Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo
July 28th, 2018
A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del tessuto adiposo, come ad esempio come i diversi componenti del tessuto adiposo interagiscono in un intero tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rimuove completamente i lipidi in eccesso immagazzinati nel tessuto adiposo mantenendo la sua architettura tridimensionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione tridimensionale del tessuto adiposo, può anche essere generalmente applicato ad altri tessuti ad alto contenuto lipidico come la ghiandola della memoria e i linfonodi.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di delipidazione e chiarificazione richiedono tempi di incubazione sufficienti, che possono essere difficili da determinare. Inizia usando una pinza con estremità smussata per sezionare il cuscinetto adiposo di interesse da un modello animale appena perfuso. Rimuovere con cura l'intero tampone senza pizzicare o schiacciare il tessuto o contaminare il tessuto sezionato con il pelo.
Posizionare il cuscinetto adiposo in circa 10 millilitri di soluzione di fissazione in un tubo conico da 15 millilitri e post-fissare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, dopo aver lavato il campione con PBS, rimuovere delicatamente eventuali detriti dal campione al microscopio da dissezione. Capelli, lanugine o altri detriti attaccati al campione causeranno ombre durante l'imaging.
Trasferire il campione pulito in una provetta di polipropilene contenente un tampone B1N di metanolo ghiacciato al 20%. Posizionare il tubo contenente il campione orizzontalmente su un agitatore orbitale, impostarlo a 100 giri/min e agitare da 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni del campione. Assicurarsi che i campioni possano muoversi liberamente all'interno del tubo.
Continuare a disidratare i campioni attraverso una serie graduata di metanolo al 40%, 60% e 80% in tampone B1N seguito da metanolo al 100%. Ridurre al minimo la soluzione di carryover. Dopo la disidratazione, sostituire la soluzione di metanolo al 100% con diclorometano al 100% o DCM per delipidizzare il campione.
Ripetere il lavaggio due volte seguendo i tempi di incubazione riportati nella tabella 2. Il campione dovrebbe affondare sul fondo della provetta alla fine del secondo e del terzo lavaggio DCM. In caso contrario, prolungare il tempo di incubazione per garantire la completa delipidazione.
Dopo la delipidazione, lavare due volte con metanolo al 100% per il tempo indicato nella tabella 2. Reidratare il campione in una serie di tamponi B1N a metanolo invertito per i tempi indicati nella tabella 2. Dopo la reidratazione, lavare il campione con tampone PTXWH per 2 ore a temperatura ambiente.
Il campione è ora pronto per l'immunocolorazione o può essere conservato in tampone PTXWH a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 anno. Innanzitutto, diluire l'anticorpo primario nel tampone PTXWH alla concentrazione raccomandata. Quindi, centrifugare la soluzione di anticorpi diluiti a 20 mila G per 10 minuti per evitare l'introduzione di precipitati o aggregazioni di anticorpi.
È importante scegliere anticorpi primari adeguati che siano compatibili con il metanolo e il trattamento con DCM. I nuovi anticorpi devono essere convalidati con piccoli pezzi di tessuto o con sezioni di tessuto trattate con metanolo. Incubare il campione delipidato con la soluzione di anticorpi primari per 3-5 giorni a seconda delle dimensioni del campione.
Dopo l'incubazione primaria, lavare il campione con diverse sostituzioni del tampone PTXWH. Il giorno successivo, diluire l'anticorpo secondario nel tampone PTXWH alla concentrazione raccomandata. Centrifugare la soluzione di anticorpi diluiti come prima.
Incubare il campione con la soluzione di anticorpi secondari per 3-5 giorni a seconda delle dimensioni del campione. Anche in questo caso, lavare il campione con tampone PTXWH in una serie di fasi di incubazione come prima. Il giorno successivo, lavare il campione con 1XPBS per 5 minuti, 10 minuti, quindi 30 minuti.
Incorporare il tessuto adiposo nell'agarosio per facilitare il montaggio del campione per la microscopia a foglio leggero. Innanzitutto, preparare la soluzione di inclusione con agarosio all'1% in 1XPBS. Raffreddare la soluzione di inclusione a circa 40 gradi Celsius per evitare di esporre il campione a calore eccessivo.
Evitando il trascinamento di liquidi, posizionare il campione di tessuto pulito in uno stampo e disporlo nella posizione desiderata. Quindi versare delicatamente la soluzione di inclusione sul campione evitando bolle d'aria. Eventuali bolle d'aria devono essere spostate verso la periferia prima che l'agarosio si solidifichi.
Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, ritagliare un blocco contenente il campione. Trasferire il campione al 25% di metanolo in acqua, proteggerlo dalla luce e incubare agitando per il tempo indicato nella tabella 2. Continuare a disidratare il campione attraverso un gradiente di metanolo.
Incubare il campione in DCM al 100% per 1 ora agitandolo. I campioni lavati DCM si asciugano facilmente all'aria, il che comprometterebbe la nitidezza del campione e risulterebbe in immagini sfocate. È importante trasferire rapidamente i campioni in una soluzione fresca per evitare l'essiccazione.
Il campione deve affondare sul fondo della provetta alla fine di ogni lavaggio DCM. Incubare il campione in etere dibenzilico o DBE per una notte agitando leggermente per ottenere la corrispondenza dell'indice di rifrazione. Il campione alla fine diventerà luce trasparente e invisibile.
Il giorno successivo, dopo aver incubato il campione con DBE fresco con un leggero agitamento per 2 ore, conservare il campione a temperatura ambiente al buio o procedere direttamente all'imaging. Per visualizzare il campione con un microscopio a foglio ottico compatibile con DBE, montare il campione incorporato nell'agarosio su un supporto in grado di impedire il movimento durante l'imaging. Per visualizzare il campione con un microscopio confocale invertito o a due fotoni, posizionare il campione incluso nell'agarosio in un vetrino da camera con fondo in vetro.
La scansione di un cuscinetto adiposo sottocutante posteriore utilizzando un microscopio a foglio ottico a basso ingrandimento mostra l'organizzazione lobulare degli adipociti. Informazioni più dettagliate, come la dimensione degli adipociti, possono essere rivelate ingrandendo le regioni di interesse con un ingrandimento maggiore. Un cuscinetto adiposo sottocutaneo posteriore colorato con tirosina idrossilasi, un marcatore per il sistema nervoso simpatico, è stato ripreso mediante microscopia a florescenza a foglio ottico.
La colorazione TH ha rivelato strutture che appaiono come grandi fasci nervosi come indicato dalla freccia qui. Anche l'innervazione dei vasi sanguigni e la densa arborizzazione terminale nel parenchima tissutale sono rivelate dalla colorazione TH. Utilizzando la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche o PCAM1 nota anche come CD31 come marcatore per etichettare i vasi sanguigni, si osserva che tutti gli adipociti sono in contatto con i capillari in tutto il tessuto supportando l'elevata domanda di un efficiente scambio di nutrienti e ossigeno nel adiposo.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della Biologia Adiposa per esplorare ulteriori questioni come la morfogenesi precoce dei tessuti e la mappatura del destino dei progenitori degli adipociti. Può anche essere applicato per studiare l'istologia del tessuto adiposo umano. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide, metanolo, diclorometano ed etere dibenzilico può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale.
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Panoramica
Questo studio affronta una domanda chiave nella Biologia del Tessuto Adiposo riguardo l'interazione di diversi componenti all'interno del tessuto adiposo. Utilizzando la tecnica Adipo-Clear, i ricercatori possono visualizzare il tessuto adiposo in alta risoluzione preservando la sua architettura tridimensionale, consentendo approfondimenti sulla sua organizzazione e interazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia del Tessuto Adiposo
- Tecniche di Chiarificazione del Tessuto
- Imaging 3D dei Tessuti Biologici
Sfondo
- Il tessuto adiposo contiene un alto contenuto di lipidi, complicando la visualizzazione.
- I metodi istologici tradizionali non sono efficaci per tali tessuti.
- La necessità di tecniche di imaging robuste è critica per comprendere le interazioni dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di chiarificazione del tessuto Adipo-Clear
- Utilizzo di modelli animali freschi per una dissezione accurata dei campioni
- Microscopia a foglio di luce per l'imaging
Risultati Principali
- Delipidazione riuscita dei tessuti adiposi mantenendo l'integrità strutturale.
- Compatibilità dimostrata con vari anticorpi primari.
- Consentito la visualizzazione dettagliata degli adipociti e delle loro interazioni.
Conclusioni
- Il metodo fornisce nuovi percorsi per studiare la struttura del tessuto adiposo.
- Promette applicazioni nella comprensione di altri tessuti ad alto contenuto di lipidi.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Adipose tissue biology is central to metabolic disease research, yet lipid-rich composition limits comprehensive 3D visualization. Adipo-Clear enables whole-tissue imaging by removing lipids while preserving architecture, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence in adipose-resident cell interactions and stromal-vascular niche analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipose tissue architecture and cellular distribution for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides volumetric readouts that reduce sampling bias from traditional sectioning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, lipid-cleared tissue platforms compatible with immunostaining for biomarker co-localization.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by visualizing adipocyte-immune, vascular, and nerve interactions in intact tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of tissue remodeling in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
Adipo-Clear fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing 3D contextual data on adipose tissue composition and structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular organization and intercellular signaling in adipose tissue.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs for evaluating compound effects on tissue architecture.
- Analytics: Enables volumetric measurements of cell density, vessel density, and nerve innervation as decision-grade readouts.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via preserved tissue morphology and biomarker compatibility.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clearing protocol for lipid-rich tissues across metabolic, immunology, and neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adipose tissue studies through intact 3D visualization.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for multi-site reproducibility in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing off-target effects on adipose stroma or vasculature.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on adipose tissue engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, immunostaining, and clearing chemistry optimization.
- Depends on access to light sheet or compatible confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of delipidation and refractive index matching steps across laboratories.
- Involves adaptation considerations for human versus murine adipose tissue due to lipid density differences.
- Involves practical limitations related to reagent hazards (DCM, DBE) requiring fume hood and PPE compliance.
