Name: Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri la rilevazione immunohistochimica di 5mC e 5hmC nella retina di topo durante lo sviluppo e la fase postmitotica. Questo protocollo consente di studiare le modificazioni epigenetiche della cromatina con microscopia confocale.

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Questo lavoro è stato supportato da un grant SBIR (1R44EY027654-01A1).

Tutte le procedure con i topi sono state effettuate secondo protocolli approvati dal comitato animale bambini Hospital Oakland Research Institute uso e manutenzione e aderito all'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e ricerca di visione.
1. preparazione per l'immunocolorazione
<ol><li>Eutanasia di topi C57 BL/6J al giorno embrionale (E) 16, giorno postnatale (P) 0, P15 e P90 dall'anidride carbonica (CO2) seguita dalla decapitazione (topi E16 e P0).</li>
	<li>Gli occhi del mouse immediatamente enucleata forato con ago 29 1/2 sul lato dorsale dell'occhio. Incubare per 5 minuti (min) in 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) pH tampone fosfato salino (1x PBS) 8.0 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per rendere conchiglie oculari da P0, P15 e P90, sezionare cornea e lente con forbice oftalmica mentre gli occhi sono in 4% PFA. Nota: Salta questo passaggio per E16 occhi come gli occhi sono troppo piccoli.</li>
	<li>Difficoltà le conchiglie oculari (P0, P15 e P90) e gli occhi tutto (E16) nel 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente. Poi lavare il paraocchi e occhi tutto due volte in 1 mL di PBS 1X per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cryoprotect l'occhio tazze e tutto occhi in 1xPBS, pH 8,0 contenente 10% di saccarosio per 1 ora. Tenere in saccarosio al 20% in PBS 1X per 1 ora e poi saturare in saccarosio 30% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, incorporare i paraocchi e gli occhi tutto in taglio ottimale temperatura composto (OCT), (500 µ l) in cryomolds, snap-freeze in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Togliere gli stampi con paraocchi incorporato e occhi tutto da-80 ° C e far per equilibrare a-20 ° C per 1 ora prima di cryosectioning.</li>
	<li>Tagliare sezioni trasversali retiniche (spessore 12 µm) parallelamente all'asse di temporonasal attraverso la testa del nervo ottico usando un criostato a-20 ° C.</li>
	<li>Montare le sezioni della retina su microscopio diapositive53 e conservare a-80 ° C.</li>
</ol>2. Immunostaining con gli anticorpi 5-mC e 5-hmC
<ol><li>Circondano le sezioni della retina montate su slitte con una penna di barriera idrofoba. La penna di barriera idrofoba riduce il volume di anticorpo richiesto a macchiare il tessuto.</li>
	<li>Lavare le sezioni della retina una volta con 200 µ l di PBS 1X per 10 min.</li>
	<li>Permeabilize le sezioni della retina con 200 µ l di 0.1% Triton X-100 in 1X PBS (PBS-T) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Denaturare sezioni della retina per 30 min con 200 µ l di appena fatte 2 di acido cloridrico (HCl) N in PBS 1X in un incubatore a 37 ° C. Nota: Un'attenta titolazione di HCl trattamento è necessario per ottimizzare il segnale 5mC.</li>
	<li>Includere sempre replicati biologici (3-4) ottimizzando 5mC segnale54. Nota: Abbiamo fatto il ricupero dell'antigene a 4 punti di tempo (15min, 30min, 1h e 2h) e trovato 30 min di incubazione è ottima per segnale 5mC. Incubazione più lungo con HCl degrada la struttura dei nuclei che conduce all'incapacità di localizzare 5mC segnale al nucleo.</li>
	<li>Dopo denaturazione, neutralizzare retiniche sezioni aggiungendo 100 µ l di 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) sulle sezioni della retina per 10 min.</li>
	<li>Incubare le sezioni in 500 µ l di soluzione bloccante (5% di siero preimmune capra normale nello 0,1% Triton X-100 in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente in una camera umida.</li>
	<li>Dopo il blocco, aggiungere anti-5mC; gli anticorpi anti-5hmC diluiti 1: 500 in blocco la soluzione alle sezioni della retina.</li>
	<li>Incubare retinica sezioni durante la notte a 4 ° C in camera umida.</li>
	<li>Il lavaggio del giorno successivo, sezioni della retina 3 volte (10-15 minuti ogni volta) con 0,1% PBS-T e poi incubare nella soluzione con i corrispondenti anticorpi secondari di blocco (Goat Anti-Rabbit e Goat Anti-Mouse IgG, diluito; 1: 1000), contenente DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) soluzione (1 µ g/mL) a temperatura ambiente per 1 h nella soluzione di blocco. Nota: Evitare l'essiccazione delle sezioni durante tutte le fasi della immunodetection.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte con 1 mL di 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, montare i profili con il mezzo di montaggio acquoso sotto un vetrino coprioggetto e sigillare con smalto incolore.</li>
</ol>3. confocale Immunohistochemistry
<ol><li>Orientare le sezioni per avere il lato di epitelio retinico del pigmento della Coppa ottica sempre di fronte un modo (per esempio, a), per coerenza.</li>
	<li>Eseguire l'acquisizione di immagini di retinica sezioni immunostained a 63 X (ingrandimento di un obiettivo) con 2 X o zoom 3x.</li>
	<li>Generare più sezioni ottiche di ogni immagine selezionata (z-stack) in tutti i 3 canali (rosso, verde e blu, RGB) utilizzando 0.35 µm passo. Nota: L'ingrandimento finale di un esemplare visualizzato alle 10-20x (ingrandimento di una lente obiettiva) sarà 63 X, rispettivamente, quando combinato con una (in genere usati) 10x lente oculare. Visualizzare stack compresso ottico per individuare il segnale 5mC e 5hmC</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Modificazioni del DNA dinamici e reversibile, che modulatethe la diversificata gamma di meccanismi biologici in uno sviluppo così come in cellule postmitotic hydroxymethylation e metilazione del DNA. Qui, descriviamo una tecnica riproducibile per la rilevazione 5mC 5hmC DNA modifiche e in situ mediante tecnica immunoistochimica (usando gli anticorpi anti-5mC e anti-5hmC) in paraformaldeide sezioni congelate di retina di topo e fornire linee guida per migliorare e standardizzare i risultati, soprattutto quando si confrontano diversi diversi esemplari. All'inizio abbiamo usato questo metodo per delineare 5mC cambiamenti nella retina di topo con retina specifiche targeting di Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b DNA metiltransferasi geni e segnalato l'esaurimento (previsto) di marchi di 5mC in loro retine7 .
Il passaggio fondamentale nella rilevazione immunohistochemical 5mC è ottimizzazione del trattamento delle sezioni istologiche con HCl: meno di 15 min pretrattamento non dovrebbe produrre risultati riproducibili, mentre eccessivo trattamento con HCl distrugge il nucleare architettura. Abbiamo trovato il miglior risultato dopo un'incubazione di 30 min con HCl. Si consiglia di utilizzare sempre fresco diluito HCl e preparate 4% PFA soluzione per fissaggio del tessuto DNA denaturazione e retinico.
Per risolvere i risultati, si consiglia di includere tre o quattro repliche biologiche ottimizzando 5mC segnale. Mentre ogni singolo set di macchiatura immunohistochemical può generare risultati leggermente diversi (più o meno luminose regioni eterocromatiche), che è previsto in distribuzione immunohistochemical metodo, 5mC e 5hmC nucleare all'interno del set individuo delle sezioni dovrebbe essere molto riproducibili, per fintanto che il protocollo è seguito.
Questa tecnica ha anche limitazione come abbiamo costantemente osservato variabilità nella distribuzione di 5mC nei nuclei delle cellule del fotoricettore all'interno della stessa sezione. Abbiamo trovato alcuni nuclei ha mostrati il segnale forte 5mC mentre i nuclei delle cellule adiacenti ha mostrato nessun segnale di 5mC. Si tratta di limitazione a smascherare 5mC antigene di HCl trattamento nelle sezioni congelate.
Il significato di questa tecnica consente la localizzazione di 5mC senza DNasi e proteinasi K trattamento che porta alla migliore conservazione di cromocentri. Questa tecnica è previsto di lavorare robustamente su tutte le sezioni da tutti i tessuti animali vertebrati, trasportante 5mC, segni di 5hmC e trattata con un approccio simile, non solo la retina di topo, per fintanto che il protocollo è seguito.

Regolazione epigenetica di sviluppo e postmitotic omeostasi della retina di topo è un campo di ricerca, specifici del tipo di cella che promette di portare una nuova comprensione dei meccanismi biologici che controllano determinazione di destino delle cellule e retinogenesis, emozionante la funzione metabolica, nonché patologie cellulare, morte cellulare e rigenerazione1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. cromatina subisce cambiamenti dinamici in fase di sviluppo, così come in risposta a segnali esterni variabili che si tratti di stress, metabolico o delle cellule morte stimoli6,14,15, 16 , 17 , 18. nei nuclei del mouse, la cromatina è diviso in euchromatin attivo e inattivo eterocromatina6,19,20. Nel nucleo di interfase, l'eucromatina risiede nella regione interna del nucleo mentre eterocromatina linee la periferia nucleare e nucleolo. Questo modello è chiamato convenzionale ed è altamente conservato negli eucarioti. Al contrario, i nuclei di asta in animali notturni quali topi e ratti invertito modello dove il nucleo è occupato dall'eterocromatina nel centro circondato dall'eucromatina formando il guscio più esterno6,18, 20. Alla nascita, asta nuclei hanno architettura nucleare convenzionale. Inversione dei nuclei di asta si verifica durante lo sviluppo di rimodellamento dell'architettura nucleare convenzionale. Durante questo processo, eterocromatina periferico separa dalla periferia nucleare e cromocentri si fondono insieme per formare un singolo chromocenter nel centro del nucleo6,18.
La metilazione del DNA genomica partecipa nel controllo locale della cromatina conformazione21. Metilazione del DNA avviene nella posizione 5' di residui di citosina di dinucleotidi CpG che sono arricchiti nella regione del promotore di molti geni in mouse genomi22,23,24,25,26 così come in intergenica e regioni introne, che trasportano gli elementi normativi27. La metilazione delle isole CpG prossimale promotori21,24 e sequenze CpG in gene rinforzatori27,28 è importante nella regolazione dello stato dinamico della cromatina bivalente, contenente molti fattori di sviluppo geni/trascrizione che gioca un ruolo importante nello sviluppo, cancro e invecchiamento29,30,31,32,33,34 . Tre DNA metiltransferasi (DNMTs) partecipano nella metilazione del DNA nel corso del mouse sviluppo35. Tutti i tre DNMTs sono espressi durante del mouse sviluppo retinico36 e retina-specifiche modifiche in Dnmt geni impatto sviluppo retinico2,7. Idrossimetilcitosina (5hmC) è il prodotto ossidativo di demetilazione 5-metilcitosina (5mC). I tre enzimi di dieci-undici traslocazione (TET) partecipano a 5mC demetilazione37,38,39. Modifica di idrossimetil-C viene arricchita in promotori, enti di gene e sequenze intergeniche genomic gene ricca e regioni attivamente trascritto27,40.
C'è una varietà di approcci descritti per determinare i mutevoli modelli di metilazione del DNA in cellule41,42,43,44,45,46, alcuni di loro abilitazione quantificare i cambiamenti globali di metilazione del DNA mentre altri focalizzarsi su precisi cambiamenti nelle regioni CpG-ricco all'interno di promotori ed esaltatori di sapidità. Metodi per il rilevamento e la quantificazione di 5hmC sono stati anche segnalati47comprese da immunohistochemistry13. Tecniche immunoistochimiche, che consentono il monitoraggio robusto di 5mC e 5hmC cambiamenti nei nuclei di sviluppo e cellule postmitotic, sono molto ben informato per la delineazione della cromatina dynamics in situ in risposta ai cambiamenti esterni o interni influenzando la cellule4,13,48,49. Tuttavia, questo approccio è incline a sottovalutare la metilazione del DNA e hydroxymethylation modifiche a causa di difficoltà tecniche, connesse con rilevamento modifiche citosina in preparati istologici. Questo è poiché il DNA non polare si basa, compresi 5mC e citosina 5hmC-modificato, sono nascosti all'interno del centro della doppia elica del DNA elica50e richiedono smascheramento. Questo rappresenta una sfida particolare in preparazioni istologiche congelate, che potrebbero perdere rapidamente informativo organizzazione del tessuto originale quando viene applicato il trattamento duro.
Retina di topo è un eccellente modello per sezionare il contributo di metilazione del DNA a sviluppo neurale e omeostasi postmitotic. Ci sono solo 6 tipi di neuroni (rod e cono fotorecettori, amacrine, bipolare, cellule del ganglio e orizzontale), tipo una cellula glial (glia Muller) e uno neuroepithelial delle cellule tipo (epitelio pigmentato retinico)51. Tipi di cellule retiniche sono stati segnalati per avere modelli distinti di DNA metilazione18,19, che recentemente è stato studiato al singolo-base risoluzione1,5,9,12. Recentemente abbiamo riferito applicazione di immunohistochemistry per delineare 5mC pattern di distribuzione all'interno dei nuclei delle cellule retiniche e cambiamenti nei nuclei della retina di topo adulto, dove sono stati rimossi tutti i methyltransferases del DNA tre mirando condizionale 7. rispetto ad una serie di rapporti, dove la presenza di metilazione del DNA in cellule della retina potrebbe essere visto solo come un segnale positivo o negativo segnale in hypermethylated cellule che subiscono apoptosi, il nostro approccio abilitato rilevamento specifico della cromatina disposizione all'interno dei nuclei delle cellule retiniche, che diversi gruppi e abbiamo segnalato e discusso in precedenza5,6,7,18,19,36 , 52. qui, descriviamo la tecnica immunoistochimica (IHC) di individuare 5mC e 5hmC in sezioni istologiche paraformaldeide congelate nei dettagli così come dimostrano i dati, che siamo stati in grado di riprodurre dal nostro rapporto originale7 .

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Forbice oftalmica</td><td>Fine Science tools, Inc.</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Penna PAP</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Microscopio elettronico Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Composto da taglio ottico (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analitico&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Motivo attivo</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Formica-Coniglio IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione di immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e retina di topo postmitotic

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

L'epigenetica di sviluppo retinico è un campo di ricerca ben studiata, che promette di portare un nuovo livello di comprensione circa i meccanismi di una varietà di malattie degenerative della retina umane e individuare nuovi approcci terapeutici. L'architettura nucleare della retina di topo è organizzato in due modelli differenti: convenzionale e invertito. Modello convenzionale è universale dove eterocromatina è localizzata alla periferia del nucleo, mentre l'eucromatina attiva risiede all'interno di nucleare. Al contrario, invertito modello nucleare è unico ai nuclei delle cellule del fotoricettore adulto asta dove eterocromatina si localizza al centro nucleare, e l'eucromatina risiede nella periferia nucleare. Metilazione del DNA è osservata principalmente in cromocentri. Metilazione del DNA è una modificazione covalente dinamica relativa ai residui di citosina (5-metilcitosina, 5mC) di dinucleotidi CpG che sono arricchiti in regioni promotore di molti geni. Tre DNA metiltransferasi (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) partecipano nella metilazione del DNA durante lo sviluppo. 5mC rilevazione con tecniche immunoistochimiche è molto impegnativo, che contribuiscono alla variabilità nei risultati, come tutte le basi di DNA comprese le basi 5mC per volta sono nascosti all'interno di elica del DNA double-stranded. Tuttavia, dettagliate delineazione di 5mC distribuzione durante lo sviluppo è molto istruttiva. Qui, descriviamo una tecnica riproducibile per rilevazione immunohistochemical robusto di 5mC e un altro epigenetici DNA marker 5-idrossimetilcitosina (5hmC), che colocalizza con la cromatina "apre", trascrizionalmente attiva nello sviluppo e retina di topo postmitotic.

Per determinare la distribuzione di 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) durante lo sviluppo della retina e nella retina postmitotic, abbiamo immunostained C57BL/6J retinica sezione mouse da E16, P0, P15 e P90 con anticorpi specifici per 5mC e 5hmC.
A E16 la macchiatura 5mC era forte in cromocentri dei nuclei delle cellule mentre colorazione debole è stata osservata nei nuclei intera cellula (Figura 1a). La macchiatura di 5hmC è stata limitata ai nuclei delle cellule ed era assente da cromocentri (Figura 1b).
Nella retina P0, il segnale di 5mC è stato localizzato la cromocentri dei nuclei delle cellule e periferia nucleare (Figura 2a, freccia e punta di freccia). Inoltre abbiamo osservato colorazione debole di 5mC tra i cromocentri dei nuclei delle cellule. Il segnale di 5hmC era fortemente presente nei nuclei delle cellule ad eccezione di cromocentri (Figura 2b). Abbiamo trovato che più nuclei sono macchiati con 5mC e 5hmC nello strato interno neuroblasto (INBL) (Figura 2 c, linea tratteggiata)
Nella retina P15, abbiamo trovato forte macchiatura di 5mC e 5hmC in strato nucleare esterno (ONL), strato nucleare interno (INL) e strato delle cellule del ganglio (GCL) (Figura 3). In ONL (fotoricettori dell'asta), il segnale di 5mC era presente in cromocentri dei nuclei delle cellule e periferia nucleare (figure 3a-3C, 3G). Il segnale di 5hmC è stato trovato nei nuclei di cellule intere ad eccezione di cromocentri (figure 3d-3f). La microscopia elettronica di trasmissione fatta P15 retina Mostra distribuzione di domini eterocromatici nei nuclei delle cellule asta simile a quella trovata con segnale di anticorpo 5mC (figure 3 h e 3i).
La macchiatura di 5mC in INL e GCL era forte in cromocentri dei nuclei delle cellule e colorazione debole è stata osservata anche nei nuclei di cellule intere (figure 3j-3L e 3r-3t). A differenza di 5mC, il segnale di 5hmC è stato localizzato dei nuclei di cellule intere ad eccezione di cromocentri in INL e GCL (figure 3 m-3o e 3u-3w). Abbiamo osservato un forte segnale di 5hmC alla periferia dei nuclei delle cellule GCL.
Nei fotorecettori adulti rod, il segnale di 5mC era limitato allo chromocenter e alla periferia nucleare dei nuclei delle cellule (figure 4a-4c) mentre 5hmc segnale è stato limitato alla periferia nucleare (figure 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figura 1. Localizzazione di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo al giorno embrionale 16. Immunostaining di C57BL/6J retina con gli anticorpi a 5mC (rosso) e 5hmC (verde, b). E16, 5mC segnale è molto forte in cromocentri dei nuclei delle cellule e anche presenti nei nuclei di cellule intere al livello più basso. 5hmC macchiatura è stata limitata esclusivamente ai nuclei delle cellule. C pannello rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu, c). Inserti rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nelle immagini. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Nella figura 2. La macchiatura di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo postnatale giorno 0. Immunolabeling della retina C57BL/6J con gli anticorpi a 5mC (rosso) e 5hmC (verde, b). Nella retina P0, 5mC e 5hmC sono presenti nel livello esterno neuroblasto (ONBL) e strato interno neuroblasto (INBL). ) segnale di 5mC è fortemente presente nel cromocentri (freccia) e periferia nucleare dei nuclei delle cellule (punta di freccia). Inoltre si osserva una colorazione debole di 5mC tra i cromocentri dei nuclei delle cellule. b) 5hmC macchiatura è limitata al nucleo della cellula e segnale forte è osservata in INBL (linea tratteggiata nel pannello c). C pannello rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu, c). Inserti rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nelle immagini. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Nella figura 3. distribuzione 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo postnatale giorno 15. Immunostaining di C57BL/6J retina con anticorpi anti-5mC e 5hmC (a-g, j-y). Nello strato nucleare esterno (ONL) (fotoricettori dell'asta), 5mC segnale (rosso) solitamente coincide con il cromocentri dei nuclei delle cellule (punta di freccia, b) e anche si localizza alla periferia nucleare (freccia, b). Pannello b (rosso) e c (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nell'immagine di una. Il segnale di 5hmC (verde, d) è limitato ai nuclei cellulari tutto tranne i cromocentri. Pannello e (verde) e f (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella immagine d. pannello g rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Pannello h ed io siamo immagine di microscopio elettronico a trasmissione dei nuclei del fotoricettore a postnatale giorno 15 visualizzando distribuzione dei domini eterocromatici. Punta di freccia nera in pannello h punta a stelo singolo fotorecettore nucleo allargato nei. pannello rosse frecce nel pannello che indico heterochromatic domini all'interno di nucleo del fotoricettore asta mentre le frecce rosse al punto di eterocromatina nella periferia nucleare. In INL (j-q) e nuclei delle cellule GCL (r-y), il segnale di 5mC (rosso) è localizzato il cromocentri presenti nella periferia e colorazione debole viene rilevato anche nel resto dei nuclei delle cellule. Pannello k (rosso) e i (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella figura j. La macchiatura di 5hmC (verde) nei nuclei delle cellule INL e GCL è limitata al nucleo della cellula intera. Nota 5hmC forte colorazione nella periferia nucleare delle cellule GCL. X e pannello p rappresentano 5mC Unite e 5hmC immagine mentre y e pannello q rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nel immagine p e x rispettivamente. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Nella figura 4. 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina distribuzione nei nuclei del fotoricettore asta di retina di topo C57BL/6J al 90 ° giorno postnatale. La macchiatura di 5mC (rosso, un) è fortemente presente in chromocenter dei nuclei delle cellule e anche debolmente presente nella periferia nucleare. Pannello b (rosso) e c (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nell'immagine di una. La macchiatura di 5hmC (verde, d) è esclusivamente limitata alla periferia nucleare e pannello (verde) e f (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella immagine d. pannello g rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine mentre h del pannello è di ingrandimento della zona indicata con asterisco nell'immagine che g. Nuclei sono controcolorati con DAPI (blu). Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'obiettivo di questo rapporto è di descrivere il protocollo per rilevazione immunohistochemical robusto di marcatori epigenetici, 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) nello sviluppo e postmitotic mouse retina.

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della metilazione del DNA, come i cambiamenti nella cromatina durante lo sviluppo della retina nella retina postmitotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata in modo robusto su qualsiasi sezione di tutti i tessuti retinici di topo che trasportano la distribuzione di 5-metilcitosina, 5-idrossimetilcitosina che vengono elaborati con un approccio simile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione e colorazione dei tessuti sono difficili da imparare, perché se si utilizzano preparazioni istologiche congelate, si può perdere il prezioso tessuto organizzativo e originale.A dimostrare il resto della procedura sarà Pablo Diaz, ricercatore associato del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, utilizzare un ago da 29 gauge da mezzo pollice per perforare gli occhi di un topo decapitato eutanasia sul lato dorsale degli occhi. Per ottenere le conchiglie oculari, enucleare immediatamente gli occhi tagliando intorno alla sclera con forbici oftalmiche sottili per rimuovere la cornea e il cristallino.Fissare le conchiglie oculari e gli occhi interi E16 in paraformaldeide al 4% o PFA in 1xPBS pH 8.0 per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavateli due volte in un millilitro di 1xPBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Per crioproteggere le conchiglie oculari e gli occhi interi, incubarli in 1xPBS pH 8.0 con il 10% di saccarosio a temperatura ambiente per un'ora.Quindi in 20% di saccarosio in 1xPBS per un'ora. E infine nel 30% di saccarosio in 1xPBS a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, incorporare le conchiglie oculari e gli occhi in un composto a temperatura di taglio ottimale, o OCT, in criostampi.Quindi, congelali in un bagno di etanolo con ghiaccio secco e mantenili a 80 gradi Celsius. Prima di iniziare la criosezione, rimuovere gli stampi con le conchiglie oculari incorporate e gli occhi a 80 gradi Celsius. Mettili in un supporto per criostato e lasciali equilibrare a 20 gradi Celsius per un'ora.Utilizzando un criostato a 20 gradi Celsius, tagliare sezioni trasversali retiniche spesse 12 micrometri parallele all'asse temporonasale attraverso la testa del nervo ottico. Montare le sezioni sui vetrini del microscopio e conservarle a 80 gradi Celsius. Per iniziare l'immunocolorazione, utilizzare una penna barriera idrofobica per circondare le sezioni retiniche montate su vetrini.Lavare le sezioni una volta con 200 microlitri di 1xPBS per 10 minuti. Permeabilizzare le sezioni con 200 microlitri di PBST per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi denaturarli con 200 microlitri di acido cloridrico normale 2 accuratamente titolato appena fatto in 1xPBS per 45 minuti a 37 gradi Celsius per ottimizzare il segnale a 5mC.Dopo la denaturazione, aggiungere 100 microlitri di Tris-HCl 0,1 pH 8,3 sulle sezioni retiniche e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per neutralizzarle. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione bloccante. E incubare le sezioni in una camera di umidità a temperatura ambiente per un'ora.Aggiungere gli anticorpi appropriati, diluiti da uno a 500 in soluzione bloccante, alle sezioni e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte per 10-15 minuti ciascuna con lo 0,1% di PBST. Aggiungere appropriati anticorpi secondari diluiti uno a 1000 in una soluzione bloccante contenente la soluzione DAPI a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, lavare i vetrini tre volte con un millilitro di 0,1% PBST per 10 minuti ciascuno. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un mezzo di montaggio acquoso. Coprire con un vetrino coprioggetti.E poi procedere con la microscopia confocale. Dopo l'immunocolorazione retinica a E16, il segnale di 5mC era forte nei cromocentri dei nuclei cellulari e presente a un livello molto più basso nei nuclei dell'intera cellula. La colorazione con 5hmC è stata trovata esclusivamente nei nuclei cellulari e assente dai cromocentri.Nella retina P0, entrambi i segnali 5mC e 5hmC erano presenti nello strato esterno dei neuroblasti e nello strato interno dei neuroblasti. Il segnale 5mC era forte nei cromocentri e nella periferia nucleare dei nuclei cellulari e più debole tra i cromocentri dei nuclei cellulari. La colorazione 5hmC era limitata al nucleo cellulare.Nella retina P15, nello strato nucleare esterno, il segnale 5mC è stato rilevato nei cromocentri dei nuclei cellulari e nella periferia nucleare. Mentre il segnale 5hmC era in tutti i nuclei cellulari ad eccezione dei cromocentri. Nello strato interno delle cellule nucleari e ganglionari, il segnale di 5mC era forte nei cromocentri dei nuclei cellulari e debole nei nuclei di intere cellule.Mentre il segnale 5hmC è stato trovato in tutti i nuclei cellulari ad eccezione dei cromocentri. Nei fotorecettori dei bastoncelli adulti, il segnale 5mC era limitato al cromocentro e alla periferia nucleare, mentre il segnale 5hmC era limitato alla periferia nucleare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di trattare le sezioni istologiche con l'esposizione ottimale di HCl, che è di 30 minuti.Se l'esposizione è inferiore o superiore, i risultati ottimali non possono essere riproducibili. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cromatografia liquida ad alta pressione, la spettrometria di massa per rispondere a ulteriori domande come la quantificazione delle variazioni nella misurazione della 5-metilcitosina e della 5-idrossimetilcitosina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo neurale per esplorare i cambiamenti epigenetici nella cromatina.Non dimenticare che lavorare con HCl e PFA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come il corretto smaltimento.

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Biologia dello sviluppo

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