Name: Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Impara a generare mutanti di delezione in Escherichia coli mediante trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici. Questo metodo rapido e affidabile facilita lo studio delle funzioni geniche.

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Ceppi di Keio collezione sono stati ottenuti dal progetto nazionale BioResource (NIG, Giappone): e. coli. Ringraziamo Dirk Linke (dipartimento di scienze biologiche, Università di Oslo) per il suo continuo sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca della Norvegia Young Researcher grant 249793 (per Jack C. Leo).

1. ceppi e plasmidi
<ol><li>
Ceppi batterici
	<ol>
<li>Utilizzare l'e. coli ceppi BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21 (DE3)20e BL21ΔABCF21. Per ulteriori informazioni, vedere Tabella materiali .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Batteriofagi
	<ol>
<li>Utilizzare il fago P1vir per la trasduzione generale. Memorizzare il fago come un brodo liquido con poche gocce di cloroformio (Vedi punto 2.2). Per ulteriori informazioni, vedere Tabella materiali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmidi
	<ol>
<li>Utilizzare i plasmidi seguenti in questo protocollo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Come plasmidi di controllo, utilizzare pASK-IBA2 e pET22b (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condizioni di crescita
	<ol>
<li>Propagare i batteri in Lisogenesi brodo (LB) medio25 con agitazione vigorosa (180 – 200 giri/min) a 37 ° C o 30 ° C nel caso di BL21ΔABCF e pCP20 dei ceppi.</li>
		<li>Eseguire il plasmide indurimento a 43 ° C.</li>
		<li>Per un mezzo solido, supplemento LB con agar 1% (p/v).</li>
		<li>Per top agar, supplemento LB con 0,7% agar e 10 mM CaCl2 ed autoclave il mezzo. Utilizzo medio SOC per il recupero dopo l'elettroporazione26.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti concentrazioni di antibiotici: 100 μg/mL per Amp e 25 μg/mL per kan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparare un fago lisato
<ol><li>
Infezione del ceppo donatore
	<ol>
<li>Crescere il ceppo donatore JW4197 in 5 mL di LB medium supplementato con 10 mM di CaCl2 e, facoltativamente, con Kan (25 µ g/mL) di densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1.0. Misurare il valore di600 OD utilizzando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Fare una serie di diluizioni di uno stock di fago P1 esistente nel medio LB: consigliato diluizioni sono tra 10-3 a 10-7.</li>
		<li>Mix 200 μL della sospensione batterica e 100 μL di una diluizione dei fagi dato in una provetta da centrifuga da 15 mL o equivalente. Preparare le provette come molti come diluizioni dei fagi. Incubare le provette per 20 min a 37 ° C senza agitazione.</li>
		<li>Aggiungere circa 3 mL di agar superiore fusa (~ 50 ° C) completati con 10 mM di CaCl2 ai tubi, mescolare il contenuto accuratamente nel Vortex le provette poco e versare le miscele sulle piastre LB preriscaldate a fare strati anche.</li>
		<li>Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del lysate
	<ol>
<li>Il giorno seguente scegliere un piatto con un semi-confluente crescita delle placche dei fagi. Su una piastra semi-confluente, circa metà della superficie della piastra è chiara (Figura 3).</li>
		<li>Raschiare lo strato di agar superiore da tale piastra utilizzando un ciclo di inoculazione o uno strumento simile e posizionare l'agar superiore in una provetta da centrifuga. Aggiungere 1 – 2 mL di LB e una goccia di cloroformio e vortexare la provetta vigorosamente per ~ 1 min. Aggiungi il cloroformio in una cappa aspirante.</li>
		<li>Centrifugare la provetta per 15 min a 4.000 x g o più veloce per agglomerare le cellule batteriche e agar.</li>
		<li>Spostare il surnatante in una microcentrifuga fresca, evitando di trasportare più di eventuali detriti dal pellet. Aggiungere 2 gocce di cloroformio e memorizzare il lisato 4 – 10 ° c. Aggiungere cloroformio in una cappa aspirante. Non congelare il fago lisato come questo si tradurrà in una riduzione significativa del numero di particelle infettive.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare il titolo lisato
	<ol>
<li>Crescere BW25113 in LB completati con 10 mM di CaCl2 a 37 ° C fino a quando la cultura raggiunge un OD600 di ~ 1.0.</li>
		<li>Preparare una serie di diluizioni del fago lisato in LB (ad es., 10-6-10-9). Nota: Fare attenzione a dispensare il campione dalla parte superiore del lisato per evitare di trasferire il cloroformio per le diluizioni.</li>
		<li>Mix 200 μL della sospensione batterica e 100 μL di una diluizione dei fagi dato in una provetta da centrifuga da 15 mL o equivalente. Preparare le provette come molti come diluizioni dei fagi. Incubare le provette per 20 min a 37 ° C senza agitazione.</li>
		<li>Aggiungere circa 3 mL di agar superiore fusa (~ 50 ° C) completati con 10 mM di CaCl2 ai tubi, mescolare il contenuto accuratamente nel Vortex le provette poco e versare il composto su piatti preriscaldati della libbra a fare strati anche.</li>
		<li>Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.</li>
		<li>Il giorno seguente contare il numero delle placche (regioni libere nella stuoia batterica) per ogni piatto e calcolare il titolo del lisato utilizzando la seguente formula: <img alt="Formula del titolo virale: Titolo (pfu/mL) = Σplacche/Σdiluizioni × fattore di placcatura." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Esempio: Su piastre con le diluizioni 10-7, 10-8e 10-9, ci sono 231, 27 e 2 placche, rispettivamente. Come 100 μL di ogni diluizione è stato usato per l'infezione, e perché il titolo è espresso come diformazione unità (pfu) / mL, il fattore di placcatura è 10. Questi numeri vengono inseriti nella formula: <img alt="Calcolo del titolo virale mediante unità formanti placche (pfu), formula, grafico di analisi dei dati virologici." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> Così, il titolo è di circa 2 x 1010 infettiva dei fagi particelle/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 trasduzione
<ol><li>
Preparare le cellule recettive
	<ol>
<li>Crescere il destinatario ceppo BL21ΔABCF in LB completati a densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1.0. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare il valore di600 OD.</li>
		<li>Calcolare il volume del fago lisato necessario per raggiungere una molteplicità di valore di infezione (MOI) pari a 0,5. Per calcolare il MOI, stimare il numero di batteri basata sulla OD600 della cultura. Si supponga che un valore di600 OD di 1.0 corrisponde a ~ 109 cfu/mL. Calcolare il volume richiesto basato sul noto titolo del lisato. Esempio (basato sul titolo calcolato nell'esempio dopo passo 2.3.6): <img alt="Formula di calcolo del titolo dei fagi V=(numero di fagi)/(titolo di lisato) con conversione in μL." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
		<li>Aggiungere CaCl2 alla cultura destinatario ceppo a 10 mM e mescolare. Prelevare 1 mL della cultura per la trasduzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esecuzione di trasduzione
	<ol>
<li>Aggiungere il volume appropriato di lisato dei fagi a 1 mL di coltura destinatario (compreso CaCl2 a 10 mM) calcolata al punto 3.1.2 e mescolare delicatamente. Nota: Fare attenzione a dispensare il campione dalla parte superiore del lisato per evitare di trasferire cloroformio al mix.</li>
		<li>Incubare in modo statico il mix per 20 min a 37 ° C.</li>
		<li>Fermare l'infezione con l'aggiunta di citrato di sodio, pH 5.5, a 100 mM.</li>
		<li>Centrifugare i batteri (5.000 x g per 2 min) e rimuovere il supernatante, quindi li risospendere in 1 mL di LB fresco completati con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte più come descritto al punto 3.2.4 per garantire la rimozione di fagi gratis e di calcio.</li>
		<li>Risospendere i batteri in 1 mL di LB fresco completati con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5. Incubare i batteri a 30 ° C per 1 h con agitazione (&gt; 100 giri/min).</li>
		<li>Raccogliere i batteri mediante centrifugazione (5.000 x g per 2 min) e li risospendere in ~ 100 μL di LB con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5.</li>
		<li>Diffondere i batteri su una piastra di LB completati con Kan 25 µ g/mL e citrato di sodio di 10 mM, pH 5.5 e crescere i batteri a 30 ° C fino a quando le colonie apparire (~ 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezionando il transductants
	<ol>
<li>Una volta colonie cresciute sulla piastra di selezione, li restreak su LB + Kan per singole colonie e crescono a 30 ° C fino a singole colonie appaiono.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. asportare la cassetta Kan
<ol><li>
La trasformazione con il plasmide di ricombinazione
	<ol>
<li>Rendere il electrocompetent del ceppo di BL21ΔABCF Kan-resistente.<ol>
<li>Crescere il ceppo da una singola Colonia in fresco LB (5 mL) completati con Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C fino a quando il OD600 è ~0.5 – 0,7.</li>
			<li>Da qui, procedere nel modo seguente a 4 ° C o su ghiaccio. Centrifugare i batteri (5.000 x g per 10 min) e rimuovere il surnatante.</li>
			<li>Lavare il pellet cellulare con gelida acqua distillata due volte ripetendo il passaggio precedente di centrifugazione e, infine, risospendere le cellule in 100 µ l di gelida glicerolo al 10%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raffreddare le provette di elettroporazione di 1 mm sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 1 pg del plasmide DNA (pCP20) per la sospensione di eritrociti, mescolare delicatamente la sospensione e trasferirlo in una provetta di elettroporazione raffreddato.</li>
		<li>Impostare il electroporator a 1,8 kV ed electroporate le cellule.</li>
		<li>Salvataggio di cellule trasformate aggiungendo 1 mL di terreno SOC e coltivarle per 1 h a 30 ° C.</li>
		<li>Piastra di 100 µ l di cellule su LB + Amp piastre e crescere le cellule a 30 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzione della ricombinazione
	<ol>
<li>Pick singole colonie dal LB + Amp piastra e inoculare LB fresco omettendo tutti gli antibiotici.</li>
		<li>Crescere le cellule alla temperatura non permissivi (43 ° C) durante la notte per indurre l'espressione della ricombinasi FLP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezionando ricombinanti
	<ol>
<li>Effettuare diluizioni seriali e piastra 50 µ l di una diluizione di6 105-10 su piastre non selettivi e crescere in una notte a 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Verifica della delezione genica
<ol><li>
Verifica della perdita del plasmide e ricombinazione di successo
	<ol>
<li>Colonie di singola striscia da piastre preparate al punto 4.3.1 su Kan, LB, LB + Amp e piatti della libbra senza antibiotici, in questo ordine. Per facilitare le striature, utilizzare una griglia di Colonia (vedere complementare File 1). Crescere le piastre a 30 ° C fino a quando le colonie apparire (~ 24 h).</li>
		<li>Prendere 10 – 20 cloni che hanno cresciuto sulla piastra non selettiva, ma non è riuscito a crescere su terreni selettivi per ulteriori verifiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verifica aggiuntiva di PCR della Colonia
	<ol>
<li>Eseguire una colonia PCR con primer che fiancheggiano il tamA sequenza di codificazione (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Preparare un mix PCR master. La quantità di miscela necessaria dipende dal numero delle colonie da testare (vedere l'esempio in tabella 1). Mescolare i reagenti sul ghiaccio, aggiungere la polimerasi Ultima.</li>
		<li>Mescolare accuratamente il PCR master mix, quindi dispensare 20 µ l in tubi di una striscia PCR. Prendere una piccola quantità di ogni Colonia sarà proiettato utilizzando una pipetta sterile e aggiungerlo ad un tubo. Ricordati di includere il ceppo originario di destinatario per il confronto. Facoltativamente, includono anche il ceppo di donatore.</li>
		<li>Eseguire una reazione di PCR (Vedi tabella 2 per il programma utilizzato).</li>
		<li>Preparare un gel di agarosio all'1%.<ol>
<li>Per un gel 50 mL, 0,5 g di agarosio di misurare e aggiungere 50 mL di tampone TAE (40 mM Tris, acido acetico 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Riscaldare la miscela in un forno a microonde fino a sciolta tutti i agarosio.</li>
			<li>Una volta che ha dissolto l'agarosio, raffreddare la soluzione a circa 50 ° C e quindi aggiungere 5 μL di DNA che macchia di tintura. Mescolare bene la soluzione e versarlo in un vassoio di gel in una camera di fusione. Inserire una o più righe di pettini bene in modo che ci sono pozzi sufficiente per tutti i campioni, così come marcatori di dimensioni molecolari. Lasciare che il gel da impostare per 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una volta che viene completata l'esecuzione PCR, aggiungere 4 µ l di 6 x tintura di caricamento del DNA di ciascun campione. Mettere il gel nella camera di elettroforesi e aggiungere tampone TAE finche ' i pozzi sono coperti.</li>
		<li>Applicare 10 – 15 µ l da ogni reazione di PCR ad un pozzo nel gel. Anche aggiungere 5 µ l di marcatore molecolare. Quindi, eseguire il gel per 30 min a 75 V.</li>
		<li>Una volta che viene completata l'esecuzione, l'immagine del gel usando un imager di luce blu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. altre tecniche
<ol><li>
Espressione della proteina Nota: L'espressione delle proteine di prova (YadA ed EibD) è stato descritto dettagliatamente altrove23,24. Si tratta di un breve riassunto delle principali operazioni.<ol>
<li>Trasformare BL21ΔABCF ΔtamA with i plasmidi necessari (pIBA2-bla e pEibD10 e i corrispondente plasmidi di controllo) e selezionare per trasformanti su LB + Amp.</li>
		<li>Per l'espressione della proteina, inoculare 100 mL di LB medium + Amp con 1 mL di una coltura durante la notte di batteri trasformati e crescere questi a 30 ° C fino al medio-registro fase, momento in cui, inducono la produzione di proteine con entrambi anidrotetraciclina (a 100 ng/mL) o isopropilico thiogalactoside (a 0,5 mM).</li>
		<li>Dopo 2 h di induzione a 30 ° C, misurare la torbidità delle culture e raccogliere un numero di celle corrispondenti a 50 mL al OD600 = 1.0 mediante centrifugazione le culture per 15 min a 4.000 x g. Lavare la pallina 1x con 10 mM HEPES, pH 7.4 e quindi sia conservare a-20 ° C o processo esso più ulteriormente come descritto al punto 6.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estrazione della membrana esterna Nota: L'estrazione della membrana esterna è effettuata come descritto in dettaglio da Leo et al. 27. i passi principali sono riassunte di seguito.<ol>
<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 10 mM HEPES, pH 7.4, completati con 10mm MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e un pizzico di dnasi I.</li>
		<li>Lisare le cellule (per esempio, utilizzando un battitore di tallone).</li>
		<li>Centrifugare le cellule poco (2 min a 15.600 x g) per rimuovere i detriti cellulari e spostare il surnatante in una nuova provetta.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 30 min a 16.000 x g, dopo di che, risospendere il pellet in 400 μL di 1% N-lauroyl sarcosine in 10 mM HEPES, pH 7,4.</li>
		<li>Incubare le cellule con agitazione per 30 min a temperatura ambiente, dopo di che, li Centrifugare per 30 min come sopra.</li>
		<li>Lavare il traslucido a pellet 1x con 200 μL di 10 mM HEPES, pH 7.4 e quindi esso risospenda in 30 μL di 10 mM HEPES e aggiunga 10 μL di tampone di SDS-PAGE: 4x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di attività Nota: Eseguire analisi SDS-PAGE e di attività per YadA ed EibD come descritto28. I passaggi principali sono riassunte di seguito.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Riscaldare i campioni a 50 ° C per 5 min prima di caricarle su un gel di poliacrilammide, per evitare di denaturare le proteine.</li>
		<li>Dopo la separazione in SDS-PAGE, è possibile trasferire le proteine ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF).</li>
		<li>Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con latte scremato in polvere 2% in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchia occidentale lontano YadA-collagene
	<ol>
<li>Dopo il blocco, aggiungere il tipo di collagene bovino che diluito in tampone bloccante a una concentrazione di 10 μg/mL e incubare la membrana per 1 h.</li>
		<li>Lavare la membrana 2 x con PBS + 0.05% Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo primario (monoclonale anti-collagene COL-1) alla membrana, 1:2,000 diluito in tampone bloccante.</li>
		<li>Dopo incubazione la membrana per 1 h, lavare 2x come indicato al punto 6.3.2.2 e quindi aggiungere l'anticorpo secondario [coniugato con perossidasi (HRP) di capra anti-topo IgG-rafano], diluito 1: 10.000 in tampone bloccante.</li>
		<li>Incubare la membrana per 1 h, poi lavarlo 2 volte con PBS-T. Aggiungere un substrato chemiluminescente avanzato alla membrana secondo le istruzioni del produttore e rilevare la band utilizzando una telecamera CCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG analisi obbligatoria
	<ol>
<li>Dopo il blocco, aggiungere un anticorpo secondario (capra anti-coniglio HRP), diluito 1:2,000 in tampone bloccante.</li>
		<li>Incubare la membrana per 1 h, poi lavarlo 2 volte con PBS. Eseguire la rilevazione chemiluminescente come indicato al punto 6.3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La trasduzione P1 è un metodo veloce, robusto e affidabile per la generazione di delezioni del gene dentro e. coli. Questo è dimostrato qui di trasdurre un mutante di delezione di tamA da un ceppo di donatore Keio a un destinatario BL21-derivato. Le principali fasi del processo di trasduzione sono la produzione della trasduzione lisata, trasduzione del sé, l'asportazione della cassetta Kan resistenza e per la verifica di knock-out mediante PCR. In totale, il processo richiede circa 1 settimana e non ric...

Un primo approccio comune per studiare la funzione di un gene è quello di eseguire la mutagenesi di knock-out e osservare il fenotipo risultante. Questo è definito anche genetica inversa. Il batterio e. coli è stato il cavallo di battaglia della biologia molecolare negli ultimi 70 anni o così, a causa della facilità della sua coltura e la sua disponibilità a manipolazione genetica1. Sono stati sviluppati diversi metodi per produrre le eliminazioni genica in Escherichia coli, compreso indicatore cambio mutagenesi2,3 e, più recentemente, recombineering utilizzando il λ rosso o Rac ET sistemi4,5 , 6.
In un sistema ampiamente usato, sequenze di codificazione dei geni individuali vengono sostituiti da una cassetta di resistenza agli antibiotici che possa successivamente essere asportata dal cromosoma5,7. Le sequenze di codificazione sono sostituite, per esempio da una cassetta di resistenza alla kanamicina (Kan), fiancheggiata da siti di destinazione (FRT) riconoscimento flippase (FLP) su entrambi i lati. I siti FRT sono riconosciuti dalla ricombinasi FLP, che media site-specific di ricombinazione tra i siti FRT che conduce all'eliminazione della cassetta Kan. In questo modo, è possibile una cancellazione completa della sequenza codificante di un dato gene, lasciando dietro di sé solo una sequenza di cicatrice minima di circa 100 coppie di basi (bp) (Figura 1).
Poco più di un decennio fa, è stata sviluppata il cosiddetta collezione di Keio. Si tratta di una libreria batterica basata su un ceppo di e. coli K12, standard di laboratorio dove quasi tutti i geni non essenziali sono stati eliminati singolarmente da λ ricombinazione rosso7,8. I cloni all'interno della raccolta ogni hanno una sequenza di codificazione sostituito con una cassetta di resistenza Kan soggetti ad accisa. La collezione di Keio ha dimostrato di essere uno strumento utile per molte applicazioni9. Una tale applicazione è la produzione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . La cassetta di Kan da un clone di eliminazione specificato possa essere mobilitata da generalmente transducing batteriofagi, ad esempio P110,11,12,13,14. Un brodo di fago preparato da una simile tensione quindi può essere utilizzato per infettare un destinatario Escherichia coli ceppo di interesse, dove ad una frequenza bassa ma affidabile il Kan regione contenente cassette possa essere incorporate nel genoma del destinatario tramite la ricombinazione omologa (Figura 2). Transductants possono essere selezionati per la crescita sul supporto di Kan-contenente. In seguito, se si desidera la rimozione della cassetta di resistenza agli antibiotici, la ricombinasi FLP possono essere forniti al ceppo transductant in trans. Dopo l'indurimento il plasmide contenente FLP, che trasporta un marcatore di resistenza all'ampicillina (Amp), Kan e Amp-sensibile cloni sono schermati per, e la corretta asportazione del selvaggio-tipo sequenza di codificazione e la cassetta di Kan sono verificate mediante PCR della Colonia.
Qui, un protocollo dettagliato è presentato, che descrive tutti i passaggi nella produzione di un knock-out ceppo di e. coli sulla base della strategia descritta sopra. Ad esempio, è dimostrata un'omissione del gene di tamA . tamA codifica per una proteina del β-barilotto di membrana esterna che è una parte del trasporto e montaggio modulo (TAM), che è coinvolto nella biogenesi di determinate proteine autotransporter e pili15,16,17. Questo ceppo di knock-out è stato poi utilizzato per esaminare l'effetto dell'eliminazione tamA sulla biogenesi di due trimerico autotransporter adesine (TAA), l'adesina di Yersinia YadA e l'immunoglobulina (Ig) di Escherichia coli -associazione TAA EibD 18,19.

<table><tbody><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Ceppo wild-type di Keio collection</td></tr><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Ceppo di espressione</td></tr><tr><td>E. coli BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derivato da BL21(DE3</td></tr><tr><td>)E. coli JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>tamA mutante di delezione</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Batteriofago generalmente trasduttore</td></tr><tr><td><forte>Plasmidi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>plasmide a replicazione condizionale con FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>vettore di espressione</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>per la produzione di EibD; plasmide disponibile su richiesta</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>vettore di espressione</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>per la produzione di YadA; plasmide disponibile su richiesta</td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>aceticoThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anidrotetraciclina</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagene di tipo I anticorpo COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Collagene bovino di tipo I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato di sodio</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>Colorante DNA</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore dimensionale molecolare</td><td>del DNA New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrato</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil tiogalattoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N- lauroil sarcosina</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA primer in avanti</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA primer inverso</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequenza 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</ camera per</td> elettroforesi su gel >di agarosio <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Battitore di perline</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CCD</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di incubazione</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Hanna</td><td>Instruments HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Camera di elettroforesi SDS-PAG</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Unità di trasferimento a umido</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di delezioni del gene in escherichia coli di trasduzione p1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Un primo approccio per studiare la funzione di un gene sconosciuto nei batteri è quello di creare un knock-out di questo gene. Qui, descriviamo un protocollo robusto e veloce per trasferire le mutazioni di omissione del gene da un ceppo di Escherichia coli a altro mediante trasduzione generalizzata con il batteriofago P1. Questo metodo richiede che la mutazione sia selezionabile (ad es., basato su interruzioni di gene usando gli inserimenti cassetta antibiotico). Tali cassette antibiotici possono essere mobilitate da un ceppo di donatore e introdotto in un ceppo destinatario di interesse per rapidamente e facilmente generano un mutante di delezione del gene. La cassetta di antibiotica può essere progettata per includere siti di riconoscimento flippase che consentono l'asportazione della cassetta da una ricombinasi site-specific per produrre un knock-out pulito con solo una sequenza di ~ 100-base-coppia-lunga cicatrice nel genoma. Dimostriamo il protocollo battendo fuori il tamA gene codifica per un fattore di assemblaggio coinvolto nella biogenesi autotransporter e testare l'effetto di questo knock-out sulla biogenesi e funzione di due trimerico autotransporter adesine. Sebbene l'omissione del gene di trasduzione P1 ha i suoi limiti, la facilità e la velocità della sua attuazione rendono una valida alternativa ad altri metodi di omissione del gene.

Generazione di un tamA Knock-out di BL21ΔABCF:
La strategia delineata sopra è stata utilizzata in precedenza per produrre un ceppo derivato di BL21 (DE3), un ceppo di laboratorio standard utilizzato per la produzione di proteine, che è ottimizzata per la produzione di proteine di membrana esterna e denominata BL21ΔABCF21. Questo ceppo non dispone di quattro geni che codificano per proteine della mem...

Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Questo metodo è utile nel campo della microbiologia, come la scoperta delle funzioni di geni specifici. Il vantaggio principale di questo metodo è che è un modo rapido e affidabile per generare mutanti knockout di E.Coli. A dimostrare questa procedura sarà Thomas Trunk, uno studente laureato del mio laboratorio.Per infettare un ceppo donatore contenente una delezione genica basata su una cassetta antibiotica esportabile, in primo luogo, far crescere i batteri in cinque millilitri di brodo di lisogeno, o LB, con dieci millimolari di cloruro di calcio e, facoltativamente, con 25 microgrammi per millilitro di kanamicina, a una densità ottica a 600 nanometri di circa 1,0. Effettuare una serie di diluizioni di un ceppo di fagi P1 esistente nel terreno LB e mescolare 200 microlitri della sospensione batterica con 100 microlitri per ogni diluizione del fago in singole provette da centrifuga da 15 millilitri. Incubare le provette staticamente per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, aggiungere alle provette circa tre millilitri di agar superiore fuso, integrato con dieci millimolari di cloruro di calcio. Mescolare il contenuto a vortice e versare le miscele su piastre LB preriscaldate per ottenere strati uniformi. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius.La mattina successiva, selezionare una piastra con una crescita semi-confluente di placche fagiche e utilizzare un anello di inoculazione per raschiare lo strato superiore di agar in una provetta da centrifuga. Sotto la cappa aspirante, aggiungere uno o due millilitri di LB e una goccia di cloroformio al tubo e agitare energicamente il tubo per un minuto. Pellettare l'agar e le cellule batteriche mediante centrifugazione e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga, evitando la formazione di detriti dal pellet.Quindi, aggiungi due gocce di cloroformio e conserva il lisato a una temperatura compresa tra quattro e dieci gradi Celsius. Per la trasduzione P1, far crescere il ceppo ricevente in LB a una densità ottica di uno a 600 nanometri e aggiungere cloruro di calcio alla coltura del ceppo ricevente a dieci millimolari con miscelazione. Successivamente, aggiungere il volume appropriato di lisato di fagi dalla parte superiore del campione per evitare di trasferire il cloroformio a un millilitro di coltura ricevente per ottenere una molteplicità di infezione di 0,5 e incubare staticamente la miscela per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, fermare l'infezione aggiungendo citrato di sodio a 100 millimoli per litro e centrifugare i batteri trasdotti. L'aggiunta di citrato di sodio dopo la trasduzione è un passaggio essenziale in quanto previene ulteriori infezioni da parte di fagi batterici di tipo selvatico. Risospendere il pellet in un millilitro di LB fresco integrato con 100 millimolari di citrato di sodio e lavare le cellule altre due volte per garantire la rimozione dei fagi liberi e del calcio.Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i batteri in un millilitro di LB fresco, integrato con 100 millimolari di citrato di sodio. per un'incubazione di un'ora a 30 gradi Celsius a 100 giri/min. Al termine dell'incubazione, raccogliere i batteri per centrifugazione e risospendere il pellet in circa 100 microlitri di LB integrati con 100 millimolari di citrato di sodio.Quindi, distribuire i batteri su una piastra LB integrata con 25 microgrammi per millilitro di kanamicina e dieci millimolari di citrato di sodio e far crescere i batteri a 30 gradi Celsius fino alla comparsa delle colonie. Per selezionare i trasduttori, rimettere le colonie su nuove piastre LB più kanamicina per la crescita di singole colonie a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di singole colonie. Per asportare la cassetta di kanamicina, rendere elettrocompetente il ceppo ricevente resistente alla kanamicina.Aggiungere un picogrammo del DNA plasmatico pCP20 codificante per la ricombinasi alla sospensione cellulare. Mescolare delicatamente la sospensione e trasferirla in una cuvetta per elettroporazione raffreddata da un millimetro. Impostare l'elettroporatore a 1,8 kilovolt per l'elettroporazione delle celle e salvare le celle trasformate con un millilitro di terreno SOC per un'ora a 30 gradi Celsius.Quindi, piastra 100 microlitri di cellule su piastre LB più ampicillina per la coltura notturna a 30 gradi Celsius. La mattina successiva, raccogliere singole colonie per l'inoculazione in LB fresco senza antibiotici e far crescere le cellule durante la notte alla temperatura non permissiva di 43 gradi Celsius per indurre l'espressione della flippasi ricombinasi. Quindi, piastra diluizioni seriali da 50 microlitri su piastre non selettive per la coltura notturna a 30 gradi Celsius ed esegue lo screening dei cloni che hanno perso la cassetta di resistenza agli antibiotici.Dopo la trasduzione di P1 e l'escissione su cassetta della kanamicina, come appena dimostrato, è possibile ottenere diversi cloni sensibili sia all'ampicillina che alla kanamicina, e la delezione del gene tamA all'interno dei cloni può essere verificata mediante PCR di colonia. Dopo aver indotto la produzione di proteine, le frazioni di membrana esterna delle colture di espressione possono essere isolate e analizzate mediante SDS-PAGE. Non sono state osservate differenze importanti tra i livelli di espressione nei ceppi parentali e nei ceppi riceventi di tamA, sebbene YadA sembri essere prodotto a livelli leggermente inferiori nel ceppo knockout.L'opposto sembra essere vero per l'EibD. Per esaminare se la mancanza di tamA possa influenzare il corretto ripiegamento o trasporto delle proteine, la capacità delle proteine di legarsi ai ligani può essere testata mediante un far-western blot di collagene. In questo esperimento rappresentativo, il collagene legato a YadA è stato rilevato a un livello simile sia nel ceppo genitore che in quello knockout, dimostrando che la proteina è correttamente ripiegata e funzionale.Allo stesso modo, le attività di legame delle IgG di EibD nei due ceppi sono correlate con l'espressione della proteina, dimostrando che la delezione di tamA non ha un effetto significativo sulla biogenesi dell'adesina dell'autotrasportatore trimerico. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una buona tecnica asettica e di ricordare di far crescere i batteri contenenti pCP20 a 30 gradi o meno. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come lavorare in una cappa aspirante e garantire la protezione personale indossando guanti resistenti agli agenti chimici e un camice da laboratorio.

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Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici...

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

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Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa (Video) | JoVE Journal

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

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