Name: Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri come modificare vettori di espressione di baculovirus per produrre proteine vegetali secrete nelle cellule di insetto. Questo metodo a basso costo facilita la cristallografia e la cryo-EM per la biologia strutturale.

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Questo lavoro è stato supportato dai nuovi fondi avvio facoltà da North Carolina State University per Guozhou Xu.

Nota: Viene utilizzato un sistema di insetto cella/baculovirus con vettori di espressione modificate per l'espressione della proteina secretoria pianta e cristallizzazione.
1. modifica di un vettore di espressione di Baculovirus con il Peptide di segnale GP67 per espressione di secrezione della proteina vegetale
<ol><li>Sintetizzare un frammento di DNA contenente un 5' BglII taglio sito13, la sequenza di segnale di secrezione GP67 e un sito multi-clonazione con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (Figura 1A). Nota: Poiché sia BglII e BamHI digerito DNA ha provocato la stessa estremità adesive, il vettore linearizzato può legare per il frammento di DNA digerito, mentre BglII sia BamHI siti nella sequenza di legatura ricotto saranno mutati ad una sequenza che non è spaccabili da BglII o BamHI14.</li>
	<li>Digest 4 µ g di DNA con BglII e XhoI e 4 µ g di un vettore di espressione del DNA con BamHI e XhoI14. Mescolare 10 unità di ciascun enzima di restrizione con il DNA in un 1 x concentrazione tampone di reazione (acetato di potassio 50 mM, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubare la miscela a 37 ° C per 4 h.<ol>
<li>Purificare il frammento di DNA asportato e il vettore linearizzato DNA da un DNA estrazione gel kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente 1x tampone di reazione T4 DNA ligasi (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2, ATP di 1 mM e 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.</li>
	<li>Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB16. Prendere 5-10 colonie e crescere ogni colonia in 2 mL di terreno LB contenente 100 ampicillina µ g/mL a 220 giri/min e 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 16 h.</li>
	<li>Estrarre ogni DNA plasmidico con un DNA miniprep kit17 e confermare i cloni di sequenziamento del DNA con un primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplificare il gene TDR di a. thaliana frammento codifica residui 30-642 da un gene sintetico TDR costruire (forward primer: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, reverse primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplificare il DNA per 30 cicli in un buffer di reazione della polimerasi del DNA che contiene una miscela del dNTP 0,5 mM, 0,2 µ m di primer, 0.1 µ g di DNA campione, 0,4 mM MgCl2e 1 unità di reazione della polimerasi del DNA.<ol>
<li>Per i passaggi del ciclo PCR, impostare la denaturazione iniziale a 95 ° C per 30 s e poi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, ricottura a 55 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 1 min, con un'estensione finale a 72 ° C per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerire il frammento della PCR sia il vettore modificato con gli enzimi di endonucleasi di restrizione NotI e BamHI. Legare il frammento genico con il vettore linearizzato. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente tampone di reazione di T4 DNA ligasi e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.</li>
	<li>Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB16. Confermare il corretti cloni di sequenziamento del DNA.</li>
</ol>2. modifica di un vettore di espressione di Baculovirus con il Peptide di segnale Hemolin insetto per espressione di secrezione della proteina vegetale
<ol><li>Sintetizzare un frammento di DNA contenente un 5' BglII taglio sito13, la sequenza di segnale di secrezione dell'insetto hemolin e un sito multi-clonazione con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (Figura 1B).</li>
	<li>Digest 4 µ g di DNA con BglII e XhoI e 4 µ g di un vettore di espressione del DNA con BamHI e XhoI14. Mescolare 10 unità di ciascun enzima di restrizione con il DNA in un 1 x concentrazione tampone di reazione (acetato di potassio 50 mM, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubare la miscela a 37 ° C per 4 h.<ol>
<li>Purificare il frammento di DNA asportato e il vettore linearizzato DNA da un DNA estrazione gel kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente 1x tampone di reazione T4 DNA ligasi (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2, ATP di 1 mM e 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.</li>
	<li>Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α e selezionare le colonie su una piastra di agar di ampicillina-LB. Prendere 5-10 colonie e crescere ogni colonia in un medium LB 2 mL contenente 100 µ g/mL di ampicillina a 220 giri/min e 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 16 h.</li>
	<li>Estrarre il DNA plasmidico con un DNA miniprep kit17 e confermare i cloni di sequenziamento del DNA con un primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplificare a. thaliana polline del ricevitore della chinasi 3 (PRK3) gene frammento di codifica residui 20-237 da una costruzione di gene PRK3 sintetica (forward primer: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, reverse primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplificare il DNA per 30 cicli in un buffer di reazione della polimerasi del DNA che contiene una miscela del dNTP 0,5 mM, 0,2 µ m di primer, 0.1 µ g di DNA campione, 0,4 mM MgCl2e 1 unità di reazione della polimerasi del DNA.<ol>
<li>Per i passaggi del ciclo PCR, impostare la denaturazione iniziale a 95 ° C per 30 s e poi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, ricottura a 55 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 30 s all'interno di ogni ciclo e l'estensione finale a 72 ° C per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerire il frammento della PCR sia il vettore modificato con gli enzimi di endonucleasi di restrizione NotI e BamHI. Legare il frammento genico con il vettore linearizzato. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente tampone di reazione di T4 DNA ligasi e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.</li>
	<li>Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB16. Confermare il corretti cloni di sequenziamento del DNA.</li>
</ol>3. produzione e amplificazione di Baculovirus costruisce Harboring la cassetta di espressione di proteine ricombinanti
<ol><li>Uso 100 ng di plasmide costrutto per trasformare 40 µ l di cellule competenti di DH10Bac seguendo il protocollo del baculovirus espressione sistema1. Incubare le piastre di trasformazione a 37 ° C per 48 h.</li>
	<li>Prendi due colonie bianchi da ogni piatto di trasformazione, inoculare ogni colonia in 2 mL di terreno LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina e la tetraciclina di 10 µ g/mL. Seguire il protocollo del baculovirus espressione sistema1 per estrarre e verificare la bacmid del DNA. Aliquotare ogni DNA in due tubi con 20 µ l ciascuna e conservare i capillari a-20 ° C. Nota: Le operazioni seguenti richiedono un'operazione asettica.</li>
	<li>Crescere un monostrato di cellule Sf9 in terreni di coltura con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina a 27 ° C a 80% confluenza in una piastra a 6 pozzetti. Una stima della percentuale di confluenza sulla base della percentuale di area coperta sulla piastra di coltura del tessuto.</li>
	<li>Preparare le seguenti soluzioni in due provette da 1,5 mL sterile.<ol>
<li>Filmato 1: Per ogni trasfezione, diluire 20 µ l di bacmid DNA in 100 µ l di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Mescolare delicatamente la diluizione, spostando il lato del tubo.</li>
		<li>Filmato 2: Per ogni trasfezione, diluire 8 µ l di reagente di transfezione di lipidi in 100 µ l di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Mescolare accuratamente la diluizione pipettando su e giù per 6 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinare le due soluzioni, mescolarle delicatamente pipettando lentamente su e giù per 3 volte e li Incubare per 20-40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare ogni pozzetto di strato monomolecolare Sf9 cellule 2x con 3 mL di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Per ogni trasfezione, aggiungere 0,8 mL di mezzo di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici in ogni provetta contenente la miscela di lipidi-DNA. Mescolare delicatamente il contenuto delle provette pipettando lentamente su e giù per 3 volte. Aspirare i media di lavaggio dalle piastre e i campioni con la miscela di transfezione di sovrapposizione.</li>
	<li>Dopo l'aggiunta della miscela di transfezione, incubare la piastra trasfettata per 5 ore a 27 ° C. Sostituire il supporto di transfezione con il mezzo di coltura cellulare Sf9 completo contenente 10% FBS e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina. Incubare la piastra trasfettata a 27 ° C per 4 d.</li>
	<li>Raccogliere e amplificare il baculovirus ricombinanti.<ol>
<li>Raccogliere il surnatante della piastra infetto in una provetta conica sterile di 15 mL dopo 4D di incubazione. Girare il supernatante a 1010 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Scartare il pellet e decantare il supernatante in una provetta pulita e conservarla a 4 ° C fino a 1 anno. Nota: Questo è il virus di P0. Può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per un periodo di tempo più lungo.</li>
		<li>Per amplificare ogni virus ricombinante, crescere un monostrato di cellule Sf9 su una zolla di 150 mm fino a 80% confluenza. Aspirare i media dalla piastra, aggiungere 2 mL di virus P0 per l'aderente di cellule alla piastra e incubare la piastra per 1h in un'incubatrice di 27 ° C. Per mescolare il mezzo con le cellule della roccia la piastra ogni 15 min.<ol>
<li>Aggiungere 25 mL di media di Grace completo contenente 10% FBS e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina. Incubare la piastra per 3 d in un'incubatrice di 27 ° C per ottenere il virus di passaggio P1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere il surnatante della piastra infetto in una provetta conica sterile da 50 mL e spin a 1010 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Decantare il supernatante in una provetta pulita e conservarla a 4 ° C fino a 1 anno. Nota: Il virus P1 può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per un periodo di tempo più lungo.</li>
		<li>Per amplificare il virus da P1 a P2 passaggio, crescere un monostrato di cellule Sf9 su una zolla di 150 mm fino a 90% confluenza, aspirare il supporto della piastra, aggiungere 2 mL di virus P1 alla piastra e incubare per 1 h in un'incubatrice di 27 ° C.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.8.2 e 3.8.3 per ottenere i passaggi P2 e P3 dei virus. Non conservare il virus P3 per più di 2 mesi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. protein Expression, purificazione con NiNTA e cristallizzazione
<ol><li>Coltura in 1 L di cellule di insetto Hi5 in terreni di coltura con 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina ad una densità di 2 x 106 a 100 giri/min in uno shaker incubatore di 27 ° C. Rotazione verso il basso le cellule a 570 x g per 5 min, decantare il supernatante, risospendere le cellule in 20 mL di recente prodotte P3 virus e tenerlo a temperatura ambiente per 1 h. Agitare delicatamente la bottiglia di spin per risospendere le cellule 1 x ogni 15 min.</li>
	<li>Trasferire le cellule a 1 L di antibiotici penicillina-streptomicina cultura media con 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL), coltura le cellule a 100 giri/min in uno shaker incubatore di 27 ° C per 72 h. Spin giù le cellule a 1.010 x g per 5 min e raccogliere il surnatante.</li>
	<li>Strisce indicatrici di pH di uso regolare il pH del surnatante a 8.0 aggiungendo 0.1 M HCl o NaOH M 0.1 e aggiungere buffer di associazione ad una concentrazione finale, contenente 20 mM di tampone Tris pH 8.0, NaCl 100 mM e imidazolo di 5 mM. Aggiungere una certa quantità di resina NiNTA (10-40 mL) basata sul rendimento stimato della proteina ricombinante His-tag espressa.<ol>
<li>Miscelare la soluzione su scalpore magnetico con bassa velocità a 4 ° C per 1 h. lavare la resina ed eluire la proteina associata seguendo la norma NiNTA purificazione protocollo18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sottoporre la proteina purificata a scambio ionico e gel cromatografia di filtrazione, così come altri metodi di purificazione di proteine, per ottenere un campione omogeneo. Nota: Per il ectodomain TDR, 20 mM Tris, pH 8, NaCl 100 mM sono stati usati come buffer di gel filtrazione. Per il ectodomain di PRK3, 20 mM bis-Tris, pH 6, NaCl 100 mM sono stati usati come il buffer di comodo gel filtrazione.</li>
</ol>

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<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li>
<li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li>
<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'eterogeneità nella dimensione e nella stabilità delle migliaia di proteine presenti nei sistemi biologici, è spesso empirico per una ricerca di laboratorio per decidere quale sistema di espressione eterologa deve essere scelto per l'espressione di una proteina specifica. Il sistema di espressione di e. coli è spesso la prima scelta per l'espressione della proteina a causa del breve ciclo di vita dei batteri, basso costi dei terreni di coltura e relativa facilità di scalare fino19. Per l...

È indispensabile per un laboratorio di ricerca essere in grado di produrre grandi quantità di proteine ricombinanti omogenei per le caratterizzazioni biochimiche e biofisiche, soprattutto per studi cristallografici dei raggi x. Ci sono molti sistemi di espressione eterologa affermati quali Escherichia coli, lieviti, cellule di insetto, cellule di mammifero, cellule vegetali, ecc tra loro, il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei più comunemente utilizzato tecniche per produrre grandi quantità di proteine eucariotiche ricombinanti grandi strutturalmente piegate per proteina cristallizzazione1.
I vettori di espressione del sistema di espressione di baculovirus sono progettati per contenere una forte polyhedrin o promotore di P10 per produrre un rendimento elevato di proteine intracellulari ricombinanti2,3. Per rendere un baculovirus ricombinanti, il gene di interesse è clonato in un insetto vettore contenente il locus polyhedrin (polh) del genoma di multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . Il costrutto risultante è quindi sequenziato e verificato il suo telaio di lettura aperto corretta (ORF). Il costrutto corretto è quindi introdotto nella cellula ospite dell'insetto attraverso il processo di trasfezione. Il gene di interesse viene inserito nel genoma virale di ricombinazione omologa. Questo evento provoca la produzione del genoma virale ricombinante, che poi replicati per produrre ricombinante germogliato virus particelle1.
Le cellule di insetto che sono più comunemente utilizzate nel sistema di espressione sono Sf9 e alta cinque celle (Hi5). SF9 cellule sono un isolato clonale di Sf21, derivati dalle cellule ovariche pupale di Spodoptera frugiperda, e Hi5 cellule sono un isolato clonale derivato da parentale Trichoplusia ni ovarico delle cellule linea TN-3684,5. Co-transfezioni, amplificazione di virus e le analisi di placca sono condotto su cellule Sf9, mentre le cellule Hi5 in genere sono selezionate per produrre maggiori quantità di proteine ricombinanti6. Vale la pena notare che le cellule di Hi5 non sono adatte per la generazione e l'amplificazione della progenie di virus a causa della loro tendenza a produrre virus mutante. Tradizionalmente, una gamma di temperatura di 25-30 ° C è considerata di essere buono per la coltivazione di cellule di insetto. Tuttavia, è stato segnalato che il 27-28 ° C è la temperatura ottimale per l'insetto cella crescita e infezione7,8.
L'introduzione di una sequenza di segnale forte precede il gene è necessario per l'alta espressione di proteine secrete. La sequenza del segnale in modo efficiente guiderebbe la proteina ricombinante tradotta in reticolo endoplasmico per la secrezione della proteina e modificazioni post-traduzionali necessarie per il corretto ripiegamento e stabilizzazione3. Sequenze di peptide segnale, come il baculovirus avvolgono proteina GP64/67, honeybee melittin e altri, sono stati scelti per facilitare l'espressione di proteine ricombinanti secretive in baculovirus-mediata espressione sistemi3. L'introduzione del peptide segnale di GP67 ha dimostrato di migliorare la resa di espressione di una proteina ricombinante secreta, in confronto con il peptide di segnale intrinseco del gene bersaglio9. Hemolin è una proteina di emolinfa della falena gigante seta Hyalophora cecropia, indotta a seguito di infezione di batteri10. A causa del relativamente alto livello di espressione indotta, la sequenza del peptide di segnale del gene utilizzabile per mediare l'espressione di secrezione delle proteine ricombinanti nel sistema di cellule di insetto baculovirus.
Il a. thaliana Tracheary elemento di differenziazione inibitorio fattore recettore (TDR) e polline del ricevitore della chinasi 3 (PRK3) entrambi appartengono alla famiglia pianta Leucine-rich Repeat Kinase Receptor-like (LRR-RLK) di proteine11,12 . Al fine di studiare la struttura e la funzione di questa famiglia di recettori proteine vegetali, nonché per facilitare la caratterizzazione biochimica e strutturale di altre proteine vegetali secernuta, il sistema di espressione di baculovirus-insetto cella è stato modificato per migliorare la resa di qualità e produzione di proteina. I domini extracellulari di TDR e di PRK3 sono state espresse con successo utilizzando due vettori di espressione modificata nel sistema di espressione di baculovirus-insetto cellule. Entrambi i domini extracellulari delle proteine TDR e PRK3 sono stati cristallizzati. Questo articolo segnala l'espressione e purificazione di grandi quantità di proteine ricombinanti vegetali secrete con vettori di espressione di baculovirus modificate due incorporando un GP67 o una sequenza di segnale hemolin tra il promotore e clonazione più siti.

<table><tbody><tr><td>Agitatore per incubatrice</td><td>VWR</td><td>Modello Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>VWR</td><td>Modello 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>BECKMAN</td><td>Modello J-6</td><td>con rotore a secchiello oscillante</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>Per l'amplificazione PCR del DNA</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>Modello C1000 Touch</td><td>Per l'amplificazione PCR dell'agitatore per</td></tr><tr><td>incubatore</td> di DNA <td>New Brunswick Modello scientifico</td><td>I 24</td><td>Per la coltivazione della coltura di baceria</td></tr><tr><td>Sintesi del DNA del cliente</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Endonucleasi di restrizione</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Endonucleasi di restrizione</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restrizione Endonucleasi</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restrizione Endonucleasi</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Legatura del DNA</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Purificazione del DNA dal gel di agorasa</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Purificazione del DNA plasmidico da coltura batterica</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Per l'elettroferosi su gel di DNA</td></tr><tr><td>MAX Efficienza DH5&alpha; cellula competente</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Per la trasformazione della miscela di legatura del DNA</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Per la produzione di colture batteriche</td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Kanamicina Solfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH10Bac cellule competenti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Per la produzione di bacmid DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Per la trasformazione del DNA</td></tr><tr><td>Reagente CellFECTIN II Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Reagente per trasfezione di cellule di insetti</td></tr><tr><td>Sistema di espressione Bac-to-Bac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Kit di espressione di cellule di baculovirus-insetti</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Per l'isolamento del contenente Bacmid DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Per l'isolamento del recominante Bacmid DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Vettore di espressione di Baculorirus</td></tr><tr><td>Sf9 cellule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Celle monostrato Sf9</td></tr><tr><td>Celle Hi5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five celle per insetti</td></tr><tr><td>Grace' s insetto medium, non integrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 trasfezione cellulare minimo</td></tr><tr><td>medium Grace' s terreno per insetti, integrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 terreno completo per colture cellulari monostrato</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 terreno per coltura cellulare in sospensione senza FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>terreno per colture cellulari Hi5</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 U.I./ml)</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Certificato FBS Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific 08-772-1B</td><td></td><td>Piastre a fondo piatto</td></tr><tr>da<td>150 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/confezione</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 provette/sacchetto</td></tr><tr><td>15 ml con tappo a vite conico provette da centrifuga</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 provette/sacchetto</td></tr><tr><td>50 ml con tappo a vite conico provette da centrifuga</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 provette/sacchetto</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA resina</td></tr><tr><td>strisce indicatrici di pH</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

modifica di vettori di espressione di baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

È stata una sfida per gli scienziati di esprimere proteine eucariotiche secretive ricombinanti per studi strutturali e biochimiche. Il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei sistemi utilizzati per esprimere proteine secretorie eucariotiche ricombinante con alcune modificazioni post-traduzionali. Le proteine secretorie devono essere instradati attraverso le vie secretive per glicosilazione della proteina, la formazione di legami disolfuro e altre modificazioni post-traduzionali. Per migliorare l'espressione delle cellule dell'insetto esistente di proteine secretorie vegetali, un vettore di espressione di baculovirus viene modificato con l'aggiunta di sia un GP67 o una sequenza del peptide segnale hemolin tra il promotore e il multiplo-clonazione siti. Questo sistema di nuova concezione modificate vettoriale prodotto con successo una resa elevata di proteine recettori solubili ricombinante pianta secreta di Arabidopsis thaliana. Due delle proteine espresse pianta, domini extracellulari dei recettori di membrana plasmatica di Arabidopsis TDR e PRK3, sono state cristallizzate per studi cristallografici dei raggi x. Il sistema vector modificate è un strumento migliorato che potenzialmente può essere utilizzato per l'espressione di proteine ricombinanti secretive nel Regno animale pure.

Come illustrato nella Figura 1, due vettori di espressione del baculovirus pFastBac1 modificate sono stati utilizzati per esprimere le proteine secrete con la GP67 o la sequenza segnale hemolin per sostituire la sequenza segnale intrinseco del gene target. il GP67 virale ed i geni di hemolin dell'insetto sono stati dimostrati per avere i livelli di espressione di alta secrezione nelle cellule. Proteine di fusione con uno di questi due sequenze di segnale si p...

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica e della biologia strutturale delle proteine secrete, come la determinazione della struttura proteica mediante cristallografia e crio-EM. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce una grande quantità di proteine secrete ricombinanti con un costo relativamente basso per la determinazione della struttura proteica. In primo luogo, sintetizzare un frammento di DNA contenente un sito di taglio BglII a cinque prime, la sequenza del segnale di secrezione di interesse in un sito di clonazione multipla come delineato nel protocollo di testo.Successivamente, digerire quattro microgrammi di DNA con BglII e X1 e quattro microgrammi di DNA vettore di espressione con BamH1 e X1. Mescolare 10 unità di ciascun enzima di restrizione con il DNA in un tampone di reazione a concentrazione 1X. Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Aggiungere 10 microlitri di una miscela di reazione di legatura contenente 1X tampone di reazione DNA Ligasi T4 e cinque unità di DNA Ligasi T4 a una nuova provetta Eppendorf da 1,5 millilitri.Quindi, aggiungere 100 nanogrammi di DNA vettoriale linearizzato e 400 nanogrammi del frammento di DNA digerito. Incubare a 16 gradi Celsius per 16 ore. Trasformare cinque microlitri della miscela di legatura in 100 microlitri di cellule DH5 alfa competenti e selezionare le colonie risultanti su una piastra di agar Ampicillina LB come indicato nel protocollo di testo.Scegli tra le cinque e le 10 colonie, trasferendo ciascuna in due millilitri di terreno LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Coltiva queste colonie in un'incubatrice vibrante a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 16 ore. Successivamente, utilizzare un kit DNA Miniprep per estrarre ogni DNA plasmidico.Confermare i cloni mediante sequenziamento del DNA con un primer di sequenziamento in avanti come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando 100 nanogrammi del plasmide costrutto, trasformare 40 microlitri di cellule competenti DH10Bac come indicato nel protocollo di testo. Incubare le piastre di trasformazione a 37 gradi Celsius per 48 ore.Raccogli due colonie bianche da ciascuna piastra di trasformazione e inocula ogni colonia in due millilitri di terreno LB contenente kanamicina, gentamicina e tetraciclina. Estrarre e verificare il DNA del bacmide come indicato nel protocollo di testo. Aliquotare ogni DNA in due provette con 20 microlitri trasferiti in ciascuna provetta.Quindi conservare i tubi a meno 20 gradi Celsius fino al momento di procedere. Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in modo asettico. In una piastra a sei pozzetti, far crescere un monostrato di cellule Sf9 nel terreno di coltura con il 10% di siero fetale bovino e 100 microgrammi per millilitro di antibiotici penicillina-streptomicina a 27 gradi Celsius all'80% di confluenza.Per ogni trasfezione, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare Sf9 non integrato senza antibiotici a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Diluire 20 microlitri di DNA bacmid in ogni provetta e mescolare delicatamente. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare Sf9 non integrato senza antibiotici a una provetta da 1,5 millilitri per ogni trasfezione.Diluire otto microlitri di reagente di trasfezione lipidica in ciascuna provetta e mescolare pipettando accuratamente su e giù sei volte. Combinare queste due soluzioni e mescolarle pipettando delicatamente su e giù lentamente tre volte. Incubare per 20-40 minuti a temperatura ambiente.Lavare due volte ogni pozzetto della piastra di coltura utilizzando tre millilitri di terreno di coltura Sf9 non integrato senza antibiotici per ogni lavaggio. Quindi, aggiungere 0,8 millilitri di terreno di coltura cellulare Sf9 non integrato senza antibiotici a ciascuna provetta contenente la miscela di DNA lipidico. Pipettare lentamente su e giù tre volte per mescolare.Aspirare il mezzo di lavaggio dalle piastre e sovrapporre i campioni con la miscela di trasfezione. Incubare la piastra trasfettata per cinque ore a 27 gradi Celsius. Successivamente, sostituire il terreno di trasfezione con il terreno di coltura cellulare Sf9 completo che contiene il 10% di FBS e 100 microgrammi per millilitro di antibiotici penicillina-streptomicina.Incubare a 27 gradi Celsius per quattro giorni. Quindi, raccogliere il surnatante in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Centrifugare a 1, 010 volte g per cinque minuti per rimuovere i detriti cellulari.Scartare il pellet e travasare il surnatante in un tubo pulito. Conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di un anno o fino al momento dell'uso. Per amplificare ogni virus ricombinante, è necessario far crescere prima un monostrato di cellule Sf9 su una piastra da 150 millimetri all'80% di confluenza.Quindi aspirare il terreno e aggiungere due millilitri del virus P0 a ciascun pozzetto. Incubare per un'ora in un'incubatrice a 27 gradi Celsius, facendo oscillare la piastra ogni 15 minuti per mescolare il terreno con le cellule. Successivamente, aggiungere 25 millilitri di Grace's Media completo contenente il 10% di FBS e 100 microgrammi per millilitro di antibiotici penicillina-streptomicina.Incubare la piastra per tre giorni in un'incubatrice a 27 gradi Celsius per ottenere il virus di passaggio P1. Successivamente, raccogliere il surnatante in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Centrifugare a 1, 010 volte g per cinque minuti per rimuovere i detriti cellulari.Decantare il surnatante in un tubo pulito e conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di un anno o fino al momento dell'uso. Per amplificare il passaggio del virus da P1 a P2, è necessario far crescere prima un monostrato di cellule Sf9 su una piastra da 150 millimetri al 90% di confluenza. Una volta raggiunta la confluenza desiderata, aspirare il fluido.Aggiungere due millilitri di virus P1 e incubare per un'ora in un'incubatrice a 27 gradi Celsius. Ripetere i passaggi di amplificazione per ottenere i passaggi P2 e P3 del virus. In questo studio, due vettori di espressione del baculovirus pFastBac1 modificati sono utilizzati per esprimere le proteine secrete con la sequenza segnale gp67 o con la sequenza segnale dell'emolina, sostituendo la sequenza segnale intrinseca del gene bersaglio.Il PBEC gp67 è utilizzato con successo per esprimere i domini extracellulari del recettore a-tal-leano TDR. Mentre l'emolina PBEC1 viene utilizzata con successo per esprimere il dominio extracellulare PRK3. Successivamente, le proteine purificate vengono concentrate a cinque milligrammi per millilitro e sottoposte a screening di cristallizzazione.Le condizioni che hanno prodotto cristalli preliminari per ciascuna proteina sono ottimizzate fino a quando non si osservano cristalli proteici più grandi di 20 micrometri. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che esaminano la qualità delle proteine mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, diffusione della luce multi-angolo e altri saggi per lo stato di non aggregazione della proteina ricombinante. Non dimenticare, di controllare la purezza della proteina anche mediante colorazione d'argento.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la cristallografia a raggi X e la crio-EM per rispondere a ulteriori domande, come le strutture tridimensionali della proteina prodotta. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare le proprietà strutturali, funzionali e biochimiche delle proteine secrete dalle piante e nei mammiferi. Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta per visualizzare le bande di DNA sul gel di agarosio può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare protezioni UV, visiera, occhiali per gli occhi, camice da laboratorio, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.Inoltre, durante la preparazione dei tamponi, fare attenzione quando si maneggiano acidi e basi forti.

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