Name: Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri un metodo senza cellule feeder per differenziare cellule staminali epiteliali limbari corneali da cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo consente la produzione efficiente di cellule di qualità clinica per terapie cellulari corneali.

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Lo studio è stato sostenuto dell'Accademia di Finlandia (concessione numero 297886), il programma di pezzi di ricambio umani di Tekes, l'agenzia finlandese di finanziamento per la tecnologia e l'innovazione, l'occhio finlandese e Tissue Bank Foundation e la Fondazione culturale finlandese. Gli autori ringraziano i tecnici di laboratorio biomedico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä per assistenza tecnica eccellente e contributo alla coltura delle cellule. Professor Katriina albanese è riconosciuto per fornire il hiPSC linea utilizzata e BioMediTech Imaging Core facility per la fornitura di apparecchiature per l'imaging di fluorescenza.

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<li>Hanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cells+onto+a+partially+wounded+human+cornea+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+corneal+epithelial+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+dermal+fibroblast+and+corneal+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).</li>
<li>Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+epithelial+tissues+generated+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).</li>
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<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
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<li>Ojala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-Specific+Phenotypes+in+hiPSC-Derived+Cardiomyocytes+Carrying+Either+Myosin-Binding+Protein+C+Or+%CE%B1-Tropomyosin+Mutation+for+Hypertrophic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).</li>
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<li>Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7, 41286(2017).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il risultato previsto del presente protocollo è la generazione robusta e di successo di LESCs da una sospensione unicellulare di FF hPSC entro circa 3,5 settimane. Come epitelio corneale si sviluppa dalla superficie ectoderma29, il primo passo del protocollo mira a sterzo hPSCs verso questo lignaggio. Un'induzione di breve 24h con trasformazione di fattore di sviluppo beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF sono utilizzati per indurre la differenziazione ectodermica, seguita da spunto di BMP-4 m...

La cornea trasparente sulla superficie oculare permette alla luce di entrare la retina e fornisce la maggior parte del potere refrattivo dell'occhio. Lo strato più esterno, l'epitelio cornea stratificato, è continuamente rigenerato con le cellule staminali epiteliali limbal (LESCs). Il LESCs risiedono nello strato basale delle nicchie limbal al corneoscleral giunzione1,2. LESCs mancano marcatori specifici e unici, quindi la loro identificazione richiede un'analisi più ampia di una serie di markers putativi. P63 di fattore di trascrizione epiteliale e soprattutto N-terminalmente troncato trascrizione dell'isoforma alfa di p63 (ΔNp63α), è stato proposto come un rilevante positivo LESC segnapunti3,4. Divisione asimmetrica di LESCs permette loro di auto-rinnovarsi, ma anche produrre progenie che migrano centripeto e anteriormente. Come le cellule procede verso la superficie cornea hanno gradualmente perdere loro staminalità e infine terminalmente differenziare a cellule squamose superficiali che vengono continuamente perse dalla superficie cornea.
Danno ad uno qualsiasi degli strati corneali può portare a grave deficit visivo, e i difetti corneali sono dunque una delle principali cause di perdita di visione in tutto il mondo. Nella mancanza limbal della cellula formativa (LSCD), il limbus è distrutto da malattia o trauma che porta a conjunctivalization e opacizzazione della superficie corneale e la conseguente perdita di visione5,6. Terapia di sostituzione cellulare usando gli innesti limbal autologhi o allogenici offre una strategia di trattamento per i pazienti con LSCD4,7,8,9. Tuttavia, raccolta innesti autologhi sopporta un rischio di complicazioni per l'occhio sano e tessuto erogatore scarseggia. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), in particolare cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), può servire come una fonte illimitata di cellule clinicamente rilevanti, comprese quelle cellule epiteliali corneali. HPSC-derivato LESCs (hPSC-LESCs) rappresentano quindi una fonte interessante di cellulare nuovo per terapia sostitutiva delle cellule oculari.
Tradizionalmente, sia i metodi di coltura hPSC indifferenziato ed i loro protocolli di differenziazione di LESCs hanno fatto affidamento sull'uso di cellule di alimentatore indefinito, sieri animali, terreni condizionati o membrane amniotiche10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, gli sforzi verso prodotti di terapia cellulare più sicuri hanno spinto alla ricerca di più protocolli standardizzati e xeno-libero Cultura e differenziazione. Di conseguenza, diversi metodi definiti e privo di xeno per coltura a lungo termine di hPSCs indifferenziato ora sono commercialmente disponibili16,17,18. Come un continuum, differenziazione diretto protocolli basandosi su indizi molecolare per guidare l'hPSCs al destino epiteliale cornea sono stati recentemente introdotti19,20,21,22, 23. Ancora molti di questi protocolli utilizzati entrambi hPSCs alimentatore basata indefinita, come materiale, o fattore di crescita del complesso, xenogeniche cocktail per differenziazione di partenza.
Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un robusto, ottimizzato, xeno- e metodo di coltura hPSC privo di alimentatore e successiva differenziazione di LESCs corneale. Cultura dello strato monomolecolare di pluripotent hPSCs il laminin-521 (LN-521) matrice in mezzo hPSC definito, privo di albumina (in particolare essenziale 8 Flex) permette la rapida produzione di materiale omogeneo partenza per differenziazioni. Da allora in poi una semplice strategia di differenziazione in due fasi guide hPSCs verso la superficie ectodermico destino in sospensione, seguita da differenziazione aderente a LESCs. Una popolazione di cellule dove > 65% express ΔNp63α è ottenuta entro 24 giorni. Il protocollo privo di xeno e alimentatore è stato testato con diverse linee di hPSC (hESC e hiPSCs), senza alcun requisito per ottimizzazione specifica cella linea. I protocolli per il week-end senza manutenzione, passaggio, cryostoring e hPSC-LESC phenotyping qui descritte consentono la produzione di grandi lotti di LESCs di alta qualità per cliniche o scopi di ricerca.

<table><tbody><tr><td>Materiale/Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS contenente Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare da 100 mm</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Formato recipiente per coltura hPSC-LESC aderente piastra di differenziazione</td></tr><tr>a<td>12 pozzetti</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Formato del recipiente di coltura per campioni IF</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Formato del recipiente di coltura per campioni IF</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti, attacco ultrabasso</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Formato del recipiente di coltura per induzione in sospensione coltura</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-topo Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Anticorpo secondario per IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-coniglio Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Anticorpo secondario per IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-capra</td><td>Ig ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Anticorpo secondario per IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-topo Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Anticorpo secondario per IF</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF, umano)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>FGF-basico umano ricombinante senza animali (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fix/Permeabilizzazione Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>Soluzione di fissazione e permeabilizzazione per citometria a flusso</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Washing Buffer for flow cytometry</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo citocheratina 12</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Anticorpo primario per</td></tr><tr><td>l'anticorpo IF Citocheratina 14</td><td>R & Sistemi D</td><td>#MAB3164</td><td>Anticorpo primario per</td></tr><tr><td>l'anticorpo IF Citocheratina 15</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Anticorpo primario per IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>Terreno di coltura per la differenziazione aderente hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Collagene di tipo IV (umano)</td><td>Sigma-Aldrich#C5533</td><td></td> <td>Collagene placentare umano di tipo IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Contenitore di congelamento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Provette CryoPure</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>1,6 mL criotubo per crioconservazione hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina definito</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit Essential 8 Flex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminina 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Lamina umana ricombinante 521</td></tr><tr><td>&Delta; NP63&alfa; anticorpo</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Anticorpo primario per IF</td></tr><tr><td>OCT3/4 anticorpo</td><td>R& Sistemi D</td><td>#AF1759</td><td>Anticorpo primario per l'anticorpo IF</td></tr><tr><td>p63&alfa;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#ACI3066A</td><td>Anticorpo primario per IF</td></tr><tr><td>p63-&alfa; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha; Anticorpo coniugato PE per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anticorpo PAX6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Anticorpo primario per IF</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>Fissativo cellulare per IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>Mountant DAPI per hard montaggio per</td></tr><tr><td>Kit di crioconservazione IF PSC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s Eagle modificato' s medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Agente di permeabilizzazione per IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>Mountant DAPI per montaggio di liquidi per IF</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge, es. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso, ad es. BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza, ad esOlympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Le cellule staminali epiteliali limbal corneale (LESCs) sono responsabili per rinnovare continuamente l'epitelio corneale e mantenendo così l'omeostasi cornea e la chiarezza visiva. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-derivata LESCs forniscono una promettente fonte di cellule per terapia sostitutiva delle cellule corneali. Indefinito, xenogeniche cultura e differenziazione condizioni causano variazione nei risultati di ricerca e ostacolano la traslazione clinica terapeutica hPSC-derivato. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per il differenziamento di hPSC-LESC in condizioni senza cellula xeno - e alimentatore. In primo luogo, cultura dello strato monomolecolare di hPSC indifferenziato il ricombinante laminin-521 (LN-521) e definito hPSC medio costituisce la base per la produzione di robusta di alta qualità materiale di partenza per differenziazioni. In secondo luogo, un metodo di differenziazione rapida e semplice hPSC-LESC produce popolazioni LESC in soli 24 giorni. Questo metodo include un'induzione superficie ectodermica di quattro giorni in sospensione con piccole molecole, seguita dalla fase di coltura aderente sulla matrice di combinazione di LN-521/collagene IV nel mezzo di differenziazione epiteliale corneale definiti. Cryostoring e differenziazione estesa ulteriormente purifica la popolazione delle cellule e consente bancari delle cellule in grande quantità per i prodotti di terapia cellulare. La risultante hPSC-LESCs di alta qualità forniscono una potenziale strategia di trattamento novello per la ricostruzione della superficie corneale per il trattamento di mancanza limbal della cellula formativa (LSCD).

Da hPSCs a hPSC-LESCs
L'intero processo dall'induzione della differenziazione di hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs prende circa 3,5 settimane. Descrizione schematica del metodo differenziazione evidenziando i passi chiavi è presentato in Figura 1A. Figura 1B Mostra morfologie tipiche delle popolazioni di cellule in diverse fasi del protocollo. I dati presentati sono ottenu...

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Questo protocollo ha introdotto un metodo definito privo di cellule feeder per differenziare le cellule staminali epiteliali limbali corneali dalle cellule staminali pluripotenti umane. Le cellule staminali epiteliali limbali sono responsabili del rinnovo dell'epiteliale corneale nell'occhio sano. Il danno a queste cellule porta a una condizione nota come carenza di cellule staminali limbali e alla perdita di chiarezza corneale.I metodi di coltura cellulare qui mostrati consentono una produzione efficiente di cellule staminali epiteliali limbali per future terapie sostitutive delle cellule corneali. Per iniziare, passare e mantenere l'alimentatore libero coltura di cellule staminali pluripotenti umane come delineato nel protocollo di testo. Assicurarsi di utilizzare solo cellule staminali pluripotenti umane di alta qualità come materia prima per le differenziazioni.Quando è pronto a indurre la formazione del corpo embrionale, riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare. Staccare le cellule staminali pluripotenti umane libere dall'alimentatore alla sospensione aggiungendo 500 microlitri di EDTA di tripina senza xeno ad og

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Questo protocollo descrive come produrre cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) da cellule staminali pluripotenti. Il metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e di piccole molecole per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in RPE immaturi in quattordici giorni e RPE maturo, funzionale dopo tre mesi.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

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Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Qui presentiamo un protocollo per ottenere sospensioni monocellulari di alta qualità da intere cornee di topo attraverso la digestione sequenziale con collagenasi A e tripsina. Questo metodo produce cellule singole vitali con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come il sequenziamento a RNA a singola cellula e il citometroa flusso y.

Un protocollo per il prelievo della sospensione a singola cellula dalle cornee dei topi

Scopri un metodo senza cellule feeder per differenziare cellule staminali epiteliali limbari corneali da cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo consente la produzione efficiente di cellule di qualità clinica per terapie cellulari corneali.

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