Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo
28 luglio 2018
A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del tessuto adiposo, come ad esempio come i diversi componenti del tessuto adiposo interagiscono in un intero tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rimuove completamente i lipidi in eccesso immagazzinati nel tessuto adiposo mantenendo la sua architettura tridimensionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione tridimensionale del tessuto adiposo, può anche essere generalmente applicato ad altri tessuti ad alto contenuto lipidico come la ghiandola della memoria e i linfonodi.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di delipidazione e chiarificazione richiedono tempi di incubazione sufficienti, che possono essere difficili da determinare. Inizia usando una pinza con estremità smussata per sezionare il cuscinetto adiposo di interesse da un modello animale appena perfuso. Rimuovere con cura l'intero tampone senza pizzicare o schiacciare il tessuto o contaminare il tessuto sezionato con il pelo.
Posizionare il cuscinetto adiposo in circa 10 millilitri di soluzione di fissazione in un tubo conico da 15 millilitri e post-fissare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, dopo aver lavato il campione con PBS, rimuovere delicatamente eventuali detriti dal campione al microscopio da dissezione. Capelli, lanugine o altri detriti attaccati al campione causeranno ombre durante l'imaging.
Trasferire il campione pulito in una provetta di polipropilene contenente un tampone B1N di metanolo ghiacciato al 20%. Posizionare il tubo contenente il campione orizzontalmente su un agitatore orbitale, impostarlo a 100 giri/min e agitare da 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni del campione. Assicurarsi che i campioni possano muoversi liberamente all'interno del tubo.
Continuare a disidratare i campioni attraverso una serie graduata di metanolo al 40%, 60% e 80% in tampone B1N seguito da metanolo al 100%. Ridurre al minimo la soluzione di carryover. Dopo la disidratazione, sostituire la soluzione di metanolo al 100% con diclorometano al 100% o DCM per delipidizzare il campione.
Ripetere il lavaggio due volte seguendo i tempi di incubazione riportati nella tabella 2. Il campione dovrebbe affondare sul fondo della provetta alla fine del secondo e del terzo lavaggio DCM. In caso contrario, prolungare il tempo di incubazione per garantire la completa delipidazione.
Dopo la delipidazione, lavare due volte con metanolo al 100% per il tempo indicato nella tabella 2. Reidratare il campione in una serie di tamponi B1N a metanolo invertito per i tempi indicati nella tabella 2. Dopo la reidratazione, lavare il campione con tampone PTXWH per 2 ore a temperatura ambiente.
Il campione è ora pronto per l'immunocolorazione o può essere conservato in tampone PTXWH a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 anno. Innanzitutto, diluire l'anticorpo primario nel tampone PTXWH alla concentrazione raccomandata. Quindi, centrifugare la soluzione di anticorpi diluiti a 20 mila G per 10 minuti per evitare l'introduzione di precipitati o aggregazioni di anticorpi.
È importante scegliere anticorpi primari adeguati che siano compatibili con il metanolo e il trattamento con DCM. I nuovi anticorpi devono essere convalidati con piccoli pezzi di tessuto o con sezioni di tessuto trattate con metanolo. Incubare il campione delipidato con la soluzione di anticorpi primari per 3-5 giorni a seconda delle dimensioni del campione.
Dopo l'incubazione primaria, lavare il campione con diverse sostituzioni del tampone PTXWH. Il giorno successivo, diluire l'anticorpo secondario nel tampone PTXWH alla concentrazione raccomandata. Centrifugare la soluzione di anticorpi diluiti come prima.
Incubare il campione con la soluzione di anticorpi secondari per 3-5 giorni a seconda delle dimensioni del campione. Anche in questo caso, lavare il campione con tampone PTXWH in una serie di fasi di incubazione come prima. Il giorno successivo, lavare il campione con 1XPBS per 5 minuti, 10 minuti, quindi 30 minuti.
Incorporare il tessuto adiposo nell'agarosio per facilitare il montaggio del campione per la microscopia a foglio leggero. Innanzitutto, preparare la soluzione di inclusione con agarosio all'1% in 1XPBS. Raffreddare la soluzione di inclusione a circa 40 gradi Celsius per evitare di esporre il campione a calore eccessivo.
Evitando il trascinamento di liquidi, posizionare il campione di tessuto pulito in uno stampo e disporlo nella posizione desiderata. Quindi versare delicatamente la soluzione di inclusione sul campione evitando bolle d'aria. Eventuali bolle d'aria devono essere spostate verso la periferia prima che l'agarosio si solidifichi.
Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, ritagliare un blocco contenente il campione. Trasferire il campione al 25% di metanolo in acqua, proteggerlo dalla luce e incubare agitando per il tempo indicato nella tabella 2. Continuare a disidratare il campione attraverso un gradiente di metanolo.
Incubare il campione in DCM al 100% per 1 ora agitandolo. I campioni lavati DCM si asciugano facilmente all'aria, il che comprometterebbe la nitidezza del campione e risulterebbe in immagini sfocate. È importante trasferire rapidamente i campioni in una soluzione fresca per evitare l'essiccazione.
Il campione deve affondare sul fondo della provetta alla fine di ogni lavaggio DCM. Incubare il campione in etere dibenzilico o DBE per una notte agitando leggermente per ottenere la corrispondenza dell'indice di rifrazione. Il campione alla fine diventerà luce trasparente e invisibile.
Il giorno successivo, dopo aver incubato il campione con DBE fresco con un leggero agitamento per 2 ore, conservare il campione a temperatura ambiente al buio o procedere direttamente all'imaging. Per visualizzare il campione con un microscopio a foglio ottico compatibile con DBE, montare il campione incorporato nell'agarosio su un supporto in grado di impedire il movimento durante l'imaging. Per visualizzare il campione con un microscopio confocale invertito o a due fotoni, posizionare il campione incluso nell'agarosio in un vetrino da camera con fondo in vetro.
La scansione di un cuscinetto adiposo sottocutante posteriore utilizzando un microscopio a foglio ottico a basso ingrandimento mostra l'organizzazione lobulare degli adipociti. Informazioni più dettagliate, come la dimensione degli adipociti, possono essere rivelate ingrandendo le regioni di interesse con un ingrandimento maggiore. Un cuscinetto adiposo sottocutaneo posteriore colorato con tirosina idrossilasi, un marcatore per il sistema nervoso simpatico, è stato ripreso mediante microscopia a florescenza a foglio ottico.
La colorazione TH ha rivelato strutture che appaiono come grandi fasci nervosi come indicato dalla freccia qui. Anche l'innervazione dei vasi sanguigni e la densa arborizzazione terminale nel parenchima tissutale sono rivelate dalla colorazione TH. Utilizzando la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche o PCAM1 nota anche come CD31 come marcatore per etichettare i vasi sanguigni, si osserva che tutti gli adipociti sono in contatto con i capillari in tutto il tessuto supportando l'elevata domanda di un efficiente scambio di nutrienti e ossigeno nel adiposo.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della Biologia Adiposa per esplorare ulteriori questioni come la morfogenesi precoce dei tessuti e la mappatura del destino dei progenitori degli adipociti. Può anche essere applicato per studiare l'istologia del tessuto adiposo umano. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide, metanolo, diclorometano ed etere dibenzilico può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale.
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Panoramica
Questo studio affronta una domanda fondamentale nella Biologia del Tessuto Adiposo riguardo all'interazione tra i diversi componenti all'interno del tessuto adiposo. Utilizzando la tecnica Adipo-Clear, i ricercatori possono visualizzare il tessuto adiposo ad alta risoluzione preservandone l'architettura tridimensionale, consentendo approfondimenti sulla sua organizzazione e sulle sue interazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia del tessuto adiposo
- Tecniche di chiarificazione dei tessuti
- Immagini 3D dei tessuti biologici
Sfondo
- Il tessuto adiposo contiene un elevato contenuto lipidico, che complica la visualizzazione.
- I metodi istologici tradizionali non sono efficaci per tali tessuti.
- La necessità di tecniche di imaging robuste è fondamentale per comprendere le interazioni tissutali.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di chiarificazione tissutale Adipo-Clear
- Utilizzati modelli animali freschi per una dissezione accurata dei campioni
- Microscopia a foglio luminoso per l'acquisizione delle immagini
Risultati principali
- Eliminazione con successo dei tessuti adiposi mantenendo l'integrità strutturale.
- Dimostrata compatibilità con vari anticorpi primari.
- Permessi una visualizzazione dettagliata degli adipociti e delle loro interazioni.
Conclusioni
- Il metodo fornisce nuove vie per lo studio della struttura del tessuto adiposo.
- Presenta potenzialità per applicazioni nella comprensione di altri tessuti con elevato contenuto lipidico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La biologia del tessuto adiposo è centrale nella ricerca sulle malattie metaboliche, ma la sua composizione ricca di lipidi limita la visualizzazione tridimensionale completa. Adipo-Clear consente l'analisi dell'intero tessuto rimuovendo i lipidi pur preservandone l'architettura, supportando l'identificazione meccanicistica dei fattori di rischio nella validazione degli obiettivi e nei test fenotipici. Questo approccio migliora l'affidabilità predittiva nell'analisi delle interazioni tra cellule residenti nel tessuto adiposo e delle nicchie stromali-vascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'architettura del tessuto adiposo e della distribuzione cellulare per la verifica di ipotesi mirate.
- Valore operativo: Fornisce letture volumetriche che riducono il bias di campionamento derivante dalla sezionatura tradizionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera piattaforme di tessuti standardizzate e prive di lipidi, compatibili con l'immunomarcatura per la co-localizzazione di biomarcatori.
- Valore operativo: Permette una preparazione campione riproducibile per flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie visualizzando le interazioni tra adipociti, sistema immunitario, vasi sanguigni e nervi in tessuti integri.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale del rimodellamento tissutale in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Adipo-Clear si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del target alla valutazione preclinica, fornendo dati contestuali tridimensionali sulla composizione e sulla struttura del tessuto adiposo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'organizzazione cellulare e sulla segnalazione intercellulare nel tessuto adiposo.
- Screening: Fornisce output quantitativi e risolti a livello spaziale per valutare gli effetti dei composti sull'architettura del tessuto.
- Analisi: Consente misurazioni volumetriche della densità cellulare, della densità vascolare e dell'innervazione nervosa come letture affidabili per il processo decisionale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica attraverso la conservazione della morfologia del tessuto e la compatibilità con i biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo di chiarificazione riutilizzabile per tessuti ricchi di lipidi in programmi metabolici, di immunologia e di neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sui tessuti adiposi grazie alla visualizzazione tridimensionale integra.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei tessuti per garantire riproducibilità multisito nei saggi basati sull'imaging.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale rivelando effetti fuori bersaglio sullo stroma adiposo o sulla vascolarizzazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli in base ai profili di coinvolgimento del tessuto adiposo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nell'immunomarcatura e nell'ottimizzazione della chimica di chiarificazione.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture per microscopia a foglio luminoso o confocale compatibile.
- Necessita di standardizzazione dei passaggi di delipidazione e di adattamento dell'indice di rifrazione tra laboratori.
- Richiede considerazioni adattative per il tessuto adiposo umano rispetto a quello murino a causa delle differenze nella densità lipidica.
- Comporta limitazioni pratiche legate ai rischi dei reagenti (DCM, DBE) che richiedono l'uso della cappa aspirante e il rispetto delle norme relative ai DPI.
