Reometria forza-morsetto per la caratterizzazione di idrogel a base di proteine

I principali vantaggi di questa tecnica sono che utilizza un PID, che è un sistema derivativo integrale proporzionale per applicare protocolli a forza controllata a campioni di idrogel proteico, e utilizza un piccolo volume di campione. I protocolli per il clamp delle forze consentono un'interpretazione diretta dei dati, mentre volumi bassi sono fondamentali quando si lavora con proteine difficili da produrre che sono disponibili solo in piccole quantità. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo e alla caratterizzazione di nuovi materiali biometrici con elasticità duratura, utilizzando le caratteristiche di transizione di ripiegamento verso il basso e di ripiegamento per le proteine.

Questo metodo può rispondere a domande di meccanica dei tessuti e dei biomateriali consentendo la misurazione di miliardi di molecole proteiche in un solo tiro e simulando ambienti affollati specifici per i tessuti biologici. Iniziare questa procedura con la preparazione delle soluzioni di reagente come descritto nel protocollo di testo. Per sintetizzare l'idrogel a base di proteine, prima fissare un ago calibro 23 su una siringa da un millilitro con uno stantuffo premuto.

Quindi, tagliare un tubo di politetrafluoroetilene, o PTFE, da 10 centimetri usando una lama di rasoio. Collegare l'ago e la siringa a un'estremità del tubo in PTFE. Inserire la seconda estremità del tubo in una soluzione silana e riempire il tubo ritraendo lo stantuffo della siringa.

Lasciare il tubo per circa 30 minuti. Quindi, rimuovere la soluzione di silano e asciugare il tubo con aria compressa. Ora, mescolare la soluzione proteica con APS e tris(bipiridina)rutenio (II) cloruro in una provetta da 1,5 millilitri utilizzando un rapporto di volume costante.

Agitare la soluzione fotoattiva fino a quando non è completamente miscelata. Quindi, centrifugare la miscela alla massima velocità per eliminare eventuali bolle dalla soluzione. Durante il caricamento della miscela fotoattiva di idrogel nel tubo di teflon possono formarsi delle bolle, con conseguente danneggiamento del campione.

Per evitare la formazione di bolle, mantenere l'estremità del tubo di teflon nella miscela di soluzione durante il processo di caricamento e ritrarre lentamente lo stantuffo della siringa. Inserire l'estremità aperta del tubo di PTFE trattato nella miscela fotoattiva e aspirare la soluzione nel tubo ritraendo lo stantuffo della siringa. Ora, posiziona il tubo carico a circa 10 centimetri di distanza da una lampada al mercurio da 100 watt per evitare che si riscaldi e tienilo lì per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il tubo dall'ago e tagliare i bordi del tubo vicino alle estremità dell'idrogel con una lama di rasoio. Quindi, utilizzare un ago smussato calibro 24 per estrudere l'idrogel nella soluzione Tris. Ispezionare visivamente i gel per individuare eventuali difetti che potrebbero formarsi durante l'estrusione o dovuti a bolle ed eliminare eventuali gel difettosi.

Avviare il programma di controllo dello strumento e accendere il motore della bobina mobile. Quindi, impostare la posizione della bobina su un valore verso la fine dell'intervallo. Spostare i ganci in direzione Z e allinearli alla curva in direzione X.

Quindi, registrare i valori delle viti micrometriche per la direzione X. Ora, fai un doppio nodo allentato all'estremità del filo di sutura, in modo tale che il diametro dell'anello sia di circa quattro millimetri. Quindi, taglia l'anello dal filo.

Ripetere per formare un secondo anello. Quindi, posizionare i due anelli sul gancio collegato al sensore di forza. Riempire la camera sperimentale con tampone Tris e trasferire il campione di idrogel nella camera riempita utilizzando una pinzetta medica.

Posizionare la bobina mobile e i ganci del sensore di forza vicino alla superficie della soluzione e allineare i ganci in tutte le direzioni con i manipolatori di posizionamento XYZ. Utilizzando una pinzetta medica, appendere entrambi i lati del campione di idrogel proteico ai ganci collegati alla bobina mobile e al sensore di forza. Un errore tipico è un serraggio eccessivo degli anelli di sutura attorno ai campioni di idrogel durante il processo di fissaggio.

Ciò può portare alla formazione di una tacca e al taglio del campione di idrogel. Stringere con cura un anello di sutura attorno all'idrogel sample sul gancio della bobina mobile tenendo entrambe le estremità dell'anello di sutura con una pinzetta medica e tirandole contemporaneamente. Ripetere questo passaggio per l'anello collegato al sensore di forza.

Stringere gli anelli di sutura sulle curve di ciascun gancio per evitare qualsiasi scivolamento. Utilizzare queste curve come punti di riferimento per trovare la separazione zero tra i ganci. Tagliare le lunghezze in eccesso delle suture usando le forbici mediche.

Spostare l'idrogel attaccato utilizzando i manipolatori Z lungo l'asse Z verso la camera sperimentale per immergere l'idrogel nella soluzione sperimentale. Allineare il campione di idrogel in YZ utilizzando i manipolatori in modo tale che il gel non sia sottoposto ad alcuna sollecitazione. Azzerare il sensore di forza e separare i due ganci utilizzando gli stadi micrometrici X fino a quando il gel inizia a sperimentare forza.

Una volta che ciò accade, ruotare leggermente indietro la vite del micrometro in direzione X. Registrare la posizione di entrambi i manipolatori per il motore della bobina mobile e il sensore. Quindi, utilizzare la differenza tra questi valori e quelli precedentemente misurati per calcolare l'esatta separazione tra i ganci di ancoraggio all'inizio dell'esperimento.

Per eseguire un ciclo di forza-rampa aumentando la forza alla velocità di carico desiderata, inserire i valori di forza iniziale e finale, nonché la durata del protocollo, che appare come una V capovolta, seguita da una forza bassa costante per circa 200 secondi per consentire ai domini proteici di ripiegarsi prima del ciclo successivo. Eseguire un protocollo a forza costante applicando una forza bassa per 30 secondi. Quindi, aumentare la forza a una forza costante per un periodo di tempo definito, quindi spegnere la forza allo stesso valore basso per più di 300 secondi per consentire ai domini proteici di ripiegarsi e all'elasticità del gel di recuperare.

Infine, eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Ogni misurazione inizia con una curva allentata. Inserendo due linee, si determina la forza zero sul sensore e la lunghezza reale del gel.

La lunghezza reale del gel viene calcolata dall'intersezione degli accoppiamenti e dalla posizione delle viti micrometriche. Il sistema di reometria force-clamp può applicare due diversi tipi di protocolli. Nella modalità di rampa di forza, il campione di idrogel sperimenta un protocollo di variazione della forza con il tempo che assomiglia a una modalità di forza invertita V.In costante, la sollecitazione applicata cambia in uno schema a gradini.

Durante le misurazioni, il sistema PID regola l'estensione dell'idrogel modificando la posizione della bobina per seguire il set point predefinito dal protocollo di forza. La deformazione viene quindi calcolata dividendo l'estensione misurata per la lunghezza reale del gel. La sollecitazione viene determinata dividendo la forza applicata all'area della sezione trasversale del campione di idrogel.

Le tracce della rampa di forza sono meglio rappresentate come sollecitazione rispetto alla deformazione. Il modulo di Young può essere calcolato dalla misura della pendenza durante la fase di carico. L'isteresi fornisce la dissipazione di energia proveniente dal dispiegamento e dal ripiegamento della proteina.

Le tracce di forza costante sono meglio rappresentate in funzione del tempo. La variazione della deformazione può essere utilizzata per misurare le velocità di dispiegamento e ripiegamento inserendo un doppio esponenziale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di asciugare il silano dalla provetta prima di aggiungere la proteina, di centrifugare la miscela proteica per rimuovere le bolle, di controllare le bolle dopo aver iniettato la miscela proteica all'interno della provetta e di scartare eventuali idrogel danneggiati meccanicamente dopo l'estrusione dalla provetta.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà all'inizio ad attaccare i gel ai ganci utilizzando le suture chirurgiche senza causare danni al campione di idrogel. Anche l'estrusione del gel dal tubo può danneggiare l'idrogel. Questo metodo consente l'applicazione di protocolli a forza costante su campioni di idrogel a basso volume.

Questi esperimenti consentono il disaccoppiamento dei comportamenti elastici e viscoelastici e lo studio della meccanica di unfolding e folding delle proteine in un approccio di massa. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle scienze dei materiali di esplorare nuovi biomateriali morbidi come gli idrogel ingegnerizzati a base di poliproteine che hanno un eccellente potenziale per fungere da scaffold di ingegneria tissutale, sistemi di somministrazione di farmaci e inchiostro biologico per la stampa 3D. Questo metodo non solo fornisce informazioni sulla meccanica degli idrogel a base di proteine, ma può anche essere applicato ad altri sistemi come la misurazione della risposta isometrica delle fibre muscolari o dell'elasticità di tessuti come la pelle.