Name: Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Scopri la preparazione di liposomi antigenici per stimolare l'attivazione dei linfociti B in vitro e in vivo. Questo metodo robusto utilizza un modello murino di allergia alle arachidi con varianza ridotta.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).

<ol><li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence%2C+severity%2C+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li>
<li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((US+prevalence+of+self-reported+peanut%2C+tree+nut%2C+and+sesame+allergy%3A+11-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li>
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<li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).</li>
<li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).</li>
<li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy%3A+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li>
<li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+%28STOP+II%29%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li>
<li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li>
<li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li>
<li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li>
<li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li>
<li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea%2C+Ara+h+2+and+Ara+h+6%2C+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li>
<li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li>
<li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li>
<li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li>
<li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li>
<li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).</li>
<li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG%2Fpeanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li>
<li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
<li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+myasthenia+gravis%3A+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+General+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li>
<li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi descritti qui sono un protocollo generale per la coniugazione di una proteina di un lipide che consente la visualizzazione della proteina sulle nanoparticelle liposomiale. Per le proteine multi-unità secondaria molto grande, questo protocollo potrebbe aver limitato l'utilità. Il metodo ideale sarebbe l'introduzione di un tag site-specific che consente una strategia di collegamento chimico biortogonali essere utilizzato. Se esprimenti la proteina recombinantly, questo può essere possibile utilizzando strategie si...

Allergia alimentare colpisce l'8% dei bambini negli Stati Uniti e ha aumentato in prevalenza negli ultimi dieci anni1. Allergia alle arachidi colpisce l'1% dei bambini e non è in genere sovrasviluppata2. Anche se parecchi test clinici promettenti sono in corso per il trattamento di allergia alimentare, tra cui l'immunoterapia orale (OIT), l'immunoterapia sublinguale (SLIT) e immunoterapia epicutaneous (EPIT), non ci sono attualmente senza strategie di trattamento approvato dalla FDA per desensibilizzazione individui allergici arachidi3,4,5,6,7,8. Di conseguenza, individui allergici devono rigorosamente evitare allergeni per evitare anafilassi. Molte domande rimangono riguardanti percorsi di sensibilizzazione e di base dei meccanismi di sviluppo di allergia alimentare.
Modelli murini sono uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi dell'allergia, nonché sviluppando nuove tollerogeniche e desensibilizzazione terapie9,10,11,12. Ciò è particolarmente vero perché l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2; AH2) negli esseri umani è anche descritto l'allergene dominante in vari modelli del mouse13,14. Mentre i modelli murini dell'allergia dell'arachide sono preziosi per studiare i meccanismi della sensibilizzazione e della tolleranza, uno svantaggio è che può essere variabile e richiedono l'uso di adiuvanti. Immunogeni più potenti sarebbe un modo per ridurre al minimo la variabilità intrinseca di tali modelli. Dal momento che le cellule B sono fortemente attivate dagli antigeni multivalenti, liposomi antigenici visualizzati l'allergene sono una buona opzione a causa della loro capacità di attivare potenzialmente B-cellule attraverso il recettore delle cellule di B (BCR) mentre avendo anche la proprietà di efficiente adescamento il vano della T-cellula attraverso essere ripreso non specifico di antigene-presentare le cellule.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per coniugazione degli antigeni della proteina alle nanoparticelle liposomiale usando una strategia facile e modulare. Utilizzando un surrogato antigene, frammento Fab anti-IgM, dimostriamo come potente questi liposomi antigenici possono essere stimolante l'attivazione della B-cellula. Liposomi antigenici visualizzazione Ah2 antigene sono stati utilizzati per sviluppare un nuovo modello murino di sensibilità ha conferito. In questo modello, splenocytes dai topi di allergici alle arachidi verificati, contenente arachidi specifica memoria B - e T-cellule, vengono trasferiti in topi Congenici ingenuo. Le risposte dell'anticorpo di memoria sono indotti tramite l'iniezione di liposomi coniugato con Ah2 nei topi destinatari, al fine di indurre anticorpi contro Ah2. Seguita da un solo impulso con Ah2 solubile, anticorpi specifici Ah2 danno luogo a una forte risposta anafilattica quando questi topi sono successivamente impugnati con Ah2. Come topi sottoposti la reazione allergica rispondono in modo molto uniforme e non hanno ricevuto un adiuvante, questo approccio è un modello auspicabile allergia dell'arachide e i risultati suggeriscono che essa può avere utilità in altri modelli del mouse guidati dagli antigeni diretti a allergeni e, eventualmente, autoantigeni.

<table><tbody><tr><td>Collettore di frazioni modello 2110</td><td>BioRad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>grado Sigma 99%</td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21857</td><td></td></tr><tr><td>DSPC</td><td>Avanti</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG 18:0</td><td>Avanti</td><td>880120</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG Maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td>siringa da 1 mL con supporto/blocco riscaldante</td></tr><tr><td>Filtri 0,1 & micro; m</td><td>Filtri Avanti</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>0,8 &; m</td><td>Avanti</td><td>610009</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Supporti Filtro</td><td>Avanti</td><td>6100014</td><td></td></tr><tr><td>Flacone Fondo Tondo in Vetro</td><td>Sigma</td><td>Z100633</td><td></td></tr><tr><td>Tappi Ribaltabile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-301398</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-198194</td><td></td></tr><tr><td>Leur Lock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>k4201634503</td><td></td></tr><tr><td>Perline Sephadex G50 GE</td><td>Life Sciences</td><td>17004201</td><td></td></tr><tr><td>Perline Sephadex G100</td><td>GE Life Sciences</td><td>17006001</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale di Vitello Inattivato al Calore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Indo-1</td><td>Invitrogen</td><td>I1203</td><td></td></tr><tr><td>CD5-PE</td><td>BioLegend</td><td>100608</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td>senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Fab anti-topo IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-020</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 anti-topo IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-006-020</td><td></td></tr><tr><td>Farina di arachidi</td><td>Golden Peanut Co.</td><td>521271</td><td>12% di grassi arrosto chiaro, 50% di proteine</td></tr><tr><td>Aghi per l'alimentazione animale</td><td>Cadence Science</td><td>7920</td><td>22g x 1,5", 1,25 mm - dritto</td></tr><tr><td>Termometro a microsonda</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Sonda rettale per topi</td><td>Physitemp</td><td>Ret-3</td><td></td></tr><tr><td>Tossina del colera, da Vibrio cholera</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA <td>prive di azide</td> <td>100B</td></tr><tr><td></td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tampone carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>TMB Stop Solution</td><td>KPL</td><td>50-85-06</td><td></td></tr><tr><td>SureBlue TMB Microwell Perossidasi Substrato</td><td>KPL</td><td>5120-0077</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastra Immulon 4HBX</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Ara h 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td> solubile <td>purificato come in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td></tr><tr><td>HSA-DNP</td><td>Sigma</td><td>A-6661</td><td></td></tr><tr><td>IgE di topo anti-DNP IgE</td><td>chimico accurato</td><td>BYA60251</td><td></td></tr><tr><td>IgE anti-topo</td><td>Il sito di legame</td><td>PC284</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-pecora biotinilato d'asino</td> JNS065003 <td>chimico accurato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin protein, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 di topo anti-DNP</td><td>Accurato</td><td>chimico MADNP105</td><td></td></tr><tr><td>HRP di capra anti-topo IgG1</td><td>Southern Biotech</td><td>1070-05</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Siringhe da insulina</td><td>BD</td><td>329412</td><td>U-100, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")</td></tr> <tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-14</td><td>25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>gibco di Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific 11875093</td><td></td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>70 &mu; m Nylon, bianco, sterile, confezionato singolarmente</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>10 gel NuPAGE</td></tr><tr><td>LDS tampone, 4x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Standard precolorato</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>500 &; L</td></tr><tr><td>NuPAGE MES/SDS tampone di corsa, 20x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>24590</td><td>500 mL</td></tr></tbody></table>

liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Risposte anticorpali forniscono immunità protettiva critico per una vasta gamma di agenti patogeni. Ci rimane un elevato interesse nel generare anticorpi robusti per la vaccinazione così come capire come patogeno anticorpo risposte sviluppano allergie e malattie autoimmuni. Non è banale generando risposte robusto dell'anticorpo antigene-specifiche. In modelli murini, spesso richiede più cicli di vaccinazioni con adiuvante che conduce ad una grande quantità di variabilità dei livelli di anticorpi indotti. Un esempio è in modelli murini di allergie arachidi dove modelli più robusti e riproducibile che riducono al minimo i numeri del mouse e l'uso dell'adiuvante sarebbe vantaggioso. Presentato qui è un modello murino altamente riproducibili di anafilassi allergia dell'arachide. Questo nuovo modello si basa su due fattori chiave: (1) antigene-specifici splenocytes passivamente vengono trasferiti da un mouse di arachidi-sensibilizzati in un ingenuo destinatario mouse, normalizzare il numero di memoria antigene-specifiche cellule di B e di T attraverso un gran numero di topi; e (2) destinatari topi sono successivamente potenziati con un forte immunogen multivalenti sotto forma di nanoparticelle liposomiale visualizzati l'allergene principale dell'arachide (Ara h 2). Il principale vantaggio di questo modello è la sua riproducibilità, che in ultima analisi, riduce il numero di animali utilizzati in ogni studio, riducendo al minimo il numero di animali che ricevono iniezioni multiple di adiuvante. L'assemblaggio modulare di questi liposomi immunogenici fornisce relativamente facile adattabilità ad altri modelli allergiche o autoimmuni che coinvolgono gli anticorpi patogeni.

Coniugazione della proteina di interesse con DSPE-PEG(2000) può essere dimostrato mediante l'esecuzione di un riducente con un incremento di peso molecolare rispetto alla proteina non coniugata. Figura 1A Mostra un gel rappresentativo di coniugazione di frammento F(ab) di IgM anti-topo a PEG-DSPE, che mostra un bandshift di kDa di 2 – 3 per la proteina denaturata. Notare che circa il 50% della proteina sembra essere modificato, che è atteso dato che stechiome...

Descritto è la preparazione di nanoparticelle liposomiale antigeniche e loro uso nella stimolante della B-cellula attivazione in vitro e in vivo. Risposte anticorpali coerente e stabile ha condotto allo sviluppo di un nuovo modello di allergia dell'arachide. Il protocollo per la generazione di liposomi antigenici può essere estesa a diversi antigeni e modelli di immunizzazione.

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come come vengono attivati i globuli bianchi e come si sviluppano le allergie ai singoli allergeni? Il vantaggio principale di questo modello di topo allergico robusto e riproducibile è che un minor numero di topi può essere utilizzato per produrre una minore varianza con una popolazione sperimentale. Le nuove immunoterapie per controllare le risposte immunitarie richiedono modelli di topo robusti come mezzo iniziale per testare l'efficacia in vivo.Pertanto, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia allergica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle allergie, può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'autoimmunità in cui le risposte anticorpali indesiderate svolgono un ruolo chiave nella malattia. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza nel lavorare con nanoparticelle liposomiche o di un'inesperienza con le tecniche richieste nel lavoro del topo.Iniziare aggiungendo 2,5 equivalente molare del reticolazione eterobifunzionale alla proteina e posizionando la reazione su uno shaker oscill

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Gli aspetti tecnici di eseguire LIPS (Sistemi Immunoprecipitazione luciferasi) sono descritti. L'approccio generale prevede che esprimono i geni chimerici codifica antigeni fusi a Renilla luciferasi (Ruc) in cellule di mammifero. Greggio Ruc-antigene estratti vengono poi preparati e, senza purificazione, impiegati nei test di immunoprecipitazione per quantificare gli anticorpi.

Profiling anticorpi Systems Immunoprecipitazione luciferasi (LIPS)

Fonte: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxovirus per l'Immunomodulazione Mirata ai Tumori: Progettazione e Valutazione Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)In questo video viene illustrata la generazione di virus del morbillo ricombinanti mediante l'utilizzo di liposomi per veicolare plasmidi che codificano l'antigenoma virale e le proteine ausiliarie essenziali all'interno di cellule produttrici. L'RNA trascritto e replicato porta alla formazione di particelle virali che esprimono proteine...

Generazione di un virus del morbillo ricombinante codificante per una proteina immunostimolante

Questo video mostra la valutazione dell'attivazione delle cellule B attraverso l'utilizzo di liposomi antigenici. Le cellule B trattate con colorante Indo-1 sensibile al calcio vengono distinte utilizzando la citometria a flusso e viene analizzato il loro rapporto di fluorescenza viola-blu. Quando le cellule incontrano liposomi antigenici, innesca l'attivazione delle cellule B attraverso l'afflusso di calcio, migliorando progressivamente il rapporto del segnale di fluorescenza viola-blu nel...

Monitoraggio dell'attivazione delle cellule B con liposomi antigenici mediante un test del flusso di calcio

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare liposomi cationici/anionici con un peptide neuro-mirato come sistema di rilascio del SNC per consentire al siRNA di attraversare la BEE.  L'ottimizzazione di un sistema di somministrazione per trattamenti, come il siRNA, consentirebbe più opzioni di trattamento per i prioni e altre malattie neurodegenerative.

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l'antigene (VLP). L'immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell'involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all'analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della...

Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

Scopri la preparazione di liposomi antigenici per stimolare l'attivazione dei linfociti B in vitro e in vivo. Questo metodo robusto utilizza un modello murino di allergia alle arachidi con varianza ridotta.

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

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