Fabbricazione di dispositivi rifrangenti-Indice-abbinati per biomedica microfluidica

Questo metodo può aiutare ad affrontare un'importante sfida nella combinazione della microscopia con la microfluidica, consentendo la corrispondenza dell'indice di rifrazione tra la struttura del microcanale e i mezzi acquosi all'interno del canale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è compatibile con i metodi di fabbricazione comunemente utilizzati per creare dispositivi microfluidici. Un altro vantaggio chiave del nostro approccio è il metodo utilizzato per sigillare microcanali realizzati con materiali a bassa adesione, che è un problema comune tra i polimeri con indice di rifrazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per sigillare il canale possono essere difficili da eseguire correttamente. Ad esempio, è importante che i serbatoi non siano ostruiti durante il bloccaggio. Iniziare questa procedura con la fabbricazione di polidimetilsilossano, o PDMS, negativo, come descritto nel protocollo di testo.

Quindi, riempire il negativo PDMS con 400 microlitri di MY-133-V-2000. Il negativo deve essere leggermente riempito eccessivamente. Posizionare il negativo PDMS riempito MY-133-V-2000 nella camera a vuoto per due ore per rimuovere eventuali bolle.

Dopo aver rimosso il MY-133-V-2000 dalla camera a vuoto, premere un vetrino contro la parte superiore del negativo leggermente riempito per creare una superficie piana del MY-133-V-2000 e per evitare che l'ossigeno inibisca la polimerizzazione. Quindi, inserire il MY-133-V-2000 in un forno UV da 400 watt. Impostare la radiazione UV al 50% dell'intensità massima per 300 secondi per polimerizzare il microcanale.

Si tratta di una potenza di circa 4,5 joule per centimetro quadrato, circa il doppio della potenza di polimerizzazione minima consigliata dal produttore. Dopo aver tagliato l'acrilico come descritto nel protocollo di testo, posizionare due piccole gocce sul bordo dell'acrilico e quindi utilizzare uno strumento usa e getta per stendere uniformemente la colla. Posizionare il substrato di vetro sull'acrilico e lasciare asciugare la colla utilizzando il peso del vetro per tenerlo in posizione.

Rivestire il vetro esposto con 100 microlitri di PDMS utilizzando una pipetta a spostamento positivo. Quindi, inserire lo strato di base in una centrifuga sottovuoto per rivestire uniformemente il vetro con una pellicola PDMS di circa 10 micrometri di spessore utilizzando una velocità di 1500 giri/min per due minuti. Rimuovere lo strato di base dalla centrifuga e rimuovere accuratamente il PDMS in eccesso che ha rivestito l'acrilico con acetone e carta assorbente.

Fare attenzione a non disturbare il PDMS non polimerizzato. Ora, cuocere lo strato di base con il PDMS in un forno a 65 gradi Celsius per due ore per polimerizzare il PDMS. Pipettare un millilitro di PDMS su un vetrino e quindi utilizzare un altro vetrino per distribuire uniformemente il PDMS fino a quando non inizia a fuoriuscire dai lati.

Polimerizzare su una piastra calda a 150 gradi Celsius per 10 minuti. Tagliare il PDMS polimerizzato in un rettangolo con le stesse dimensioni del dispositivo MY-133-V-2000. Quindi, utilizzando lo strato intermedio dell'acrilico come stampo, praticare dei fori per il serbatoio e tagliare una finestra di visualizzazione quadrata nel PDMS per realizzare la guarnizione PDMS.

Ora, rimuovere il MY-133-V-2000 polimerizzato dal forno UV e rimuovere il canale dal negativo e posizionarlo su un substrato piatto con il lato del canale rivolto verso l'alto. Rimuovere lo strato di base contenente il PDMS polimerizzato dal forno a 65 gradi e posizionarlo sul substrato. Quindi, posizionare il substrato con il canale MY-133-V-2000 e lo strato di base nel pulitore al plasma di ossigeno.

Impostare la pressione del vuoto su 200 millitorr e il livello di radiofrequenza su alto. Procedere al trattamento superficiale del canale e del substrato di vetro per 30 secondi. Il plasma di ossigeno dovrebbe illuminarsi di blu quando il pulitore al plasma è acceso.

Dopo 30 secondi, rimuovere sia il microcanale che lo strato di base dal pulitore al plasma. Utilizzando una pinza, posizionare immediatamente il canale MY-133-V-2000 con il lato rivolto verso il basso nell'intaglio rettangolare dell'acrilico dello strato di base, in modo che entri in contatto con il PDMS. Ora, posiziona la guarnizione PDMS sopra il dispositivo MY-133-V-2000, allineando i fori nella guarnizione con i serbatoi nel dispositivo.

L'uso di questa guarnizione PDMS è fondamentale perché il PDMS è più elastico del MY-133-V-2000 e può quindi essere compresso di più. Ciò consente di trasferire la forza dall'acrilico al microcanale senza rompere il vetro. A questo punto, posizionare il dispositivo non finito su una piattaforma rialzata sopra il banco per fornire una superficie di serraggio per il montaggio del dispositivo.

Quindi, estrarre tre millilitri di cemento acrilico utilizzando una siringa. Distribuire una quantità sufficiente di cemento acrilico sopra lo strato di base per fornire un rivestimento sottile. Rendi il cappotto il più uniforme possibile e non lasciare che il materiale penetri nel canale.

Ora, posiziona il pezzo di acrilico dello strato intermedio sopra l'acrilico dello strato di base. Assicurarsi che i fori siano allineati con i serbatoi del canale MY-133-V-2000. Fissare lo strato intermedio sullo strato di base il più strettamente possibile e tenerlo premuto per due minuti mentre il cemento si indurisce per legare insieme i pezzi di acrilico.

Assicurarsi che i serbatoi non siano ostruiti durante questa fase per evitare che l'aria rimanga intrappolata sotto il dispositivo MY-133-V-2000. L'aria intrappolata tra il MY-133-V-2000 e il substrato rimarrà intrappolata se i serbatoi sono ostruiti. Ciò causerà perdite nel dispositivo finito.

Pertanto, è fondamentale che i fori non siano ostruiti durante questo passaggio. Dopo che il cemento si è indurito, rimuovere la pressione dal dispositivo. Posizionare il cemento acrilico sullo strato intermedio nei punti di contatto previsto con lo strato superiore dell'acrilico.

Ora, posiziona lo strato superiore dell'acrilico sul pezzo dello strato intermedio dell'acrilico, assicurandoti che i fori siano allineati con i serbatoi. Lasciarlo riposare sulla panca per due minuti mentre il cemento acrilico si asciuga. Testare il dispositivo MY-133-V-2000 aggiungendo 10 microlitri di colorante alimentare o acqua deionizzata in uno dei fori del serbatoio per verificare l'adesione e il flusso.

Inserire un tubo nel serbatoio opposto e collegare l'altra estremità a un sifone. Accendi l'aspirapolvere per tirare il colorante o l'acqua attraverso il canale per assicurarti che sia stato creato un dispositivo di successo. Controllare al microscopio per verificare che non vi siano perdite nel canale o nel serbatoio.

Usando l'aspirapolvere, rimuovere il colorante da entrambi i serbatoi. Quindi, sciacquare i serbatoi con etanolo. Metti l'etanolo in un serbatoio.

Estrarre l'etanolo usando il vuoto. Lasciare riposare l'etanolo a temperatura ambiente per 10 minuti. Spruzzare accuratamente il canale con etanolo e metterlo in una capsula di polistirene sterile.

Avvolgerlo strettamente con Parafilm e conservarlo fino al momento del bisogno. La mappa di calore mostrata qui rappresenta la massa delle cellule MCF-7 aderenti al FOD in un microcanale. Pochi manufatti sono visibili vicino alle pareti del microcanale.

In questa misurazione, una singola cella MCF-7 aderente può essere vista sul bordo del microcanale vicino alla parete. L'assenza di artefatti in prossimità della parete consente di ottenere misure quantitative precise, anche quando le cellule si trovano in prossimità della parete del canale. Questa figura finale mostra una coppia di celle MCF-7 posizionate vicino alla parete del microcanale.

La massa di queste cellule in ogni pixel può essere misurata con precisione utilizzando la microscopia di fase quantitativa. Seguendo questo protocollo, è importante non ostruire i serbatoi durante il serraggio del dispositivo mentre il cemento acrilico si asciuga. L'ostruzione dei fori intrappola l'aria tra il MY-133-V-2000 e il substrato.

Ciò causerà perdite nel canale durante il flusso. L'uso di MY-133-V-2000 come materiale di fabbricazione per dispositivi microfluidici offre un netto vantaggio rispetto ai materiali tradizionali, riducendo notevolmente gli artefatti vicino alle pareti dei microcanali. Ciò consente di effettuare misurazioni quantitative in prossimità di strutture a microcanali.

I dispositivi realizzati con questo protocollo sono compatibili con qualsiasi tecnica di microscopia comunemente utilizzata. Questo protocollo si basa sulla patografia cellulare, quindi è compatibile con altre tecniche microfluidiche avanzate come i selezionatori cellulari o i generatori di gradienti per lo studio del comportamento cellulare. Nel complesso, questa tecnica fornisce ai ricercatori un nuovo strumento per i saggi microfluidici biomedici basati sulla microscopia.

La maggiore precisione che garantisce alle misure quantitative nei microcanali ha importanti applicazioni in molti campi, tra cui la scoperta di farmaci e l'analisi di singole cellule.