Name: Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri come generare sistemi di trascrizione binari tessuto-specifici in Drosophila utilizzando CRISPR/Cas9. Questo metodo sostituisce il primo esone codificante con driver di trascrizione per controllare l'espressione genica spaziotemporale.

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Ringraziamo il Dr. F. porta, Dr. K. o ' Connor-Giles e Dr. S. Feng per discussioni sulla strategia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg e il centro di Stock di Bloomington per reagenti; Funzione di imaging UMD; e finanziamenti da NIH: R00HL114867 e R35GM124878 a SR.

1. progettare e costruire il gRNA vettore di espressione
<ol><li>Per appunto sostituire una regione lungo definita di un esone, utilizzare una gRNA doppio approccio6, in cui ogni gRNA puoi indirizzare specificamente due estremità dell'area di interesse selezionata. Per ottenere un'accurata espressione spatiotemporal gene-specifico del driver, selezionare due siti di destinazione gRNA entro il primo esone codifica del gene.</li>
	<li>
Per Drosophila melanogaster, selezionare i siti di destinazione gRNA utilizzando lo strumento ottimale Target Finder flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Altri strumenti di progettazione CRISPR disponibile possono essere utilizzati anche, tra cui lo strumento ottimizzato CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) ed E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP). Nota: I seguenti protocolli di gRNA design e clonazione è stata adottata da metodi precedentemente descritti6,7.<ol>
<li>Copiare la sequenza effettiva nella casella fornita nello strumento online. Selezionare la più recente pubblicazione Drosophila melanogaster genoma annotazione versione, "r_6," nel menu a discesa per "Select genoma." La "Guida selezionare lunghezza del campo (nt)," l'input "20". Selezionare questa opzione per trovare "Tutti CRISPR obiettivi" e fare clic su "Trova CRISPR obiettivi".</li>
		<li>Valutare tutti i bersagli di gRNA candidato impostando "Massimo" per "Rigore" e "NGG solo" per "PAM". Provare a selezionare i siti di gRNA senza qualsiasi potenziale off-target o un numero minimo di possibili off-target. Utilizzare lo strumento di web descritto in Doench et al 2014 8 per selezionare gRNAs con un punteggio di "buona" attività potenziali.</li>
		<li>Contemporaneamente, assicurarsi che non ci sia nessun polimorfismo a singolo nucleotide negli obiettivi gRNA nel genoma della linea fly padre selezionato per iniezione (Ad es., nos-Cas9 sul cromosoma X, BL # 54591). Seguire il protocollo descritto in Gratz et al 20157 per estrarre il DNA genomico dalla linea di volo del padre. PCR amplificano, circa, 500 – 1.000 nt regioni utilizzando primers che fiancheggiano la sequenza di interesse e una polimerasi del DNA ad alta fedeltà; sequenza-verificare i prodotti PCR amplificati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per la generazione di un vettore di espressione gRNA tandem, seguire un protocollo clonazione legatura-indipendente6 per introdurre due sequenze di protospacer in un vettore di espressione di RNA pCFD4. Si noti che un vettore di espressione migliorata multi-gRNA (pCFD5) è ora disponibile, dove entrambi i sgRNAs sono espressi dal forte U6:3 promotori9 (https://www.crisprflydesign.org). Utilizzare un metodo di assemblaggio di DNA per clonare il gRNAs nel vettore pCFD4.
	<ol>
<li>Progettare e ordinare i primer forward e reverse per introdurre due sequenze di protospacer la pCFD4 di vettore di espressione RNA (tabella 1A). Come descritto in precedenza6, il primer forward contiene la prima sequenza di protospacer fiancheggiata da regioni corrispondenti per il promotore U6-1 e gRNA core in pCFD4; il primer reverse contiene la sequenza inversa complemento del secondo protospacer fiancheggiato da regioni corrispondenti al nucleo gRNA e promotore di U6-3 in pCDF4.</li>
		<li>Risospendere primer a 100 μM con DNasi e RNAsi-libera doppia acqua distillata (ddH2O). Rendere un primer di concentrazione di 10 μM lavoro. Utilizzare pCFD4 plasmide come modello e impostare la reazione di PCR utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e impostazioni consigliate per PCR reazione6.</li>
		<li>Per clonare il prodotto amplificato in pCFD4, digerire pCFD4 plasmide con enzima BbsI impostando la seguente reazione: 2 – 5 μg di pCFD4 plasmide, 5 μL di tampone di digestione 10x, 1 μL di enzima BbsI e ddH2O per portare il volume finale di 50 μL. Mescolare il contenuto di reazione delicatamente toccando il tubo e raccogliendo tutte le goccioline sparse dalla parete del tubo verso il basso da un breve giro. Incubare a 37 ° C per 2 h, la miscela di reazione.</li>
		<li>Eseguire il prodotto PCR dal passaggio 2 e il digestato prodotto dal passaggio 3 su un gel di agarosio 1%. Eseguire l'elettroforesi per un tempo sufficiente separare completamente le bande di DNA. Taglio le corretta dimensioni bande di DNA sotto un trans-illuminatore UV prima di purificare i prodotti attesi utilizzando la colonna di gel di eluizione seguendo le istruzioni del fabbricante (Vedi Tabella materiali). Il prodotto PCR dovrebbe essere 600 bp e il plasmide linearizzato pCFD4 dovrebbe essere ~6.4 kb 6.</li>
		<li>Impostare la reazione di assemblaggio di DNA in un tubo di PCR, per le istruzioni del fabbricante (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Trasformare 2 μL del prodotto Assemblea in batteri competenti (DH5α o ceppi simili con ΔrecA1, ΔendA1), piastra su ampicillina (100 μg/mL) contenente piatti agar della libbra (LB/Amp) e incubare a 37 ° C durante la notte. Si noti che il mix di assemblaggio del DNA potrebbe essere tossico per alcuni ceppi di batteri, ma diluire il mix di assemblaggio può ridurre la tossicità.</li>
		<li>Scegliete 3 – 4 colonie ampicillina-resistente dalla piastra incubate overnight, inoculare la Colonia in 3ml LB contenente 100 ampicillina μg/mL e crescere batteri inoculati in uno shaker di 37 ° C durante la notte. Estrarre il plasmide dai batteri durante la notte-coltivati utilizzando il kit di mini-preparazione del plasmide seguendo le istruzioni del fabbricante (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Sequenza i plasmidi con il primer universale T3 alla schermata per i cloni corretti contenente l'inserimento di gRNA tandem. Stabilire uno stock di glicerolo di batteri trasformato con una sequenza-verificato pCFD4-gRNA in 20% glicerolo e conservare in un congelatore-80 ° C per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. progetta e costruisce il donatore HDR
<ol><li>
Per knock-in genomica di una sequenza Gal4 o LexA , progettare un donatore HDR doppio filamento contenente la sequenza di transactivator fiancheggiata da due braccia di omologia.
	<ol>
<li>Uso > 1,5 kb lasciato e braccia di omologia destra fiancheggiando il gRNA targeting site. Estesa omologia braccia aumentano l'efficienza di HDR durante il processo di riparazione 10.</li>
		<li>PCR amplificano le braccia di omologia dal DNA genomico (gDNA) estratti dalla linea di volo di padre selezionata per iniezione (Ad es., nos-Cas9 (sul cromosoma di X), BL # 54591). Usano un avviamento a caldo bozze Taq DNA polimerasi enzima adatto per lunga estensione di PCR (Vedi Tabella materiali). Sequenza-verificare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per evitare di retargeting di gRNA al locus ingegnerizzati, progettare il donatore di sostituzione in modo che i siti di riconoscimento gRNA sono interrotti dalla sequenza esogena introdotta. Nota: per evitare di alterare gli elementi cis-regolatori putativi, selezionare sempre i siti di riconoscimento gRNA entro la regione di esone codificante.</li>
	<li>
Per la generazione di una cassetta di ricambio, pianificare la strategia di DNA assieme per unire quattro segmenti: il 5' e 3' armi di omologia, la sequenza di DNA centrale transactivator esogeno e la clonazione linearizzato vettore backbone (ad es., pUC19 o altro comunemente usati vettori di clonazione). Indicazioni del produttore per l'assemblaggio di DNA (Vedi tabella materiali), progettare il primer adatto per il montaggio di ogni segmento e l'amplificazione di PCR. Risospendere primer a 100 μM con ddH2O. Make un primer di concentrazione di 10 μM lavoro. Utilizzare della polimerasi ad alta fedeltà per tutte le reazioni di PCR. Seguire il seguente protocollo:
	<ol>
<li>PCR amplificano una cassetta di espressione Gal4 o LexA da un vettore disponibile (per esempio, nls-LexA:p65; i plasmidi di espressione Gal4/LexA/QF2 ideali possono essere trovati e ottenuti da risorse comuni quali Addgene) utilizzando la Primer elencati nella tabella 1B.<ol>
<li>Per mantenere tutti i regolamenti trascrizionali e originali dell'essone sostituito sull'espressione di sequenza del DNA di transactivator, progettare la cassetta in modo che l'allele di genomica modificato esprimerebbe un mRNA chimerico della transactivator ed il gene. Preservare l'estremità 5' e 3' dell'essone mirato a mantenere qualsiasi segnale d'impionbatura.</li>
			<li>Incorporare una sequenza del peptide self-che fende T2A tra il residuo 5' dell'esone e la sequenza di transactivator per impedire la traduzione in una proteina chimerica di codifica. Aggiungere un codone di arresto traduzione dopo la sequenza di transactivator esogena (Figura 5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR amplificano le braccia di omologia dal DNA genomico (gDNA) estratti dalla linea di volo di padre selezionata per iniezione (Ad es., nos-Cas9 (sul cromosoma di X), BL # 54591) utilizzando i primers elencati nella tabella 1B. Utilizzare della polimerasi ad alta fedeltà per tutte le reazioni di PCR usando i sistemi come segue: 5 μL di tampone di reazione, 0,5 μL di dNTPs 10mm, 1.25 μL 10 μm: 5x Forward Primer, 1.25 μL 10 μm Reverse Primer, 0,5 μL di DNA del modello, 0.25 μL di polimerasi del DNA ad alta fedeltà , 16.25 μL di ddH2O.</li>
		<li>Utilizzare il vettore linearizzato clonazione come pUC19. Un numero di vettori di donatore è ora disponibile. Visualizzare un elenco completo presso il seguente sito Web-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.</li>
		<li>Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio 1%. Eseguire l'elettroforesi per un tempo sufficiente a garantire una netta separazione della banda desiderata dalle fasce non specifiche indesiderate (se presente). Gel-purificare i frammenti di DNA previsti. Misurare la concentrazione di ogni frammento di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Impostare la reazione di assemblaggio di DNA seguendo le istruzioni del fabbricante. Mescolare i frammenti di vettore e destinazione clonazione linearizzati dal passaggio 3 e passaggio 4 nella reazione seguente: 1 μL di lineare clonazione vettoriale (50 ng/μL), 2 – 3 volte eccesso di ogni frammento di destinazione, 10 μL di 2 x mix master Assemblea di DNA, portare il volume di reazione finale di 20 μL con ddH < C21 > 2O. Incubare il mix di reazione per 1 ora a 50 ° C.</li>
		<li>2 μL del prodotto Assemblea si trasformano in batteri competenti, piastra su piastre di agar LB/Amp contenente 100 ampicillina μg/mL. Inoltre, aggiungere il X-Gal + IPTG sulla piastra per lo screening blu/bianco.</li>
		<li>Scegliete 3 – 4 colonie bianchi dalla piastra incubate overnight, inoculare la Colonia in 3ml LB contenente 100 ampicillina μg/mL e crescere a 37 ° C durante la notte in uno shaker. Manuale del plasmide estratto dai batteri durante la notte-coltivati utilizzando il kit di mini-prep plasmide seguendo il produttore (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Schermo della Colonia positivo di PCR o restrizione digestione.</li>
		<li>Sequenza di verificare la regione di donatore HDR del plasmide finale. Salvare uno stock batterico trasformato con i cloni corretti in 20% glicerolo a-80 ° C per inoculazione futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. embrione iniezione, Vola genetica e Screening per l'Editing genomico
<ol><li>Preparare l'alta vettore di espressione di purezza gRNA endotossina-libero, come pure il plasmide di donatore HDR utilizzando un plasmide maxiprep kit (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Co-iniettare il plasmide di espressione gRNA (100 ng/μL) e il donatore di sostituzione (500 ng/μL) nella linea germinale di nos-Cas9 embrioni6. Nota: utilizziamo un servizio commerciale per iniezione, ma questa procedura può essere eseguita in laboratorio pure.</li>
	<li>
Volare la genetica e screening (Figura 2 e Figura 3):
	<ol>
<li>Quando gli embrioni iniettati si sviluppano in adulti, attraversare ogni singolo G0 Vola bilanciatore mosche. Selezionare bilanciamento adatto per il cromosoma che contiene l'allele mirato.</li>
		<li>Anestetizzare la F1 prole da ogni G0 attraversare su un pad di CO2 e scegliere casualmente 10-20 maschi sotto un microscopio stereoscopico. Li attraversano individualmente per le femmine di bilanciamento come mostrato nella Figura 3.</li>
		<li>Quando il portello di larve di F2, scegliere il padre single di F1 da ogni croce ed estrarre gDNA utilizzando il singolo volare genomic DNA protocollo di preparazione:<ol>
<li>Preparare il tampone di estrazione gDNA: 10 mM Tris-Cl a pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, conservare a temperatura ambiente. Preparare 20 mg/mL soluzione di riserva di proteinasi K e conservare in freezer.</li>
			<li>Mettere ogni Mosca in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga ed etichettare la provetta. Tenere nel congelatore-80 ° C durante la notte.</li>
			<li>Preparare un volume di lavoro fresco di tampone di estrazione gDNA contenente 200 µ g/mL concentrazione finale di proteinasi K. Nota: Non utilizzare un vecchio buffer per questo passaggio.</li>
			<li>Schiacciare ogni Mosca per 10 – 15 s con un puntale contenente 50 μL di schiacciamento buffer senza erogazione del liquido. Dispensare il buffer rimanente nella provetta e mescolare bene. Incubare a 37 ° C per 20-30 min.</li>
			<li>Mettere i tubi in blocco di calore di 95 ° C per 1 – 2 min inattivare la proteinasi K.</li>
			<li>Rotazione verso il basso per 5 min a 10.000 x g. Memorizzare la preparazione a 4 ° C per ulteriori analisi PCR.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare lo stesso metodo per preparare gDNA da una Mosca di nos-Cas9 , che serve come controllo negativo. Eseguire schermi PCR basato su tre fasi per identificare il corretto "termina" HDR (Figura 2, Figura 5) utilizzando gDNA di ogni uomo di F1 come un modello5. Utilizzare 1 μL della preparazione di DNA nel seguente sistema di reazione di PCR: 10 μL di 2 x PCR Master Mix con tintura, 1 μL di ogni primer (10 μM), 1 μL della mascherina del DNA e 7 μL di ddH2O.</li>
	<li>Come mostrato in Figura 5A, eseguire PCR con primer fwd1 e rev1 alla schermata per l'esistenza dell'inserimento o la sostituzione; Eseguire PCR utilizzando primers fwd2 e rev2 per verificare l'inserimento o la sostituzione da 3' regione; Eseguire PCR utilizzando primers M13F e rev3 per controllare "termina in" HDR (tabella 1).</li>
	<li>Mantenere le linee di volare con il confermato HDR di estremità-out e stabilire equilibrate scorte della generazione F2. Outcross per le mosche di bilanciatore nuovamente per rimuovere eventuali mutazioni indesiderate su altri cromosomi.</li>
	<li>
Preparare gDNA di alta qualità provenienti dalle scorte stabilite per l'amplificazione PCR lunga (> 800 – 1.000 nt) ampliconi con alta fedeltà Taq polimerasi e completamente sequenza verificare gli ampliconi ottenuti dalle regioni genomiche ingegnerizzate. In alternativa, utilizzare gDNA greggio estratto come descritto in precedenza per amplificare più brevi (< 800 nt), sovrapposizione di prodotti di PCR per sequenza-convalidare il genoma modificato. Per preparare il DNA genomic di Drosophila di buona qualità, utilizzare il seguente protocollo:
	<ol>
<li>Mettere circa 25 mosche adulte in una microcentrifuga da 1,5 mL e congelare nel congelatore a-20 ° C o da-80 ° C per almeno 1 ora.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l di soluzione A (pH 9.0 Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).</li>
		<li>Omogeneizzare le mosche usando l'omogeneizzazione pestelli in microcentrifuga e mettere il tubo sul ghiaccio.</li>
		<li>Incubare a 70 ° C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere 35 μL di KOAc (5 M), agitare e mescolare bene, ma fare non vortice.</li>
		<li>Incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Rotazione a 12.000 x g per 15 min.</li>
		<li>Con una micropipetta da 1 mL, attentamente trasferire solo il sovranatante chiaro ad un nuovo tubo, lasciando indietro qualsiasi precipitato o interfase.</li>
		<li>Aggiungere 150 μL di isopropanolo al supernatante. Mescolare delicatamente per inversione.</li>
		<li>Girare a 10.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e lasciare il pellet nel tubo.</li>
		<li>Lavare la pallina con 1 mL 70% EtOH.</li>
		<li>Spin a 12.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Eliminare il surnatante. Asciugare all'aria il pellet per 15-20 min. Non asciugare oltre il pellet.</li>
		<li>Dissolva la pallina in 100 μL di ddH2O.</li>
		<li>Utilizzare ad alta fedeltà della polimerasi di DNA adatta per lungo amplicone (> 800 bp) per amplificare la regione cura completa. Idealmente, prendere due iniettori fuori la cassetta inserita per amplificare la regione genomica. Gel di purificare il prodotto PCR, e come descritto in precedenza, la sequenza di verificare il prodotto con multipli sovrapposti gli iniettori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Convalidare i modelli di espressione spatiotemporal corretta da embrioni e tessuti dissecati delle linee volare derivati dal:
	<ol>
<li>Eseguire RT-PCR da RNA totale per verificare l'espressione del mRNA ibrido prodotto (tabella 1).</li>
		<li>Eseguire un'ibridazione in situ del prodotto mRNA dell'interesse in tessuti/embrione larvale per convalidare l'espressione.</li>
		<li>A schermo per i modelli accurati tessuto-specifici spatiotemporal espressione tra le linee di estremità-out sequenza-verificato, attraversare ciascuna delle righe modificate ottenuti per il driver di espressione binaria con il LexO- GFP o LexO- RFP (per LexA driver) linea (disponibile presso i centri di stock di Bloomington) e osservare la LexA o Gal4 guidato espressione del gene del reporter in tessuti larvali e adulti di embrione, microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Tradizionalmente, trappole del rinforzatore di Drosophila sono stati generati da due diversi metodi. Uno dei modi include l'inserimento casuale di un driver (es., Gal4) sequenza del genoma di recepimento (ad es., trasposizione elemento P)1 . In alternativa, le sequenze di driver possono essere posizionate sotto il controllo trascrizionale di una regione enhancer/promotore presunto in un costrutto di plasmide, che sarebbe poi integrato in una sede ectopica del genoma<sup ...

Casella degli strumenti genetico per espressione genica mirata è stato ben sviluppato in Drosophila, che lo rende uno dei migliori sistemi di modello per studiare la funzione dei geni coinvolti in un'ampia varietà di processi cellulari. Sistemi di espressione binaria, come il lievito Gal4/UAS (sequenza di attivazione a Monte), fu adottato per risultati di intrappolamento e gene tessuto-specifici enhancer in Drosophila modello genetico1 (Figura 1). Questo sistema ha facilitato lo sviluppo di un gran numero di tecniche come la regolazione spazio-temporale della sovraespressione genica, risultati, Ko in gruppi selezionati di cellule pure come ablazione delle cellule, cellule marcatura, tracciatura dal vivo di cellulari e molecolari processi in embrione e tessuti, lignaggio traccia e analisi di mosaico durante lo sviluppo. Un numero del sistema binario trascrizione, ad esempio il batterica LexA/LexAop system (Figura 1) e Neurospora Q-system, sono potenti strumenti genetici che ora sono ampiamente usati in Drosophila, oltre a l'originale sistema Gal4/UAS per gene bersaglio espressione1,2,3.
Qui, presentiamo un metodo per generare il sistema altamente affidabile tessuto-specifica espressione binaria impiegando una tecnica di modifica del genoma. I recenti progressi nella tecnologia di editing CRISPR/Cas9 genoma hanno permesso opportunità senza precedenti per apportare modifiche di genoma diretto in una vasta gamma di organismi. Rispetto ad altre tecniche di editing disponibili genoma, il sistema CRISPR/Cas9 è economico, efficiente e affidabile. Questa tecnologia utilizza componenti del sistema immunitario adattativo batterico: un'endonucleasi di Cas9 di Streptococcus pyogenes che crea una rotture a doppio filamento (DSB) e un RNA chimerico guida (gRNA), che guida il Cas9 a un sito particolare genoma per mirati DSB4. Le cellule contengono i macchinari per riparare il DSB utilizzando percorsi diversi. Non-omologa fine unirsi (NHEJ) conduce a piccoli inserimenti o eliminazioni di perturbare la funzione del gene, mentre riparazione omologia-diretto (HDR) introduce un definito diretto/desiderabile genomico knock-in/knock-out utilizzando un donatore HDR esogeno come modello. La strategia di sostituzione basato su HDR possa essere utilizzata in modo efficiente per generare un sistema altamente affidabile espressione binaria di tessuto-specifici, in grado di superare tutte le limitazioni dei metodi tradizionali enhancer trap. Descriviamo una procedura dettagliata per l'utilizzo di riparazione basato su CRISPR/Cas9 HDR nella generazione di una linea di driver binario trascrizione che si esprime sotto il controllo del regolamento endogeno trascrizionale e di un di Drosophila gene. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di una linea di driver specifica per prive (bnl) gene codifica per una proteina di famiglia di FGF che regola la morfogenesi di ramificazione della via aerea tracheale epitelio5. In questo esempio, il primo esone codifica del gene di bnl è stato sostituito dalla sequenza di una sequenza di transactivator LexA batterica senza alterare qualsiasi endogeno cis-sequenze regolarici del gene di bnl . Mostriamo che la strategia generato una linea di driver di bnl-LexA che spatiotemporally controlla l'espressione di un gene del reporter posizionato a valle di LexAoperator (LexAop o LexO) esclusivamente in bnl- che esprimono le cellule epiteliali/mesenchymal/neuronali.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>clonazione</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>clonazione</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura senza DNasi/RNasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>Primer enzimatici</td></tr><tr><td></td><td>di restrizione IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>DNA modello e vettore per gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa biosystems)Kapa</td> <td>biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-alta fedeltà Taq</td><td>NEB</td><td>NEB #M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>Assemblaggio del DNA</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA:p65Uw</td><td>Addgene</td><td></td><td>Modello di DNA per l'amplificazione LexA</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Biologia Molecolare</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, con colorante (rosso)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td></td></tr><tr><td>Kit di eluizione in gel</td> per biologia molecolare <td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td> <td>TRI per biologia molecolareSigma-Aldrich</td><td></td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>Kit di purificazione diretta dell'RNA</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>OneTaq Kit RT-PCR One-Step</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>UAS-CD8:GFP</td><td>Laboratorio</td><td></td> Kornberg<td>Volare la cima</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Fly line</td></tr><tr><td>Microscopio confocale SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging expression pattern</td></tr><tr><td>CO2 station</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>fly pushing</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>fly pushing</td></tr><tr><td>Pestelli omogeneizzatori per microprovette</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td><td>Isolamento genomico del DNA</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Quantificazione del DNA</td></tr></tbody></table>

una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in drosophila genoma modificando

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Sistemi di trascrizione binario sono potenti strumenti genetici ampiamente usati per la visualizzazione e manipolazione cellulare destino e l'espressione genica in specifici gruppi di cellule o tessuti in organismi modello. Questi sistemi contengono due componenti distinte linee transgeniche. Un'autista linea esprime un attivatore trascrizionale sotto il controllo di promotori tessuto-specifici/Enhancer, un reporter/effettrici linea porticcioli e un gene bersaglio posizionato a valle per il sito di legame dell'attivatore di trascrizione. Animali che harboring entrambi i componenti inducono la transattivazione di tessuto-specifica di un'espressione di gene di destinazione. Spazio-temporale precisa espressione del gene in tessuti mirati è critica per interpretazione imparziale dell'attività del gene e delle cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un metodo per la generazione di linee di esclusivo cellula/tessuto-specifico driver è essenziale. Qui presentiamo un metodo per generare il sistema di espressione mirati altamente tessuto-specifica con l'ausilio di un "cluster regolarmente Interspaced breve palindromi Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas)-base tecnica di editing genomico. In questo metodo, l'endonucleasi Cas9 è bersagliato da due chimerico guida RNAs (gRNA) a siti specifici nel primo esone codifica di un gene nel genoma della drosofila per creare rotture a doppio filamento (DSB). Successivamente, utilizzando un plasmide di donatore esogeno contenente la sequenza di transactivator, il macchinario di riparazione delle cellule-autonoma consente il ripristino diretto di omologia (HDR) del DSB, con conseguente eliminazione precisa e sostituzione dell'essone con il transactivator sequenza. Il transactivator bussò-in è espresso esclusivamente in cellule dove il cis-elementi regolatori del gene sostituito sono funzionali. Il protocollo dettagliato passo-passo qui presentato per la generazione di un driver binario trascrizionale espresso in Drosophila fgf/prive-producendo le cellule epiteliali/neuronali può essere adottato per qualsiasi espressione di gene - o tessuto-specifico.

Questo protocollo è stato usato con successo per generare un sistema specifico di espressione binaria mirati reporter per bnl che esprimono le cellule5. Il cis-elementi regolatori (CREs) che controllano l'espressione complessa spatiotemporal bnl non sono caratterizzati. Pertanto, per raggiungere spatiotemporal espressione sotto il controllo della sequenza regolamentazione endogeno bnl , solo il primo esone codifica di bnl</em...

Qui, presentiamo un metodo per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila , sostituendo il primo esone codifica dei geni con driver di trascrizione. Il metodo basato su CRISPR/Cas9 inserisce una sequenza di transactivator ai sensi del regolamento endogeno di un gene sostituito e di conseguenza facilita transctivator espressione esclusivamente in reticoli spatiotemporal gene-specifico.

Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

L'obiettivo generale di questo metodo è generare un sistema di espressione mirato altamente specifico per i tessuti. In questo metodo, abbiamo dimostrato la generazione di un driver trascrizionale binario specifico per il nostro omologo Drosophila FGF, branchless. L'espressione dinamica e spaziotemporale di branchless regola l'emogenesi di ramo dell'epitelio tracheale delle vie aeree.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione spaziotemporale e sulla migrazione delle cellule produttrici senza rami, può essere facilmente applicato ad altri geni e tessuti in Drosophila o in altri organismi modello, come C.Elegans e zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che genera sistemi di espressione altamente affidabili, specifici dei tessuti e dei geni, e attivi esclusivamente in cellule in cui gli elementi regolatori cis del gene sostituito sono funzionali. I sistemi di trascrizione binaria sono strumenti essenziali per l'espressione e la manipolazione genica mirata.Un attivatore trans, come GAL4 o LexA, espresso sotto il controllo di elementi regolatori cis di un gene, guida un gene trans effettore che viene posizionato a valle di specifici siti di legame

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Biologia dello sviluppo

Questo video descrive un metodo di screening per identificare le mosche transgeniche Drosophila, il cui genoma è stato modificato utilizzando CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 è un potente strumento di editing del genoma che ha rivoluzionato il modo in cui gli scienziati possono manipolare il genoma di un organismo. Nel protocollo di esempio, vedremo come identificare mutanti generati da CRISPR, in cui l'inserimento di una sequenza di transattivazione sostituisce il primo esone del gene branchless...

Screening per le modifiche genomiche: un metodo per identificare i mutanti generati da CRISPR in Drosophila

Tecniche di ricombinazione omologa notevolmente...

Recombineering costrutti omologhi ricombinazione<em&gt; Drosophila</em

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per l'utilizzo dell'enzima Cas13D mirato all'RNA (RfxCas13D) nelle mosche.

Targeting dell'RNA ubiquo e tessuto-specifico in Drosophila Melanogaster con CRISPR/CasRx

Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.

Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

Qui, presentiamo un protocollo di marcatura genica endogena semplificato per Drosophila, che utilizza una tecnica basata sulla PCR per l'identificazione senza marcatori di modificazioni genetiche di successo, facilitando lo sviluppo di linee knock-in stabili.

Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri come generare sistemi di trascrizione binari tessuto-specifici in Drosophila utilizzando CRISPR/Cas9. Questo metodo sostituisce il primo esone codificante con driver di trascrizione per controllare l'espressione genica spaziotemporale.

Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

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