Name: Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Impara il taglio e il galleggiamento di sezioni paraffiniche in camera termostatica per aumentare l'integrità tissutale in campioni di topo e zebrafish. Questo metodo migliora l'efficienza e la qualità dell'analisi istologica.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (Grant n. 31400936, 31460260) e il Natural Science Foundation di Jiangxi Provincia della Cina (20171BAB215020). Ringraziamo anche il programma congiunto tra Università di Nanchang e Queen Mary University of London per sostenere questo lavoro.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Università di Nanchang.
1. Montare l'attrezzatura e collegare il microtomo
<ol><li>Progettare il parametro per i requisiti (integrativa Figura 1).</li>
	<li>Inviare il parametro per una fabbrica locale per produrre i pannelli acrilici.</li>
	<li>Montare tutte le parti in sequenza: utilizzare cloroformio per combinare 7 pannelli acrilici commerciale in un serbatoio con un bagno di acqua e canale di sezione (Figura 1). Attenzione: Cloroformio produce sostanze tossiche quando incontra la luce e l'ossigeno. Montare l'apparecchiatura in una cappa aspirante.</li>
	<li>Installare l'elemento riscaldante elettrico tubolare attraverso il foro nel bordo acrilico #1 (Figura 2A, punta di freccia).</li>
	<li>Per installare il regolatore di temperatura, creare un piccolo foro sul bordo acrilico #2 con un trapano elettrico e installare il rilevatore di temperatura (Figura 2A, freccia). Installare un termostato digitale sul serbatoio (Figura 2A). Nota: Il rilevatore di temperatura dovrebbe essere all'interno di 1 cm sotto la superficie dell'acqua.</li>
	<li>Per fornire l'accesso di potere, regolare la tensione sotto 24 V prima di accendere l'apparecchio.</li>
	<li>Rimuovere il vassoio dei rifiuti di sezione dal microtomo.</li>
	<li>Collegare il canale di sezioni con il supporto della lama del microtomo con sigillante siliconico neutro (Figura 2B). Nota: Non striscio qualsiasi sigillante siliconico neutro sopra la parte superiore della lama, affinché la vecchia lama può essere facilmente sostituita.</li>
	<li>A secco durante la notte per consentire il cloroformio e neutro del silicone sigillante per solidificare.</li>
	<li>Installare la lama per il supporto della lama. Versare acqua nel bagno d'acqua (Figura 2). La superficie dell'acqua deve solo toccare la parte superiore della lama (Figura 2D, testa di freccia).</li>
</ol>2. paraffina sezionamento
Nota: Detriti spesso si accumulano sui bordi superiori o inferiori del blocco di cera e la superficie dell'acqua. Questo detriti deve essere deselezionato regolarmente.
<ol><li>
Eseguire paraffina convenzionale sezionamento10.
	<ol>
<li>Bloccare il preparato di paraffina-incastonato su un microtomo rotativo e posizionare la lama in un portalama.</li>
		<li>Ruotare il volantino e la sezione del campione.</li>
		<li>Trasferire il nastro sezionato a bagno d'acqua calda di 38,5 ° C.</li>
		<li>Raccogliere che le sezioni sul microscopio scivolare dalla superficie dell'acqua dopo lo svolgimento.</li>
		<li>Asciugare i vetrini in un forno a 42 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paraffina migliorata sezionamento (Figura 3)
	<ol>
<li>Accendere l'apparecchiatura.</li>
		<li>Aprire la stufa con interruttore di rilevamento temperatura e impostare la temperatura mirata tra 38,0 ° C a 40,0 ° C per 1 h in anticipo di riscaldare l'acqua.</li>
		<li>Modificare il blocco di paraffina acquisito da inclusione in paraffina; quindi posizionare il blocco di paraffina su morsetto di microtomo e bloccarlo. Nota: I bordi superiori ed inferiori del blocco paraffina dovrebbero essere modificati in orizzontale per evitare che il nastro di sezione da formando un arco e diventando in grado di fluire attraverso il canale di sezioni strette.</li>
		<li>Avvicinarsi rapidamente il campione di taglio di sezioni più spesse.</li>
		<li>Regolare ad uno spessore di sezione adeguata (10 µm per cervelli di topo adulto, reni di topo adulto e cervelli di topo di embrione, 4 µm per zebrafish occhi). Ruotare il volantino e le sezioni verranno immesso automaticamente il canale sezioni e bagno.</li>
		<li>Sezione il campione in una corsa di taglio lento e uniforme (Figura 3A). Nota: Utile della prima sezione sarà modificato dopo il volantino è stato interrotto per qualche minuto. Le lame monouso devono essere sostituite quando le sezioni hanno graffi consecutivi.</li>
		<li>Guida le sezioni nella camera del bagno a galleggiare in una linea (Figura 3B, 3C). Nota: Se nella sezione head aderisce alla parete della camera, è possibile utilizzare una guida di pennello per tenerlo galleggianti.</li>
		<li>Rispettare le sezioni su vetrini da microscopio. Dopo le sezioni dispiegarsi pienamente nel bagno d'acqua, sezioni separate diverse con le pinzette. Poi li pick up dal bagno di acqua sui vetrini al microscopio (Figura 3D). Nota: Sezioni dovrebbero essere prelevati dalla parte posteriore del bagno d'acqua, come quelli del canale di sezioni e l'anteriore del bagno d'acqua non sarà ancora completamente spiegati.</li>
		<li>Asciugare i vetrini mettendoli in un forno di 42 ° C durante la notte. Le diapositive quindi possono essere conservate a temperatura ambiente a tempo indeterminato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la colorazione ematossilina-eosina (HE) per motivi di valutazione del metodo migliorato8.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li>
<li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li>
<li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid-Cut%3A+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).</li>
<li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).</li>
</ol>

Gli autori hanno un brevetto su questo dispositivo e non dichiarano interessi concorrenti.

Per migliorare la paraffina sezione morfologia e risolvere il problema del tempo sprecato durante il sezionamento di paraffina convenzionale, abbiamo creato una paraffina migliore metodo che combina taglio e dispiegarsi di sezionamento. Questo metodo migliorato si basa su semplici attrezzature che comprende un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. La barra multifunzione sezione entra nel bagno d'acqua attraverso il canale di sezione e si svolge automatic...

Lo studio morfologico è importante nella ricerca biologica. Anche se la nuova tecnologia ha permesso ai ricercatori di osservare loro obiettivi direttamente dall'intero tessuto o organismi1,2,3, l'esemplare di taglio in sezioni sottili, seguirono dalla macchiatura, rimane il primario morfologia del metodo solo tessuto, ma anche proteine targeting direttamente nel tessuto. La microscopia chiara utilizza tre tipi di sezione: paraffina, congelato e semifini. Sebbene cryosectioning è comune per proteggere l'antigenicità del tessuto e la preparazione del campione è semplice, la morfologia del tessuto mantenuto è scadente e non adatto per sottile taglio4,5. Sezionamento di paraffina è il metodo più frequentemente utilizzato per l'esposizione di morfologia ben conservato. Come gli esemplari sono completamente disidratati e incorporati in cera, i blocchi di paraffina possono essere conservati a tempo indeterminato. Inoltre, paraffina sezionamento produce sezioni sottili che migliorare l'accesso della sonda biologico in ulteriori esperimenti e riducono la sovrapposizione di strati di cella nella direzione Z.
Tuttavia, paraffina convenzionale di sezionamento è noioso e richiede abilità dell'operatore. Sezioni della paraffina subiscono fissazione, disidratazione, incastonatura, taglio e galleggianti. È importante trasferire nastri sezione dal portalama a bagno d'acqua è necessaria, ma difficile per operatori junior. Specialmente in aria asciutta, i nastri di sezione torcerà elettricità statica e sono difficili da spiegare sulla superficie dell'acqua calda. Per migliorare la sezione qualità, inumidire la superficie di tessuto esposto tra microtomo lama passate, i blocchi di cera di raffreddamento immergendole in acqua con ghiaccio, o alzando l'umidità con un umidificatore vicino il microtomo sono consigliate6,7 . I più nuovi metodi per migliorare la paraffina sezionamento includono ibrido inclusione in paraffina, cryosectioning8e sezione commerciale trasferimento sistema assistenza9. Sebbene questi metodi migliorano parzialmente paraffina sezionamento velocità e qualità, fanno di sezionamento molto più ingombrante, e sistemi di trasferimento di sezione commerciale sono costosi.
In questo protocollo, dimostriamo come creare attrezzature passo dopo passo, semplice, economico e flessibile che possono essere collegata per il supporto della lama di un microtomo rotativo. Questa apparecchiatura è composta da un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. Dopo il taglio, decine di sezioni fluiscono nella scanalatura della sezione e inserire il bagnomaria direttamente, così sta svolgendo automaticamente. Questo migliora l'efficienza di taglio di paraffina e rende questa tecnologia più conveniente. Utilizzando questo metodo, più adulti sezioni di hippocampal di topo, sezioni di rene di topo adulto, embrionale 15,5 sezioni giorno-vecchio (E15.5) del mouse del cervello e occhio di zebrafish adulto sezioni sono state raccolte in meno tempo e morfologicamente più intatto. Questo metodo può essere utilizzato anche per altri campioni di tessuto che richiedono paraffina accelerata di sezionamento, evitando perdita di distinzione di sezione.

<table><tbody><tr><td>Incubatrice</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sinopharm Reagente Chimico Co., Coperchio</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xilene&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Coperchio</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di inclusione in paraffina riscaldata</td><td>Leica</td> Pannello acrilico commerciale Triclorometano <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Coperchio</td><td>67-66-3</td><td></td></tr> Elemento <tr><td></td> riscaldante elettrico tubolare (12 V 200 W)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura (12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotante&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigillante</td><td></td><td></td> siliconico neutro <td>Collegare il canale dell'acqua con il portacoltelli del microtomo</td></tr><tr><td>Trasformatore di tensione</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama monouso</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Balsamo neutro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., coperchio</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti...</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua per sezioni di paraffina</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr> spray <tr><td>repellente alla paraffina&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sezionamento del tessuto paraffina-incastonato è ampiamente usato in istologia e patologia. Tuttavia, è noioso. Per migliorare questo metodo, diverse aziende commerciali hanno messo a punto sistemi di trasferimento di sezione complessa utilizzando acqua liquida. Per semplificare questa tecnologia, abbiamo creato un semplice metodo utilizzando attrezzature fatte in casa che combina taglio e galleggianti all'interno di una semplice camera termostatica; Pertanto, le sezioni immettere automaticamente il bagno d'acqua sulla superficie dell'acqua. L'ippocampo da cervelli di topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish adulto sono stati tagliati utilizzando paraffina convenzionale di sezionamento e il metodo proposto per il confronto. Analisi statistica dimostra che il nostro metodo migliorato salvato tempo e sezioni più alte qualità di prodotto. Inoltre, paraffina sezionamento di un esemplare intero in breve tempo è facile per gli operatori junior.

Il metodo migliorato ha aumentato il numero delle sezioni di paraffina intatto. Abbiamo testato questo metodo nuovo su tessuto ippocampale topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish. Acqua è stato aggiunto al serbatoio, e la temperatura dell'acqua è stata mantenuta tra 38,0 ° C a 40,0 ° C. Dopo una preparazione in serie i campioni di tessuto, sono stati sezionati e rispetto alla divisione convenzionale. Il nuovo metodo di evitata perdita di sezione e...

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la paraffina sezionamento. Questo metodo combina taglio e mobile utilizzando una semplice camera termostatica per evitare il processo di trasferimento richiesto secondo il metodo convenzionale. Di conseguenza, l'efficienza e il numero di sezioni della paraffina intatti furono notevolmente migliorate.

Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo morfologico, come il sezionamento della paraffina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che culmina il taglio e la procedura di piegatura ed evita il processo di trasferimento richiesto dal metodo convenzionale. Per iniziare, raccogli tutte le parti prefabbricate in una cappa aspirante.Usa il cloroformio per combinare le sette tavole acriliche, come mostrato qui. Il prodotto finale sarà una vasca dotata di un canale di sezione e di un bagno d'acqua. Installare l'elemento riscaldante elettrico tubolare attraverso il foro nel pannello acrilico numero due.Usando un trapano elettrico, fai un piccolo foro nella tavola acrilica numero sette e installa un termostato digitale sul serbatoio, assicurandoti che sia almeno un centimetro sotto il livello della superficie dell'acqua prevista, che è indicato dal punto nero sul serbatoio. Regolare la tensione in modo che sia inferiore a 24 volt prima di accendere l'apparecchiatura. Rimuovere la sezione vassoio dei rifiuti dal microtomo.Quindi, utilizzare sigillante siliconico neutro per collegare il canale delle sezioni al portalama del microtomo, assicurandosi di non far entr

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