Name: Potenziamento dellefficacia dellanticorpo antitumorale di farmaci antineoplastici: rilevazione dellanticorpo-farmaco sinergismo usando lequazione di indice di combinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Scopri come valutare il sinergismo tra anticorpi antitumorali e farmaci antineoplastici usando l'equazione dell'indice di combinazione di Chou-Talalay in modelli preclinici. Questo metodo quantitativo ottimizza le terapie combinate contro il cancro.

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Concedere il sostegno: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e comité de Vendée, une rosa versare S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les I cancri et les leucémies de l'enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. e J.F. sono supportati da La Ligue Contre Le Cancer. Gli autori ringraziano l'UTE-impianto della struttura Fédérative de Recherche François Bonamy. Gli autori ringraziano anche Dr. S. Suzin (Inserm, Parigi) per fornire le cellule IMR5 e Sig. ra H. Estéphan per la sua assistenza tecnica.

Stabulazione e procedura sperimentale sono stati approvati dal governo francese (accordi #C44-278 e #APAFIS 03479.01). Procedure e cura degli animali sono state condotte sotto la direttiva UE 2010/63/UE e legge francese #2013-118 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
1. valutazione dell'interazione tra il farmaco mAb 8B6 e Topotecan In Vitro
<ol><li>preparazione del campione di 96 pozzetti Attenzione: Consultare il Comitato di salute e sicurezza dell'istituzione e seguire le regole di regolazione locale legate alla sicurezza in laboratorio. Rivedere le informazioni materiale e foglio di dati di sicurezza prima di lavorare con qualsiasi media, linee cellulari o reagenti. Usare una tecnica sterile corretta e lavorare in una cappa a flusso laminare. Tutte le soluzioni/apparecchiature che vengono utilizzate per manipolare le cellule devono essere sterili. Nota: Il seguente protocollo è stato progettato per l'utilizzo con celle aderenti. Le modifiche sono tenute ad applicare il metodo alle cellule nonadherent crescono in sospensione; Questo protocollo utilizza quattro esemplari per ogni condizione sperimentale.<ol>
<li>Crescere le cellule IMR5 in una boccetta di T75.</li>
		<li>Il primo giorno (giorno 0), osservare la cultura delle cellule al microscopio per verificare il confluency di cella. Aspirare il medium delle cellule dalla beuta, lavarlo con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 3 mL di 0.05% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) / soluzione PBS. Restituire il pallone nell'incubatore per 3 min (37 ° C, 5% CO2).</li>
		<li>Esaminare la coltura delle cellule al microscopio per distacco cellulare. Nota: Se necessario, è possibile restituire il pallone nell'incubatore per altri 3-5 min, a seconda del tipo di cellula del tumore.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di medium cellulare completo al pallone e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile 15 mL. Centrifugare le cellule per 5 min a 300 x g. Contare le celle utilizzando un emocitometro.</li>
		<li>Rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita completa. Regolare il volume medio per ottenere una concentrazione finale di 1 x 105 cellule/mL.</li>
		<li>Pozzetti di seme 84 di una piastra 96 pozzetti cultura con 10 celle4 ciascuno, che è di 100 µ l di sospensione cellulare. Seguono la disposizione sperimentale illustrata nella Figura 2.</li>
		<li>Incubare le cellule per 18 h nell'incubatrice delle cellule (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione soluzione della droga Nota: Per gli studi di sensibilizzazione droga/mAb, modificare la tempistica, la lunghezza e il trattamento di concentrazione per soddisfare il particolare droga/mAb in questione. Si noti che la concentrazione iniziale è 3 volte la concentrazione finale.<ol>
<li>La mattina successiva (giorno 1), preparare le seguenti soluzioni di droga utilizzando il mezzo di sviluppo completo.<ol>
<li>
preparazione soluzione mAb
			<ol>
<li>Diluire il mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di anticorpo funzionante con una concentrazione di mAb di 240 µ g/mL.</li>
				<li>Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparazione soluzione topotecan
			<ol>
<li>Diluito, come sopra, la droga in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di lavoro di droga con una concentrazione finale di 120 nM.</li>
				<li>Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparazione di soluzione di anticorpo e droga
			<ol>
<li>Diluire le soluzioni farmacologiche e mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione a 120 nM droga e mAb 240 µ g/mL (soluzione di lavoro).</li>
				<li>Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per raggiungere la concentrazione finale, trasferire 50 µ l di ogni soluzione della droga nei pozzetti corrispondenti, come indicato nel layout sperimentale ( Figura 2). Nota: Trasferire 50 µ l di terreno di crescita completa nei pozzetti delle cellule non trattate, come indicato nella Figura 2.</li>
		<li>Incubare le cellule per 72 h in incubatrice (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi di MTT
	<ol>
<li>Aggiungere 10 µ l di soluzione di reagente MTT in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C per 4 ore.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di lisi (10% SDS in 0,01 M HCl) in ciascun pozzetto, usando una pipetta multicanale e mescolare accuratamente pipettando.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C per 4 ore in una camera umidificata (95% di umidità).</li>
		<li>Leggere l'assorbanza a 570 nm (un570) e 620 nm (A620) utilizzando uno spettrofotometro. Nota: Mescolare ogni campione ancora pipettando prima di leggere l'assorbanza; assorbanza a 620 nm permette la correzione dei valori di fondo non specifici.</li>
		<li>Calcolare l'assorbanza corretta: rettificato assorbanza = un570- A620.</li>
		<li>Calcolare l'attuabilità delle cellule come segue: vitalità cellulare = 100 x (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).</li>
		<li>Calcolare i valori di frazione-commovente (Fa) utilizzando la seguente equazione: 1 - (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).</li>
	</ol></li>
	<li>Software di simulazione analitica di interazione di droga per il singolo e gli studi di combinazione di droga
	<ol>
<li>Eseguire il software di simulazione per aprire la finestra di avvio.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Nuovo esperimento per aprire la finestra principale .</li>
		<li>Digitare il nome dell'esperimento nella finestra nome . Nota: Può essere aggiunta una data nella finestra della Data .</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Nuovo farmaco singolo .</li>
		<li>Digitare il nome nella finestra del Nome completo .</li>
		<li>Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .</li>
		<li>Digitare l'unità di concentrazione del farmaco nella finestra unità .</li>
		<li>Immettere i dati punto 1 Dose e valore Fa, premere invio.</li>
		<li>Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante finito .</li>
		<li>Seguire la stessa procedura per inserire punti dati mAb. Nota: Utilizzare la stessa unità di concentrazione come viene utilizzato da droga.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Nuova droga Combo .</li>
		<li>Selezionare il farmaco e mAb.</li>
		<li>Selezionare Rapporto costante e fare clic su OK.</li>
		<li>Digitare il nome nella finestra del Nome completo .</li>
		<li>Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .</li>
		<li>Digitare il rapporto droga/mAb nella finestra del rapporto .</li>
		<li>Immettere i dati punto 1 Dose e premere invio. Nota: È possibile che il programma calcolerà automaticamente le dosi di mAb e Combo.</li>
		<li>Immettere il valore di Dati punto 1 Fa e premere invio.</li>
		<li>Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante finito e, quindi, fare clic sul pulsante Genera Report .</li>
		<li>Selezionare il farmaco e mAb e, quindi, fare clic su OK.</li>
		<li>Selezionare Combo e, quindi, fare clic su OK.</li>
		<li>Selezionare intestazione, CI tabellae tabella riassuntiva. Quindi, fare clic su OK.</li>
		<li>Digitare il nome file del file di analisi e fare clic su Salva per generare il report. Nota: Dopo aver cliccato OK, la relazione aprirà automaticamente nel web browser predefinito del computer.</li>
		<li>Per stampare il report, scegliere stampa dal menu file del browser web. Il report contiene una sezione di tabella di riepilogo che include titolo, data, nome file, descrizione nota, parametri (m, Dm e r), ED50 per qualsiasi agente usato in monoterapia o in combinazione e la tabella di CI per ogni combinazione a ED50, ED 75, ED90e95di ED. Nota: Un valore di CI di < 1 indica sinergismo, CI valore = 1 indica additività e un valore di CI di > 1 indica antagonismo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. generazione di xenotrapianti di Neuroblastoma umano nei topi di Scid Gamma NOD diabetici Nonobese (topi NSG)
Nota: Escludere qualsiasi contaminazione della coltura delle cellule. Poiché la matrice della membrana basale forma un gel sopra i 5 ° C, tutti i cultureware o media entrano in contatto con il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere prechilled e ghiaccio-freddo. Tenere la matrice della membrana basale sul ghiaccio durante l'intero processo.
<ol><li>
Preparazione della sospensione delle cellule IMR5
	<ol>
<li>Scongelare il reagente di matrice della membrana dello scantinato durante la notte immergendo il flaconcino nel ghiaccio in un frigorifero a 4 ° C prima dell'uso.</li>
		<li>Il giorno 0, vendemmia IMR5 cellule coltivate come dettagliato sopra.</li>
		<li>Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante. Lavare le cellule 2 x con 15 mL di PBS ghiacciata e preparare una sospensione di cellule di 5 x 107 cellule/mL in PBS ghiacciata. Nota: Se necessario, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Agitare il flaconcino di matrice della membrana dello scantinato. Nota: Il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere scongelato e dispersi.</li>
		<li>Aggiungere un volume di reagente di matrice della membrana dello scantinato e mescolare pipettando per ottenere una sospensione di cellule di 2,5 x 107 cellule/ml.</li>
		<li>Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dei topi Nota: I topi dovrebbero essere sei o sette settimane.<ol>
<li>Mantenere i topi in una condizione da organismi patogeni specifico.</li>
		<li>Consentire un periodo di acclimatazione di tre - cinque giorni dopo sono arrivati i topi.</li>
		<li>Il giorno dell'inoculazione, radere il fianco dove sarà l'iniezione (vedere il punto 2.3.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dell'iniezione delle cellule del tumore Nota: Tenere la sospensione di cellule di matrice ghiacciata della membrana dello scantinato asettica durante tutta la procedura.<ol>
<li>Mescolare le cellule e disegnare accuratamente la sospensione cellulare in una siringa da 1 mL montata con un ago 21G.</li>
		<li>Controllare per essere sicuri che non ci sono bolle d'aria nella siringa.</li>
		<li>Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.</li>
		<li>Premere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita, al sito di iniezione.</li>
		<li>Inserire l'ago esattamente la piega di pelle. Non posizionare l'ago profondità nel tessuto per garantire un'iniezione sottocutanea.</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di sospensione cellulare IMR5 (cioè, 2.5 x 106 cellule) nel fianco destro inferiore dei topi.</li>
		<li>Ruotare la siringa per evitare perdite e ritirare l'ago.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monitoraggio delle variazioni di peso corporeo e la crescita del tumore
	<ol>
<li>Misurare la lunghezza (A) e la larghezza (B) del tumore con una pinza.</li>
		<li>Calcolare il volume del tumore usando la formula (A x B2) x 0,5.</li>
		<li>Iniziare la terapia quando i tumori hanno raggiunto un volume medio di ~ 50-60 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. droga e amministrazione dell'anticorpo in topi
<ol><li>
Somministrazione endovenosa di mAb 8B6
	<ol>
<li>Attentamente e riempire una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G con soluzione di mAb.</li>
		<li>Posizionare il mouse sotto una lampada di calore per 10 min a dilatare la vena della coda.</li>
		<li>Trattenere il mouse in un dispositivo di ritenuta del roditore.</li>
		<li>Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.</li>
		<li>Inserire l'ago parallelo alla vena della coda, penetrante 2-4 mm nel lumen, mantenendo la smussatura del viso dell'ago verso l'alto (Figura 3A).</li>
		<li>Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo per via endovenosa (i.v.).</li>
		<li>Quando è terminata l'iniezione, pressione delicatamente il sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Somministrazione intraperitoneale di topotecan
	<ol>
<li>Aspirare la soluzione di droga in una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G.</li>
		<li>Tenere premuto il mouse in posizione supina, con la sua estremità posteriore leggermente rialzata.</li>
		<li>Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.</li>
		<li>Individuare la linea mediana del mouse addome e mentalmente divide l'addome in quadranti. Individuare il sito di iniezione nel quadrante inferiore destro o sinistro (Figura 3B).</li>
		<li>Inserire l'ago nell'addome (5 mm di profondità) ad angolo di ~ 10°, nel quadrante inferiore destro o sinistro.</li>
		<li>Iniettare 100 µ l di soluzione di droga per via intraperitoneale (i.p.).</li>
		<li>Disinfettare il sito di inoculazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

S.Fa., J.F. e S.B. sono indicati come inventori di in attesa di brevetti che coprono l'applicazione clinica degli anticorpi terapeutici anti-O-acetil-GD2.

Per prevedere l'effetto di interazione farmacologica, tre metodi possono essere utilizzati: la metodologia di isobologram17, la miscela non lineare modello18e la combinazione di indice1. Analisi dell'indice di combinazione sono il più comunemente usato perché la sua applicazione è semplificata dalla disponibilità di un programma per computer facile da usare. Per questo scopo, abbiamo caratterizzato in primo luogo la risposta dose-effetto di ogni agen...

L'approccio convenzionale nel trattamento di un gran numero di diversi tipi di cancro si basava sul monotherapy. Anche se è ancora usato in molti casi, questo metodo ha incontrato diversi ostacoli che conduce a optare per terapie combinate2. In particolare, le cellule tumorali sono più suscettibili a sviluppare resistenza quando trattati con un farmaco singolo inducendo sopravvivenza alternativo meccanismi3, con conseguente fallimento terapeutico in pazienti4. Inoltre, in monoterapia, farmaci sono solitamente somministrati a dosi elevate. Questa situazione spesso provoca il verificarsi di forti effetti collaterali dose-dipendente che può essere intollerabile e imporre ai medici di interrompere il trattamento2. Per questi motivi, l'associazione di molecole antitumorali è ora preferito alla monoterapia.
Combinazioni di farmaci ideale sarebbero quelli che agiscono in sinergia contro le cellule del tumore, senza tossicità aumentata contro le cellule normali. Sinergismo si riferisce all'interazione di due o più farmaci che produce un effetto terapeutico maggiore della somma di ogni singola sostanza operano separatamente. Tali interazioni possono provocare una maggiore efficacia terapeutica clinica2. Limita la resistenza al trattamento, aumenta l'efficacia e può anche ridurre la tossicità2. Infatti, il dosaggio di ogni farmaco può essere ridotto per abbassare i loro effetti collaterali mirando alle vie differenti. Inoltre, una delle molecole può anche servire come un agente di sensibilizzazione contro le cellule tumorali. L'effetto del farmaco secondo può essere migliorata sulle cellule sensibilizzate e dosaggi meno possono essere usato5.
Terapia combinata può includere due o più farmaci chemioterapici e/o prodotti biologici, come gli anticorpi monoclonali6. Questi anticorpi monoclonali specificamente le cellule che esprimono un antigene di superficie delle cellule di interesse e sono in grado di uccidere le cellule tumorali attraverso vie immunologiche compreso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC), con il coinvolgimento di cellule immunitarie effettrici 7e citotossicità complemento-dipendente (CDC)6. Essi possono anche agire tramite un meccanismo non immunologico mediato da apoptosi8,9,10,11. In questo caso, l'induzione del processo di morte programmata delle cellule può sensibilizzare le cellule tumorali, indebolire la loro funzione e rendere più efficace il farmaco chemioterapico associato ad un dosaggio più basso. Come tale, proapoptotic mAb sono buoni candidati per la progettazione di regimi di combinazione con farmaci antineoplastici.
Sono stati descritti diversi modelli matematici per valutare il sinergismo della droga; uno di loro si basa sulla combinazione indice metodo1. Questo metodo si basa sul principio di effetto mediano sviluppato da Chou1. L'effetto mediano equazione correla la dose di farmaco e l'effetto della droga come segue.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg">
Qui, D è la dose di droga; DM è la dose mediana-effetto; Fa è la frazione influenzata dalla dose; m è un esponente che indica la forma della dose-effetto trama1. La dose mediana-effetto viene utilizzata per calcolare la dose Dx di un farmaco che inibisce o uccide "x" per cento delle cellule. Il valore CI viene quindi calcolato per valutare l'effetto additivo della combinazione del farmaco, come segue1.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;">
CI il valore 1 indica un effetto additivo e un valore di CI di &lt; 1 indica un effetto sinergico, mentre un valore di CI di &gt; 1 indica antagonismo1. L'applicazione di questo metodo è ulteriormente facilitato dalla disponibilità di un programma per computer, CompuSyn, che determina sinergismo ed antagonismo a tutte le dosi o livelli di effetto simulato automaticamente12.
Il nostro gruppo ha sviluppato la specifica di 8B6 mAb per O-acetile-GD2 ganglioside (OAcGD2) di neuroblastoma antigene13 e ulteriormente dimostrato che questa mAb è in grado di indurre la morte delle cellule con gli attributi di apoptosi11. Per verificare se mAb 8B6 può sensibilizzare le cellule di neuroblastoma per il topotecan agente antineoplastico, abbiamo adattato il suddetto metodo sviluppato da Chou1. In primo luogo, determiniamo i valori (ED50) 50 di dose efficace di mAb 8B6 e topotecan. Successivamente, le cellule di neuroblastoma con rapporti di uguale potenza dei due composti in base ai valori di50 ED esposte per determinare i valori di CI utilizzando il software di simulazione di cui sopra. Questo metodo permette di dimostrare il sinergismo fra mAb 8B6 e topotecan in vitro. Successivamente, descriviamo un protocollo per valutare ulteriormente la potenza e la sicurezza di questa combinazione regime in vivo. Questo protocollo può essere facilmente applicato per selezionare mAb anticancro potente e sicuro e combinazioni dell'agente chemioterapeutico negli studi preclinici. Una rappresentazione schematica di questo studio è fornita nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Kit per la proliferazione cellulare (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>Software CompuSyn</td><td>ComboSyn</td><td></td><td>Combosyn può essere scaricato gratuitamente all'indirizzo http://www.combosyn.com</td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale per vitello</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>Siero fetale per vitello inattivato al 10% in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox&nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox può essere scaricato gratuitamente all'indirizzo http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Heat lamp</td><td>Verre& Quarzo</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di neuroblastoma umano IMR-5</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 è un clone della linea cellulare di neuroblastoma umano IMR32 5459762. Le cellule IMR-5 sono state generosamente fornite dal Dr. Santos Susin (U.872, Parigi, Francia)</td></tr> <tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM in soluzione di lisi RPMI 1640</td></tr><tr><td></td><td>Roche&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>Università di Nantes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>Ago 21G 1 &frac12; &nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Ago 25G 1</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>NSG topi</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 pozzetti micropiastre</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC che funziona Windows 7</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 può essere acquistato presso http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 unità/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Serbatoio di reagenti</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di ritenuta per roditori</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

potenziamento dell'efficacia dell'anticorpo antitumorale di farmaci antineoplastici: rilevazione dell'anticorpo-farmaco sinergismo usando l'equazione di indice di combinazione

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potenziamento di ostili gli anticorpi monoclonali (mAb) dagli agenti chemioterapeutici costituisce una strategia importante per la progettazione di una terapia efficace e più sicura contro il cancro. Qui forniamo un protocollo per identificare una combinazione razionale nella fase preclinica. In primo luogo, descriviamo un test per valutare il sinergismo tra mAb anticancro e farmaci citotossici, che utilizza l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay1cella. Questo include la misurazione della sensibilità del tumore delle cellule farmaco - e anticorpo-usando un'analisi MTT, seguita da un'analisi di computer automatici per calcolare i valori di indice (CI) di combinazione. CI valori di < 1 indicare sinergismo tra testata mAbs e agenti citotossici1. Per corroborare l'in vitro risultati in vivo, ulteriormente Descriviamo un metodo per valutare l'efficacia del regime di combinazione in un modello di xenotrapianto del tumore. In questo modello, il regime combinato ritarda significativamente la crescita del tumore, che si traduce in un significativo di sopravvivenza esteso rispetto ai comandi del singolo-agente. D'importanza, la sperimentazione in vivo rivela che il regime di combinazione è ben tollerato. Questo protocollo permette la valutazione efficace di combinazioni di farmaci anticancro in modelli preclinici e l'identificazione della combinazione razionale per valutare in studi clinici.

I risultati rappresentativi e le figure sono adattati con il permesso dal precedente lavoro pubblicato14.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 migliora sinergico effetti inibitori di Topotecan, sulla crescita linea cellulare di Neuroblastoma:
Per stabilire la droga e le concentrazioni di anticorpi da utilizzare per la valutazione del sinergismo ...

Questo protocollo descrive come valutare il sinergismo fra un anticorpo antitumorale e farmaci antineoplastici in modelli preclinici utilizzando l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay.

Potenziamento dell'efficacia dell'anticorpo antitumorale di farmaci antineoplastici: rilevazione dell'anticorpo-farmaco sinergismo usando l'equazione di indice di combinazione

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

L'immunoterapia combinata con la chemioterapia rappresenta un approccio innovativo per sviluppare una terapia efficiente nel cancro. Gli obiettivi principali sono raggiungere effetti sinergici e terapeutici, riduzione della dose e della tossicità e ridurre al minimo o ritardare l'induzione della resistenza ai farmaci. Tuttavia, per motivi pratici ed etici, non è possibile determinare la sinergia nei pazienti. Pertanto, prima della combinazione diretta negli studi clinici, devono essere effettuati studi di combinazione prenicaptor, in vitro e/o negli animali, per ottenere la logica per gli studi clinici. Un semplice metodo robusto per la quantificazione della sinergia tra farmaci si basa sull'equazione dell'indice combinato sviluppata da Shouan Talale, come illustrato in questo video. Usando questo metodo, e la sua simulazione computerizzata, evidenzeamo qui, il sinergismo tra l'anticorpo monoclonale 8B6, che è specifico per l'antigene del neuroblastoma Ganglioside O-Acetyl-GD2 e il farmaco chemioterapico Topotecan sulle cellule del neuroblastoma. In breve, dopo aver determinato la dose efficace 50 valori di ciascun composto nell'IMO umano, 5 linee cellulari di neuroblastoma, queste cellule sono state intubate con rapporti equi dei due composti e i valori dell'indice combinato sono stati calcolati utilizzando la simulazione automatica al computer. Abbiamo poi confermato questi risultati in Vivo, in un modello imo, 5 tumore xenofobo. Abbiamo coltivato cellule IMR-5 in un pallone T75, le abbiamo osservate al microscopio, per controllare la confluenza cellulare. Mezzo cellulare asperato dal pallone, lavare con 5 ml di PBS. Aggiungere 3 mL di soluzione EDTA/PBS 0,05%.. Riportare il pallone nell'incubatrice per 3 minuti. Esaminare la coltura cellulare al microscopio per il distacco cellulare. Aggiungere 10 ml di mezzo cellulare completo al pallone e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 ml. Centrifugare per cinque minuti a 300 g.Contare le cellule usando un emocitometro. Rimuovere e scartare il supernatante. Sospendere le celle in in Complete Growth Medium.Regolare il volume medio per ottenere la concentrazione finale di 100.000 celle/mL.Semi 84 pozzi, 96 piastre di coltura del pozzo con 10.000 celle ciascuna, otteniamo 100 microlitri di sospensione cellulare. Incubare le cellule per 18 ore nell'incubatore di cellule.Diluire l'anticorpo monoclonale in 500 microlitri di Complete Growth Medium per ottenere una soluzione di lavoro anticorpale con una concentrazione di anticorpi monoclonali 240 micro-grammi per mL.Eseguire 5 delusioni seriali due volte come indicato nel protocollo. Diluire il farmaco in 500 microlitri di Complete Growth Medium per ottenere una soluzione di lavoro farmacologica con una concentrazione finale di 120 nanomolari. Eseguire 5, due volte delusioni seriali come indicato nel protocollo. Diluire allo stesso modo il farmaco più soluzioni di anibodies monoclonali. Per arrivare alla concentrazione finale, trasferire 50 microlitri di ciascuna soluzione farmacologica nei pozzi corrispondenti, come mostrato in questo layout sperimentale. Incubare le cellule per 72 ore nell'incubatrice. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di reagente MTT in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius per 4 ore. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di licina in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale e mescolare accuratamente mediante pipettazione. Incubare a 37 gradi Celsius per 4 ore in una camera umidificata. Liberare gli assorbenti a 570 e 620 nanometri usando uno spettrofotometro. Calcolare la vitalità della cella come segue. Calcolare i valori interessati dalla frazione utilizzando la seguente equazione. Eseguire il software di simulazione, fare clic sul nuovo pulsante esperimento per ottenere la finestra principale. Digitare il nome dell'esperimento. Fare clic su nuovo singolo farmaco. Digitare il nome. Digitare l'abbreviazione. Digitare l'unità di concentrazione del farmaco. Immettere i dati 1 dose e valore fa. Premere INVIO.Ripetere questo passaggio finché non vengono immessi tutti i punti dati. Fate clic su Finito (Finished).Seguire gli stessi passaggi per immettere i punti dati degli anticorpi monoclonali. Fare clic su Nuova combinazione di farmaci.Selezionare anticorpi farmacologici e monoclonali. Selezionate Rapporto costante (Constant Ratio).Fate clic su OK. Digitare il nome. Digitare l'abbreviazione. Digitare il rapporto anticorpo monoclonale del farmaco. Immettere i dati 1 dose. Premere INVIO.Il programma calcolerà automaticamente le dosi di Anticorpo Monoclonale 8B6 e combo. Immettere i dati 1 valore dell'a.ti.Premere INVIO.Ripetere questo passaggio finché non vengono immessi tutti i punti dati. Fare clic su Finito.Quindi, fare clic su Genera report.Selezionare il farmaco e l'anticorpo monoclonale, quindi fare clic su OK. Selezionare Combo e quindi FARE CLIC SU OK. Selezionare Intestazione, Tabella CI e Tabella riepilogativo e quindi fare clic su OK. Digitare il nome del file e l'analisi e fare clic su Salva per generare il report. Il report si apre automaticamente nel browser Web predefinito. Il report contiene una sezione della tabella di riepilogo che include i parametri titolo, data, nome finale, nota di descrizione, m, Dm e r, dose efficace 50 per l'agente utilizzato come monoterapia o in combinazione e la tabella dell'indice combinato per ogni combinazione alla dose effettiva 50, 75, 90 e 95.Un valore dell'indice combinato minore di 1 indica sinergismo. Un valore uguale a uno indica additività. Un valore maggiore di 1 indica antagonismo. Scongelare la matrice della membrana basale durante la notte immergendo il flaconcino nel ghiaccio in frigorifero a 4 gradi C prima dell'uso. Tutta l'usura della coltura o i supporti che vengono a contatto con la metrica della membrana basale devono essere prechilliti. Raccogli la cultura IMR5. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 300 g per 5 minuti. Scartare il supernatante. Lavare le celle con PBS ghiacciato da 15 mL due volte. Preparare una sospensione cellulare per 5 milioni di cellule per mL in PBS ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 mL. Flaconcino a matrice di membrana basale girevole. Aggiungere 1 volume del reagente a matrice di membrana basale, miscelato mediante pipettazione per ottenere la sospensione cellulare di 2,5 milioni di celle per mL.Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Radere il fianco di dove verrà eseguita l'iniezione. Mescolare le cellule e disegnare con cura la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml montata con un ago da 21 g. Verificare che non vi siano bolle d'aria nella siringa. Disinfettare l'area di inoculazione dei topi con una soluzione antisettica. Spremere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita nel sito di iniezione. Inserire l'ago esattamente nella piega della pelle. Non posizionare l'ago in profondità nel tessuto per assicurare l'iniezione sottocutanea. Iniettare sottocutaneamente 100 microlitri di sospensione cellulare IMR5. Ruotare la siringa per evitare la diffusione del liquido e ritirare l'ago. Monitorare i topi per il peso corporeo e la crescita del tumore. Misurare la lunghezza e la larghezza del tumore con un calibro. Calcola il volume tumorale usando questa formula. Inizia la terapia quando i tumori hanno raggiunto un volume medio da 50 a 60 mm

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Combinazioni di farmaci sinergici sono difficile e richiede molto tempo per identificare empiricamente. Qui, descriviamo un metodo per identificare e convalidare sinergiche piccole molecole.

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Questo protocollo presenta una tecnica automatizzata ad alto rendimento basata su immagini per identificare i composti che modulano l'uccisione delle cellule di cancro al seno mediate da cellule natural killer in presenza di un anticorpo terapeutico anti-HER-2.

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Qui viene presentata una procedura per impiantare cellule tumorali pancreatiche che esprimono proteine fluorescenti verdi (PANC-1 GFP) ortotopicamente nel pancreas di topi Balb-c Ola Hsd-Fox1nu per valutare la progressione del tumore e le metastasi.

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