Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della metilazione del DNA, come i cambiamenti nella cromatina durante lo sviluppo della retina nella retina postmitotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata in modo robusto su qualsiasi sezione di tutti i tessuti retinici di topo che trasportano la distribuzione di 5-metilcitosina, 5-idrossimetilcitosina che vengono elaborati con un approccio simile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione e colorazione dei tessuti sono difficili da imparare, perché se si utilizzano preparazioni istologiche congelate, si può perdere il prezioso tessuto organizzativo e originale.

A dimostrare il resto della procedura sarà Pablo Diaz, ricercatore associato del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, utilizzare un ago da 29 gauge da mezzo pollice per perforare gli occhi di un topo decapitato eutanasia sul lato dorsale degli occhi. Per ottenere le conchiglie oculari, enucleare immediatamente gli occhi tagliando intorno alla sclera con forbici oftalmiche sottili per rimuovere la cornea e il cristallino.

Fissare le conchiglie oculari e gli occhi interi E16 in paraformaldeide al 4% o PFA in 1xPBS pH 8.0 per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavateli due volte in un millilitro di 1xPBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Per crioproteggere le conchiglie oculari e gli occhi interi, incubarli in 1xPBS pH 8.0 con il 10% di saccarosio a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi in 20% di saccarosio in 1xPBS per un'ora. E infine nel 30% di saccarosio in 1xPBS a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, incorporare le conchiglie oculari e gli occhi in un composto a temperatura di taglio ottimale, o OCT, in criostampi.

Quindi, congelali in un bagno di etanolo con ghiaccio secco e mantenili a 80 gradi Celsius. Prima di iniziare la criosezione, rimuovere gli stampi con le conchiglie oculari incorporate e gli occhi a 80 gradi Celsius. Mettili in un supporto per criostato e lasciali equilibrare a 20 gradi Celsius per un'ora.

Utilizzando un criostato a 20 gradi Celsius, tagliare sezioni trasversali retiniche spesse 12 micrometri parallele all'asse temporonasale attraverso la testa del nervo ottico. Montare le sezioni sui vetrini del microscopio e conservarle a 80 gradi Celsius. Per iniziare l'immunocolorazione, utilizzare una penna barriera idrofobica per circondare le sezioni retiniche montate su vetrini.

Lavare le sezioni una volta con 200 microlitri di 1xPBS per 10 minuti. Permeabilizzare le sezioni con 200 microlitri di PBST per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi denaturarli con 200 microlitri di acido cloridrico normale 2 accuratamente titolato appena fatto in 1xPBS per 45 minuti a 37 gradi Celsius per ottimizzare il segnale a 5mC.

Dopo la denaturazione, aggiungere 100 microlitri di Tris-HCl 0,1 pH 8,3 sulle sezioni retiniche e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per neutralizzarle. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione bloccante. E incubare le sezioni in una camera di umidità a temperatura ambiente per un'ora.

Aggiungere gli anticorpi appropriati, diluiti da uno a 500 in soluzione bloccante, alle sezioni e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte per 10-15 minuti ciascuna con lo 0,1% di PBST. Aggiungere appropriati anticorpi secondari diluiti uno a 1000 in una soluzione bloccante contenente la soluzione DAPI a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, lavare i vetrini tre volte con un millilitro di 0,1% PBST per 10 minuti ciascuno. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un mezzo di montaggio acquoso. Coprire con un vetrino coprioggetti.

E poi procedere con la microscopia confocale. Dopo l'immunocolorazione retinica a E16, il segnale di 5mC era forte nei cromocentri dei nuclei cellulari e presente a un livello molto più basso nei nuclei dell'intera cellula. La colorazione con 5hmC è stata trovata esclusivamente nei nuclei cellulari e assente dai cromocentri.

Nella retina P0, entrambi i segnali 5mC e 5hmC erano presenti nello strato esterno dei neuroblasti e nello strato interno dei neuroblasti. Il segnale 5mC era forte nei cromocentri e nella periferia nucleare dei nuclei cellulari e più debole tra i cromocentri dei nuclei cellulari. La colorazione 5hmC era limitata al nucleo cellulare.

Nella retina P15, nello strato nucleare esterno, il segnale 5mC è stato rilevato nei cromocentri dei nuclei cellulari e nella periferia nucleare. Mentre il segnale 5hmC era in tutti i nuclei cellulari ad eccezione dei cromocentri. Nello strato interno delle cellule nucleari e ganglionari, il segnale di 5mC era forte nei cromocentri dei nuclei cellulari e debole nei nuclei di intere cellule.

Mentre il segnale 5hmC è stato trovato in tutti i nuclei cellulari ad eccezione dei cromocentri. Nei fotorecettori dei bastoncelli adulti, il segnale 5mC era limitato al cromocentro e alla periferia nucleare, mentre il segnale 5hmC era limitato alla periferia nucleare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di trattare le sezioni istologiche con l'esposizione ottimale di HCl, che è di 30 minuti.

Se l'esposizione è inferiore o superiore, i risultati ottimali non possono essere riproducibili. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cromatografia liquida ad alta pressione, la spettrometria di massa per rispondere a ulteriori domande come la quantificazione delle variazioni nella misurazione della 5-metilcitosina e della 5-idrossimetilcitosina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo neurale per esplorare i cambiamenti epigenetici nella cromatina.

Non dimenticare che lavorare con HCl e PFA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come il corretto smaltimento.