro l'ipercolesterolemia e le malattie cardiovascolari.

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Gli autori ringraziano il generoso sostegno finanziario dal NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH attraverso la UCSF clinica e traslazionale Science Institute catalizzatore Program (UL1 TR000004), il Senato accademico di UCSF, la Fondazione di Hellman, una Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio di cardiovascolare Pfizer ASPIRE (tutte John S. Chorba) e l'Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).

1. mutagenesi di proteasi vettoriale
<ol><li>Progettare e ordinare oligonucleotidi sintetizzati personalizzato per installare una mutazione di interesse usando una modifica di protocolli di mutagenesi sito-diretta standard12. Primer standard dissalate (senza ulteriore purificazione) sono perfettamente accettabili. Nota: Un approccio generale ai disegni di primer comporta la creazione di primer parzialmente sovrapposti come indicato nella tabella 1, utilizzando una calcolatrice fusione di temperatura (Tm) specifica per la polimerasi di interesse.</li>
	<li>Impostare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) per la mutagenesi sito-diretta su ghiaccio, come indicato nella tabella 2.</li>
	<li>Il ciclo PCRs, come indicato nella tabella 3.</li>
	<li>Eseguire 2-5 µ l di ogni PCR su un gel di agarosio all'1% e visualizzare i prodotti per confermare un'amplificazione di successo. Nota: Una riuscita PCR mostrerà una banda di DNA singola, prominente al marcatore di dimensione approssimativa del modello (~7.8 kB).</li>
	<li>Aggiungere 0,5 µ l (per reazione di 25-µ l) di DpnI e incubare i campioni a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Trasformare 2 µ l della reazione in Escherichia colichimicamente competente. Nota: Un ceppo di e. coli rapida crescita ridurrà i tempi di incubazione, ma qualsiasi ceppo di clonazione sarà accettabile.</li>
	<li>Piastra le trasformazioni su Luria-Bertani (LB) agar contenente carbenicillina di 50-100 µ g/mL. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.</li>
	<li>Selezionare 2-4 colonie a crescere in una cultura in piccola scala (2-5 mL di LB medium con carbenicillina di 50-100 µ g/mL). Incubare la coltura a 37 ° C a 220 giri/min fino a quando è torbido.</li>
	<li>Isolare il DNA dalle cellule utilizzando un kit di purificazione (cioè, "miniprep") del DNA del plasmide secondo le istruzioni del produttore del plasmide. Quantificare la concentrazione di DNA eluita utilizzando uno spettrofotometro di microvolume.</li>
	<li>Sequenza del plasmide DNA ampiamente utilizzando un servizio di sequenziamento Sanger (ad esempio un core o struttura commerciale). Preparare i campioni di DNA in base alle specifiche del servizio. Primer usati con successo nelle reazioni di sequenziamento preventiva sono indicati nella tabella 4. Nota: Per l'amplificazione di PCR del plasmide intero, il sequenziamento di intera regione di codificazione di PCSK9 è consigliato per ogni mutante.</li>
</ol>2. high-throughput proteolisi basati su Luciferase Assay
<ol><li>
Placcatura di cella (giorno 0)
	<ol>
<li>Utilizzare cellule HEK293T basso-passaggio per esperimenti e una cultura di Dulbecco modificato medium di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS). Eseguire tutto cella di lavoro in condizioni di sterilità in un cappuccio di coltura del tessuto fino al momento di saggiare l'attività luciferasica. Stimare il numero di pozzi e piatti necessari per l'esperimento, anticipando che transfezioni verranno eseguite in triplice copia per ogni condizione testata.</li>
		<li>Dissociare HEK293T cellule da una boccetta di padre trattandole con un volume minimo di 0.05% acido di tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per coprire le cellule. La tripsina-EDTA con 2 volumi di DMEM completati con 10% FBS e trasferimento di inattivare le cellule in una provetta sterile. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato (e colorazione con trypan blu). Centrifugare la provetta a 500 x g per 5 min recuperare le cellule.</li>
		<li>Aspirare il mezzo contenente tripsina e ricostituire le cellule nel terreno di coltura ad una concentrazione di 2 x 105 cellule/mL. Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 µ l delle cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti bianco (opaco fondo), che dà una concentrazione finale di semina di 2 x 104 cellule per pozzetto. Nota: Per gli esperimenti iniziali, può essere utile eseguire il seeding inoltre una sorella, clear-fondo piastra a 96 pozzetti, in modo da monitorare la crescita delle cellule e aderenza durante il protocollo e la Guida di risoluzione dei problemi futuri.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h.</li>
		<li>Preparare un piatto matrice dei plasmidi in un formato a 96 pozzetti. Diluire ogni plasmide in tampone di eluizione (Tris-HCl, pH 8.5) a 50 ng / µ l in un singolo pozzo di una piastra a 96 pozzetti.<ol>
<li>Preparare 4 pozzetti ciascuna per il controllo positivo (WT) plasmide8, controllo negativo (S386A) plasmide8e privo di plasmide buffer (per transfezioni finti). Se farmaci o altri trattamenti basati su cellulare sono previste, quindi preparano il piatto matrice con il plasmide di controllo positivo (WT) in ciascun pozzetto, insieme a 4 pozzetti ciascuna il plasmide di controllo negativo (S386A) e il buffer di plasmide-libero.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfezione (giorno 1)
	<ol>
<li>Preparare la miscela di transfezione in un formato di piastra a 96 pozzetti utilizzando piastre da 96 pozzetti profondo-bene. Eseguire le transfezioni in triplice copia, avendo cura di preparare abbastanza reagenti per contabilizzare le perdite di pipettaggio e trasferimento. Nota: I seguenti calcoli preparano abbastanza reagente per eseguire una piastra a 96 pozzetti in triplice copia (stimata conservativamente per 420 pozzi).<ol>
<li>Fare un mix master di un reagente di transfezione del lipido diluito, aggiunta di 50,4 µ l di reagente a 2050 µ l di siero ridotto medio. Fare un mix master di un reagente di DNA precomplexation, aggiunta di 33,6 µ l di reagente in 1730 µ l di terreno di siero ridotto.</li>
			<li>Usando una pipetta multicanale, aliquotare 16,8 µ l di miscela diluita di reagente di precomplexation DNA in ciascun pozzetto della piastra profondo-bene.</li>
			<li>Usando una pipetta multicanale, aliquotare 3,2 µ l (160 ng) di ogni plasmide dalla piastra master in ciascun pozzetto della piastra profondo-bene.</li>
			<li>Usando una pipetta multicanale, aliquota 20 µ l della miscela reagente transfezione del lipido diluito a ogni bene della piastra e mescolare il contenuto di ogni pozzetto usando la pipetta multicanale. Coprire le piastre e li lasciate riposare a temperatura ambiente (TA) per 10-15 min per formare complessi lipidici: DNA. Nota: Al momento di transfezione, i componenti finali per pozzetto sarà come segue: 40 ng di DNA, 0,12 µ l di reagente di transfezione e 0.08 µ l di reagente pre-complessazione del DNA e il contenuto di ogni bene sarà 10 µ l in volume totale (ridotto-siero medio).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Delicatamente e scambiare il mezzo sulle cellule 293T nelle piastre da 96 pozzetti usando una pipetta multicanale, avendo cura di non per danneggiare le cellule. Sostituire il mezzo aspirato con 95 µ l di DMEM supplementato con 10% FBS. Nota: Questo sarebbe un tempo adeguato per il trattamento delle cellule con qualsiasi farmaco di interesse.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l della miscela di transfezione per ogni appropriato bene tramite una pipetta multicanale. Agitare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto nei pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% CO2 per 24 h. Nota: Il volume finale dei pozzi arriva a 105 µ l, per tenere conto per evaporazione oltre 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosaggio (giorno 2)
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di riserva per i reagenti coelenterazine: ascorbato di sodio 3 M [disciolto in tampone fosfato salino (PBS), preparato fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina di siero bovino (BSA; disciolto in PBS, preparata con ingredienti freschi) e 2 mM coelenterazine (disciolto in metanolo acidificato contenente 200 µ l di 3 N HCl 10 millilitri). Nota: Il coelenterazine di 2 mM possa essere memorizzati per 2 settimane quando viene mantenuta a-80 ° C e in assenza di luce.</li>
		<li>Preparare 2 x coelenterazine reagenti per la lettura della luciferasi, con un separato reagente per le cellule e medie, secondo la tabella 5. Mescolare tutti i reagenti salva la coelenterazine prima, filtrare la miscela attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm e quindi aggiungere il coelenterazine. Proteggere i reagenti dalla luce fino a quando non sono pronti per essere aggiunti ai piatti. Nota: A causa della perdita di soluzione da filtrazione, rendere abbastanza reagente per rappresentare sia la perdita da filtrazione, nonché da trasferimenti. La tabella 5 Mostra la concentrazione finale di reagenti 2 x (come pure la quantità di soluzione di riserva per aggiungere per leggere su una piastra a 96 pozzetti con un reagente).</li>
		<li>Rimuovere le cellule dall'incubatrice 24 ore dopo la trasfezione. Usando una pipetta multicanale, trasferire 50 µ l del medium condizionato da ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fresca, con fondo bianco (opaca).<ol>
<li>Etichettare le piastre per determinare se essi contengono medio o cellule. Se più di una piastra a 96 pozzetti era transfettata, etichettare le piastre in modo da garantire che ogni piatto medio-contenenti è accoppiato con la sua zolla di padre delle cellule.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di reagente non litici coelenterazine: 2x per la piastra che contiene solo il medium condizionato. Delicatamente roccia o agitare la piastra in assenza di luce per 5-10 minuti a TA.</li>
		<li>Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di reagente di litica coelenterazine x 2 per la piastra che contiene le cellule. Delicatamente roccia o agitare la piastra in assenza di luce per 5-10 minuti a TA.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, letto la luminescenza della piastra sola medio in un lettore di piastra. Quindi, leggere la luminescenza della piastra che contiene delle cellule nel lettore della piastra stessa.</li>
		<li>Scartare le piastre e salvare i file per l'analisi dei dati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi dei dati
<ol><li>Eseguire un'analisi iniziale dei dati utilizzando il software di foglio di calcolo. Creare un foglio di calcolo contenente i risultati di cella e le piastre di terreno.</li>
	<li>Controllare manualmente i dati delle placche in cella per identificare pozzi mal trasfettate. Pozzi che mostrano &lt; 5% - 10% della lettura del plasmide controllo negativo (S386A) dovrebbe essere considerata come scarsamente transfettate, rendendo l'interpretazione di quei dati sospetto.</li>
	<li>Calcolare la luminescenza di fondo media di ciascuna piastra dai pozzetti mock-transfettate. Sottrarre lo sfondo di ogni piatto dai valori di quel piatto. Nota: Questo valore può essere trascurabile a seconda del lettore della piastra utilizzato.</li>
	<li>Elaborare i dati da calcolare la proporzione di attività luciferasica nel medio rispetto all'attività complessiva di luciferase per ciascun pozzetto. Perché la piastra di cella contiene entrambi medium condizionato oltre alle cellule, e la piastra solo medio contiene la stessa quantità del medium condizionato alla piastra, è opportuno utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Qui, RLU = luminescenza relativa unità, la lettura di sfondo-sottratto dal lettore della piastra.</li>
	<li>Calcolare la media luciferasi secrete del controllo positivo (WT) e i pozzetti di controllo negativo (S386A).</li>
	<li>Valutare la qualità complessiva dell'esperimento calcolando un fattore Z13: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Nota: I valori attivi provengono dal controllo positivo (WT) e i valori inattivi dai pozzetti di controllo negativo (S386A). Valori più vicini a 1 indicano una qualità superiore sperimentale. Provare a ripetere l'esperimento o ottimizzazione del workflow se il valore è inferiore a 0.</li>
	<li>Trasferire i dati dal foglio di calcolo nel software di analisi di dati scientifici.</li>
	<li>Normalizzare l'attività di luciferase secrete per i valori medi del controllo positivo (WT) e il controllo negativo (S386A), impostando il controllo positivo come negativo ed 1 come 0.</li>
	<li>Pulire i dati per valori anomali utilizzando il metodo di rimozione (disfatta) di regressione e outlier, impostazione della velocità massima scoperta falsa all'1%.</li>
	<li>Valutare per differenze statisticamente significative confrontando i dati per ogni condizione mutante (o mutante) alla media dell'attività WT (normalizzato per un valore pari a 1). Eseguire più spaiati t-test, correzione per i confronti multipli utilizzando il metodo di Holm-Sidak e α = 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
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<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
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<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le procedure sperimentali descritte sopra presentano un metodo per superare l'attività intrinsecamente bassa della singolo-fatturato proteasi PCSK9 e valutare la sua funzione proteolitica in modo robusto. Il concetto chiave del dosaggio si basa sulla conversione di un evento singolo-fatturato in una lettura enzimaticamente amplificata. I punti di forza del test includono la relativamente breve periodo di tempo e facilità d'uso del reporter di luciferase, come pure la sua scalabilità agli approcci di alto-rendimento. Inol...

PCSK9 è destinato il ricevitore di LDL (LDL-R) per la degradazione, innalzamento del colesterolo LDL (LDL-C) e guida la malattia cardiaca aterosclerotica1,2. Therapeutics targeting PCSK9 robusto abbassare LDL-C e per migliorare i risultati cardiovascolari per i pazienti, anche quando aggiunto ad una terapia ipolipemizzante aggressiva con le statine3,4. Tuttavia, terapie attualmente approvate sono limitate ad approcci basati su anticorpi e soffrono di una mancanza di redditività5,6. Per risolvere questo problema, le alternative terapeutiche meno costose, un mezzo per identificare i pazienti probabilmente ottenere maggiori benefici, o entrambi, sono necessari.
Approcci della piccolo-molecola bersaglio intracellulare PCSK9, fornirebbe una migliore via di somministrazione e ridurre i costi, che li rende il "Santo Graal" in questa zona7. Tuttavia, PCSK9 è dimostrato difficile da droga di piccole molecole. Come una proteasi, targeting funzione proteolitica di PCSK9 è un'attraente strategia, come self-proteolisi sono la tappa limitante di PCSK9 maturazione8 ed sono necessaria per il suo massimo effetto su LDL-R9. Fin qui, tuttavia, questa strategia non ha avuto successo, probabilmente a causa di biochimica unica di PCSK9: PCSK9 fende solo sé10, eseguendo una reazione di singolo-fatturato, e dopo auto-fenditura, la PCSK9 propeptide rimane legato nel sito attivo come un auto-inibitore11, impedendo la lettura di qualsiasi ulteriore attività di proteasi.
Questo articolo presenta un metodo per valutare la funzione proteolitica PCSK9 in moda di alto-rendimento8. Attraverso mutagenesi sito-diretta, gli investigatori possono utilizzare questo test per sondare gli effetti di codifica SNPs trovati nella clinica per valutarli per effetti sulla proteolisi, la tappa limitante di PCSK9 maturazione. Inoltre, questo metodo sarà utile nella progettazione di schermi ad alta produttività per identificare i modulatori della proteolisi PCSK9, che si prevedono, infine, interferire con la presentazione di PCSK9 al LDL-R (e modulare l'effetto ipercolesterolemico di PCSK9) . Infine, questo protocollo può essere adattato alle altre proteasi con attività intrinsecamente bassa, purché i) una coppia di substrato-proteasi specifiche possa essere trovata, e ii) un adeguato ancoraggio intracellulare può essere stabilita per il substrato.

<table><tbody><tr><td>Provette per PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td> Miscela <td>di soluzioni di DNA polimerasi</td></tr><tr><td>deossinucleotidica</td> ad alta fedeltà <td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTP (per PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Autori</td><td>n/a</td><td>Disponibile dagli autori</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Autori</td><td>n/a</td><td>Disponibile dagli autori</td></tr><tr><td>Agarosio LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Per gel DNA Sistema</td></tr><tr><td>E-Gel Imager con base a luce blu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4466612 Per l'imaging</td> di <td>gel DNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Per gel DNA</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Per tampone di corsa in gel di DNA</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Per tampone di corsa in gel di DNA</td></tr><tr><td>Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, per tampone di corsa in gel di DNA</td></tr><tr><td>1 kb Scala di DNA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td>Scala di DNA</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>Piastre LB Agar con 100 &micro; g/mL carbenicillina</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Carb piastre</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T Resistente ai fagi Chimicamente competente E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Cellule chimicamente competenti</td></tr><tr><td>LB Brodo, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-5</td><td>Antibiotico</td></tr> <tr>selettivo<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>Kit Miniprep per la purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Spettrofotomero NanoDrop 2000 Spettrofotometro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spettrofotometro</td></tr><tr><td>293T Cells American Tissue</td><td>Culture Collection (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T cells</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, cellula di mammifero Sieri</td></tr><tr><td>fetali bovini</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Tripsina, per dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Contatore automatico di cellule Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Conteggio automatico delle cellule</td></tr><tr><td>Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Vetrini per conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale CELLSTAR, bianche, a fondo bianco, con coperchio</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Piastra a 96 pozzetti bianca a fondo bianco</td></tr><tr><td>TempPlate piastra per PCR a 96 pozzetti senza bordatura, naturale</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>Piastra a 96 pozzetti per piastra plasmidico master</td></tr><tr><td>Nunc 2.0mL DeepWell Piastre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>Piastra a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific L3000008</td><td></td><td>Reagente per trasfezione lipidica, Reagente Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 Reagente</td> per <td>pre-complessazione del DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td>, fornito con terreno sierico ridotto Lf3K</tr><tr><td>OptiMEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Terreno sierologico ridotto per trasfezione</td></tr> <tr><td>(+)-L-ascorbato di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Ascorbato di sodio</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albumina, siero bovino, frazione V, metalli pesanti bassi</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Metanolo (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Concentrato HCl</td></tr><tr><td>Celeterazina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>CZ2.5</td><td>Substrato di luciferasi</td></tr><tr><td>Filtro per siringa, sterile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Filtro sterile, PVDF, 0,22 e micro; </td></tr><tr><td>Pipetta multifunzione Pipet-Lite L12-200XLS+</td><td>Pipetta</td><td>multicanale</td><td>Rainin 17013810</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td><td>Pipetta</td><td>multicanale</td><td>Rainin 17013808</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td><td>Pipetta multicanale</td><td></td> <td>Rainin 17013807</td></tr><tr><td>Serbatoio reagente</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Trogolo per reagenti</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>Provette da 15 mL</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Provette da 50 mL</td></tr><tr><td>Spark Lettore di micropiastre Tecan</td><td></td><td>N/A</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td>Microsoft 2016 per Mac</td><td>Software per fogli di calcolo</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v7</td><td>Software per l'analisi dei dati scientifici</td></tr></tbody></table>

un'analisi di luciferase high-throughput per valutare la proteolisi di pcsk9 la proteasi singolo-fatturato

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proteina convertasi subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) è una proteasi di singolo-fatturato che regola i livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL) del siero e, di conseguenza, la malattia cardiovascolare. Anche se PCSK9 proteolisi sono richiesto per il suo effetto completo ipercolesterolemico, la valutazione della sua funzione proteolitica è impegnativa: PCSK9 è noto solo per fendere se stesso, subisce solo un singolo fatturato e dopo proteolisi, conserva il suo substrato in suo sito attivo come inibitore di auto. I metodi presentati qui descrivono un'analisi che supera queste sfide. L'analisi si concentra sulla proteolisi intermolecolari in un contesto di basati su cellule e avvenuta scissione collegamenti per l'attività luciferasica secrete, che possono essere facilmente lette nel medium condizionato. Via passaggi sequenziali di mutagenesi, trasfezione transiente e una lettura di luciferasi, il dosaggio può sondare PCSK9 proteolisi in condizioni di perturbazione o genetici o molecolari in un modo ad alta velocità. Questo sistema è adatto per entrambi la valutazione biochimica di missenso clinicamente scoperto polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), anche per quanto riguarda lo screening di piccole molecole inibitori di PCSK9 proteolisi.

Il saggio di proteolisi di alto-rendimento si basa su superare tre grandi sfide. In primo luogo, per superare l'uscita intrinsecamente bassa di una proteasi PCSK9 singolo-fatturato, una proteasi di PCSK9 manca l'inibitoria propeptide è utilizzato, con la sequenza di clivaggio Tail il propeptide collegata a una luciferasi che possono essere secrete14. In secondo luogo, per soddisfare la necessità per la proteasi piegare complesso con suoi inibitori propeptide, che d...

Questo protocollo presenta un metodo per valutare l'attività proteolitica di una proteasi fatturato intrinsecamente bassa attività, unico in un contesto cellulare. In particolare, questo metodo viene applicato per valutare l'attività proteolitica di PCSK9, un driver chiave del metabolismo lipidico cui attività proteolitica è richiesto per la sua funzione ipercolesterolemici ultimate.

Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica PCSK9, come ad esempio quali farmaci o cambiamenti genetici influenzano la funzione proteolitica di PCSK9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una lettura rapida e amplificabile di un evento biochimico intrinsecamente a bassa frequenza. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla cardiopatia aterosclerotica perché la funzione proteolitica di PCSK9 è necessaria per il suo effetto finale sui livelli sierici di colesterolo.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su PCSK9 stesso, può essere applicato anche ad altri sistemi biochimici come altre proteasi con attività proteolitica intrinsecamente bassa. Per iniziare, aspirare il terreno da ciascuna cellula T HEK293. Lavare con PBS e trattare con il volume minimo di 0,5% di tripsina-EDTA.E incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti per dissociare le cellule dal pallone genitore. Aggiungere due volumi di DMEM integrati con il 10% di FBS per inattivare la tripsina-EDTA. Quindi pipettare più volte il liquido nel pallone, rimuovendo le cellule aderenti e trasferendo le cellule in una provetta sterile.Quindi, rimuovi

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Un'analisi di Luciferase High-Throughput per valutare la proteolisi di PCSK9 la proteasi singolo-fatturato

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