Name: TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara il protocollo tChIP-Seq per analizzare le modificazioni istoniche specifiche delle cellule neuronali nel genoma murino. Questo metodo consente di isolare la cromatina e studiare la regolazione epigenetica con elevata precisione.

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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Iwasaki per lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (n. 26113005 S.N. e JP17H05679 alla S.C.); una sovvenzione per giovani scienziati (A) (JP17H04998 per S.C.) dal Ministero della pubblica istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone (MEXT); e la pionieristica progetti "Cellular Evolution" e tutte le RIKEN progetto "Malattia ed epigenoma" RIKEN (a S.N. e S.C.).

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dalla divisione sicurezza di RIKEN (H27-EP071) e condotti con regolamenti e linee guida pertinenti.
1. dissezione del tessuto
<ol><li>Sezionare i tessuti di interesse in piccoli pezzi (circa < 3 mm2) usando le forbici di primavera. Nota: Frammenti di tessuto più grandi richiedono più tempo per congelare, e pezzi più piccoli verranno riporto più grandi volumi di tampone, entrambi i quali possono alterare i risultati.</li>
	<li>Aggiungere i frammenti di tessuto dissecato in un contenitore pulito riempito con azoto liquido e raccoglierli in provette da 2 mL (1 parte per tubo) riempito con azoto liquido. Nota: I tubi con una superficie idrofila sono consigliati per questo passaggio.</li>
	<li>Disporre le provette a-80 ° C per > 5 min con il tappo aperto per far evaporare l'azoto liquido rimanente. Nota: Dopo aver chiuso il tappo, frammenti di tessuto possono essere conservati a-80 ° C per un mese prima dell'uso.</li>
</ol>2. fissazione delle cellule
Nota: Abbiamo usato una smerigliatrice criogenica utile per questo passaggio. Un apparecchio alternativo può essere utilizzato.
<ol><li>Posto i 2 mL-basso legame provette contenenti i campioni di tessuto su un rack di ghiaccio metallo raffreddato in azoto liquido.</li>
	<li>Inserire un punto metallico in un 1,5 mL-tubo e chill con azoto liquido. Posizionarlo sul cestello ghiaccio in metallo.</li>
	<li>Aprire il 2 mL-tubo e inserire il proiettile di metallo prechilled nella provetta. Chiudere il tappo, impostare i 2 mL-tubi in supporto del tubo di una smerigliatrice criogenico utile e immergere immediatamente il supporto tubo assemblato in azoto liquido per 1 min.</li>
	<li>Inserire il supporto di tubo congelato la cassetta esterna del macinino criogenico utile ed agitare vigorosamente 60 volte per 30 s.</li>
	<li>Smontare il supporto tubo, rimuovere il proiettile in metallo e posto i 2 mL-tubo su un raffreddatore di campioni prechilled a-20 ° C.</li>
	<li>Il campione viene posto più fresco a-20 ° C per 15 min evitare il congelamento di fissativo nel passaggio successivo.</li>
	<li>Portare il campione più fresco al banco, aprire il coperchio del tubo e immediatamente gocciolare 900 µ l di 1% di formaldeide in esso. Dopo parecchie volte il pipettaggio, trasferire la sospensione nel nuovo 2 mL-tubo contenente 900 µ l di 1% di formaldeide e correzione per 10 min con delicata rotazione in un incubatore a 23 ° C. Attenzione: La formaldeide è tossica e nociva.</li>
	<li>Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 µ l di glicina di 2,5 M per ogni provetta e centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di gelida tampone fosfato salino (PBS), centrifuga per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte (3 lavaggi in totale). Nota: Campioni fissi possono essere congelati a flash di azoto liquido e conservato a-80 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerolo, 0,5% w/v NP-40, inibitore della proteasi di 0.25% w/v Triton x X-100 e 0.1 cocktail) per il pellet, dispensare diverse volte e ruotare per 10 min a 4 ° C. Nota: Il Buffer di lisi 1 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x cocktail dell'inibitore di proteasi) per il pellet, vortice e ruotare per 10 min a 4 ° C. Nota: Il Buffer di lisi 2 dovrebbe essere filtrato e conservato a 4 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 800 µ l di tampone di dosaggio (RIPA) di radioimmunoprecipitation con inibitore di proteasi 1x cocktail al pellet e risospendere il pellet di pipettaggio.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone RIPA con 1 inibitore della proteasi x cocktail. Procedere immediatamente alla fase successiva.</li>
</ol>3. cromatina tosatura
<ol><li>Trasferire il lisato in una provetta di sonicatore e quindi posizionare il tubo su un ultrasonicatore.</li>
	<li>La cromatina di taglio con le seguenti impostazioni: temperatura: 4 ° C; picco di potenza incidente: 175 W; fattore di utilizzo: 10%; cicli/scatti in sequenza: 200; e tempo: 2.400 s.</li>
	<li>Trasferire il campione per un 1,5 mL-proteina obbligatoria bassa provetta e centrifugare per 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo basso legame proteico. Nota: Il campione può essere flash-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C.</li>
</ol>4. qualità del controllo dei DNA (Reverse reticolazione)
<ol><li>Mix 20 µ l del lisato e 180 µ l di tampone di eluizione di ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v sodio dodecil solfato (SDS)) in una provetta di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Incubare il campione a 65 ° C in un termociclatore per 6 ore con il coperchio del termociclatore aperto. Tenere il coperchio del termociclatore aperto per evitare eccessiva denaturazione. Nota: Il tampone di eluizione di ChIP dovrebbe essere filtrato e conservato a temperatura ambiente prima dell'uso. Al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di 10 mg/mL RNasi A, vortex e incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>µ L 6,5 di 15 mg/mL proteinasi K, vortice e incubare a 55 ° C per 60 min.</li>
	<li>Trasferire la reazione ad un tubo basso legame al DNA, aggiungere 4 µ l di glicogeno 5 mg/mL e vortice. Quindi, aggiungere 200 µ l di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1) e centrifugare per 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta di basso associazione DNA nuova. Aggiungere 200 µ l di tampone Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) per la soluzione di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico rimanente e centrifugare per 5 min a 18.000 x g e a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e mescolare con il surnatante primo.</li>
	<li>Aggiungere 900 µ l di etanolo ghiacciata e incubare per 1 h a-20 ° C. Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso a 4 - 6 h.</li>
	<li>Centrifuga per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di etanolo di 75% ghiacciata per il pellet e centrifugare per 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).</li>
	<li>Scartare il surnatante accuratamente e asciugare all'aria per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e sciogliere il DNA mediante incubazione a temperatura ambiente per 30 min o a 4 ° C durante la notte. Evitare nel Vortex o pipettaggio. Mantenere questo DNA come "input" e utilizzarlo per la preparazione di libreria se necessario.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di DNA con un fluorometro seguendo le istruzioni del produttore (Vedi tabella dei materiali) e controllare la distribuzione delle dimensioni con una macchina di elettroforesi di microfluidica (Vedi dati rappresentativi, mostrati in figura 2a). uso 10 ng o meno DNA per questo test. Nota: Frammenti di 100 – 500 paia di basi (bp) dovrebbero fare 50% o più del DNA.</li>
</ol>5. purificazione di affinità dall'anticorpo anti-FLAG
Nota: Per neurone tChIP-Seq, tessuti cerebrali da 8 topi sono in genere utilizzati per un campione di tChIP-Seq per preparare 2 ng di DNA purificato da tandem immunitario-purificazione (Vedi punto 7.1). Nelle nostre mani, 0,1 ng di DNA ancora fornite librerie del DNA di alta qualità per ChIP-Seq (Kadota, inedito). Quindi, in teoria, un unico mouse può essere sufficiente effettuare neurone tChIP-segg. L'importo richiesto deve essere ottimizzato per il tipo di tessuti e cellule di interesse. Per il controllo negativo dell'esperimento imumuno-purificazione, tessuto cerebrale lisato dai topi senza qualsiasi espressione di H2B-bandiera dovrebbe essere preparato e utilizzato.
<ol><li>Dispensare 200 µ l di biglie magnetiche coniugato di immunoglobuline anti-topo di pecora G (IgG) in una provetta di basso legame proteico.</li>
	<li>Posizionare il tubo su un supporto magnetico e attendere per 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e vortexare. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 1 mg/mL di un anticorpo anti-FLAG e ruotare per 5 ore a 4 ° C. Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.</li>
	<li>Lavare le perline seguendo passo 5.2. Posizionare le perline in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 1110 µ l di tampone RIPA e poi 900 µ l di 10 x blocco reagente, 180 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 10 µ l di 100 x cocktail dell'inibitore di proteasi e 6,8 mL del lisato preparato nel passaggio 3. Dividere questa miscela in 5 tubi di proteina obbligatoria bassa. Ruotare per 6 h a 4 ° C. Nota: al termine dell'incubazione può essere esteso per tutta la notte.</li>
	<li>Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio 5 volte (6 lavaggi in totale). Piscina tutte le perline in un tubo di singola proteina obbligatoria bassa.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2B e C). Procedere immediatamente alla fase successiva.</li>
</ol>6. affinità purificazione dall'anticorpo Anti-H3K4me3 e reticolazione inversa
Nota: La seguente perlina preparazione che passaggi (6.1-6.4) devono essere eseguiti prima di passaggio 5.7.
<ol><li>Dispensare 40 µ l di biglie magnetiche coniugato di IgG di anti-topo pecore in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.</li>
	<li>Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata e mescolare delicatamente. Ripetere questo passaggio (due lavaggi in totale).</li>
	<li>Aggiungere 4 µ l di anticorpo anti-H3K4me3 1 mg/mL e ruotare per 6 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare le perline seguendo passo 6.2. Posizionare le perline in una provetta da 2 mL-proteina che lega bassa.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 1558 µ l di tampone RIPA e quindi aggiungere 200 µ l di 10 x blocco reagente, 40 µ l di soluzione di Denhardt: 50x, 2 µ l di 100 x inibitore della proteasi cocktail e 200 µ l di eluato preparato nel passaggio 5.7. Ruotare durante la notte a 4 ° C. Nota: La SDS nel buffer di eluizione di ChIP è stata diluita più di 10 volte in questa incubazione.</li>
	<li>Collocare la provetta sul supporto magnetico e attendere 1 min per il surnatante diventare chiaro. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL di tampone RIPA e mescolare delicatamente. Ripetere questa operazione 4 volte (5 lavaggi in totale). Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in una provetta di associazione basso di DNA e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di eluizione di ChIP e ruotarlo per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire l'eluato un nuovo DNA basso bindingTube. Nota: L'eluato possa essere conservato a-80 ° C.</li>
	<li>Seguire il passaggio 4 per decrosslinking del DNA. Risospendere il DNA purificato in 20 µ l di buffer di TE.</li>
	<li>Controllare la qualità del DNA come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2D). (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento mediante PCR quantitativa come descritto in precedenza2. Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.</li>
</ol>7. libreria costruzione
<ol><li>Per ogni input e il campione di DNA ChIP, calcolare la percentuale di DNA nella regione 100 – 500-bp utilizzando la funzione di analisi di striscio del software per la macchina di elettroforesi di microfluidica. Stimare il volume di campione richiesto per ottenere 2 ng di 100 – 500 bp DNA. Utilizzare 20 ng DNA nell'intervallo 100-500-bp come l'esempio di "input".</li>
	<li>Pipettare campioni di DNA in provette per PCR 8-striscia e H2O per portare il volume totale a 10 µ l. (opzionale) se il volume del DNA supera 10 µ l, proporzionalmente la scalabilità di aggiungere la seguente reazione di fine-riparazione e la selezione della dimensione.</li>
	<li>Preparare il mix master fine-riparazione (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 4 µ l di master mix fine-riparazione del DNA ed incubare per 30 min a 20 ° C.</li>
	<li>36 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 e 0,6 x volume (30 µ l) di solido fase biglie magnetiche reversibili immobilizzazione (SPRI) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta nuova, aggiungere 1,2 x volumi (60 µ l) di biglie magnetiche SPRI e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.</li>
	<li>Lavare le perle due volte con 200 µ l di 80% EtOH, che tiene il tubo ancora sul magnete.</li>
	<li>Centrifugare brevemente la provetta per raccogliere il residuo EtOH nella parte inferiore e reimmetterlo sul magnete. Rimuovere accuratamente l'EtOH residua.</li>
	<li>Lasciare il coperchio tubo aperto per 1-2 min consentire l'EtOH ad evaporare.</li>
	<li>Chiudere il coperchio e tenere il tubo sul ghiaccio. Nota: Ora avete ottenuto dimensione selezionata del DNA di 100 – 500 bp le perline. Ulteriori dettagli sulla selezione di dimensione doppia possono essere trovati sul sito Web del produttore (www.beckman.com).</li>
	<li>Preparare A-tailing master mix (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Risospendere le perline (da passo 7.10) con 10 µ l di mix master A-tailing e incubare per 30 min a 30 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 1,8 x volume (18 µ l) di polietilenglicole (PEG) / soluzione di NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Procedura: 7,7-7.11 per purificare il DNA.</li>
	<li>Preparare la miscela di buffer di legatura (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>8 µ l di miscela tampone legatura sulle perle (da passo 7,14), aggiungere 1 µ l di 1 adattatore µM e risospendere le perline. Utilizzare 1 µ l di 5 adattatore di µM per l'esempio di input. Considerare l'utilizzo di schede diverse per ogni campione per multiplexing.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di DNA ligasi e incubare per 15 minuti a 20 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 1,0 x volume (10 µ l) di soluzione di PEG/NaCl, risospendere le perline e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.</li>
	<li>Pipettare 25 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.</li>
	<li>Aggiungere 1,0 x volume (25 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.</li>
	<li>11 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.</li>
	<li>Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante in una nuova provetta PCR 8-strip.</li>
	<li>Preparare in tempo reale PCR master mix (Vedi materiali per dettagli).</li>
	<li>Pipettare 8,5 µ l di mix master in tempo reale di PCR in una piastra 384 pozzetti quantitativa di PCR (qPCR) e aggiungere 1,5 µ l della scheda di legato del DNA (da passo 7,26).</li>
	<li>Pipettare 10 µ l di ogni standard fluorescente a vuoto wells.</li>
	<li>Eseguire PCR in tempo reale con il seguente programma: (98 ° C per 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C per 15 s, 60 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s) x 20 cicli, e (72 ° C per 60 s) x 1 ciclo.</li>
	<li>Determinare il numero di cicli PCR necessari a raggiungere l'intensità di fluorescenza del fluorescente Standard 2.</li>
	<li>Preparare il PCR master mix (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Pipettare 11,5 µ l della miscela PCR padrone nel restante DNA adattatore-legati (da passo 7,26) ed eseguire la PCR come indicato nel passo 7.30 con i cicli PCR determinati nel passaggio 7,31.</li>
	<li>Aggiungere 1,0 x volume (20 µ l) di soluzione PEG/NaCl e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Procedura: 7,7-7.10 per purificare il DNA.</li>
	<li>Pipettare 20 µ l di 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 nella provetta e risospendere le perline.</li>
	<li>Mettete il tubo su un supporto magnetico e attendere fino a quando il surnatante diventa chiaro.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante in una provetta da 1,5 mL-DNA basso legante nuovo.</li>
	<li>Controllare la qualità della libreria come descritto al punto 4.11 (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 2E e F). Utilizzare 1 µ l di campione di DNA di biblioteca. (opzionale) Eseguire analisi di arricchimento di qPCR come descritto in precedenza 2. Dieci volte o maggiore arricchimento dovrebbe essere osservato.</li>
</ol>8. sequenziamento
<ol><li>Le librerie in un sequencer di prossima generazione di sequenza (Vedi dati rappresentativi illustrati nella Figura 3). Nota: La sequenza profondità sufficiente per l'analisi dei dati varia a seconda delle dimensioni del genoma dell' organismo3. Per uso umano e mouse, si consiglia di ottenere letture almeno 20 milioni di single-end. Secondo la resa di letture, multiplexing potrebbe essere redditizio.</li>
</ol>

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
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<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il nostro protocollo è stato ottimizzato per i neuroni del cervello del mouse, in cui l'espressione della bandierina-etichettate H2B è indotto tramite l'iniezione di tamoxifene. I promotori utilizzati per H2B espressione, materiali di base del tessuto e la quantità dei tessuti sono parametri chiave per successo tChIP-segg. Così, l'ottimizzazione di questi fattori da considerare per ogni tipo di cellula di interesse.
Un passaggio fondamentale tra le procedure utilizzate in questo protocollo è i...

Tessuti di animali consistono di tipi cellulari diversi. La regolazione genica in ogni cella definisce il tipo di cella. Modificazioni della cromatina - modifica del DNA di metilazione e istone - sono alla base della specificità di cellula-tipo dell'espressione genica. Così, la misura della regolazione epigenetica in ciascun tipo di cella è stata voluta, ma è stato una sfida tecnica.
Per studiare l'epigenetica in un tipo di cellula particolare, sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq) è stato sviluppato di recente (Figura 1)1. In tChIP, proteina di nucleo epitopo-etichetta dell'istone H2B è espresso da un promotore di cellula-tipo-specifico. Questa funzione permette l'isolamento di cromatine dalle celle di interesse, anche se il materiale viene avviato da una miscela di vari tipi cellulari. Seguenti ChIP-Seq — purificazione della cromatina attraverso un contrassegno dell'istone per volta e generazione sequenziamento profondo del DNA isolato — possiamo monitorare lo stato epigenetico del tipo cellulare mirati in maniera genoma.
Usando questa tecnica, abbiamo recentemente studiato trimethylation di neurone-specific dell'istone H3 proteina a lisina 4 (H3K4me3) marchi. In quello studio, abbiamo sviluppato un topo knock-nel quale C-terminale Bandierina-etichettate H2B proteina è stata espressa su ricombinazione Cre-mediata (Rosa26CAG floxed-pA H2B-bandiera). Dall'incrocio con un mouse che possiedono il gene Cre-reticolo endoplasmatico endoplasmatico (ER) sotto il controllo del promotore CamK2a, la linea di topo ottenuti indotta H2B-bandiera in neuroni attivi su tamoxifen iniezione (Camk2aH2B-bandiera)1. A partire dal cervello della riga del mouse stabilito, abbiamo effettuato tChIP-Seq con anticorpo anti-H3K4me3. Poiché H3K4me3 marchi corrispondono spesso a regioni promotrici, potremmo scoprire centinaia di mRNAs specificamente espressi nei neuroni1.
Qui, descriviamo un metodo tipico tChIP-Seq che copre le misure da dissezione del tessuto per la costruzione della libreria (Figura 1). L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di condividere le nostre best practice per le prestazioni di tChIP-Seq e la futura applicazione di questo metodo ad altri tipi di cellule e modificazioni istoniche.

<table><tbody><tr><td>Provetta Protein LoBind, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No. 0030108132</td><td>Per lisi cellulare</td></tr><tr><td>Provetta Protein LoBind, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No. 0030108116</td><td>Per ChIP e preparazione di librerie</td></tr><tr><td>Provetta DNA LoBind, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No. 0030108051</td><td>Per ChIP e preparazione di librerie</td></tr><tr><td>Provetta per PCR a 8 strisce</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>Per ChIP e preparazione di librerie</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>Pratico macinatore criogenico per produrre polvere cellulare per il fissaggio Proiettile</td></tr><tr><td>metallico</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>Accessorio di SK Mill</td></tr><tr><td>Provetta in acciaio inossidabile da 2 mL</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>Un'opzione per la cella supporto per provette</td></tr> in <tr><td>acciaio inox da 2 mL</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>Un'opzione per la lisi cellulare</td></tr><tr><td>16% formaldeide (p/v), senza metanolo</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>Per fissare le cellule. Preparare una soluzione all'1% prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>Preparare 2,5 M stock</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>Per il lavaggio di lisato e DNA purificato</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>Per tampone di lisi 1. Preparare 1 M, pH 7,5 brodo.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, grado di biologia molecolare</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, grado di biologia molecolare</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>Per tampone di lisi 1, tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>Per tampone di lisi 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>Per tampone di lisi 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, grado di biologia molecolare</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>Per tampone di lisi 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>Per tampone di lisi 2, tampone di eluizione ChIP e tampone Tris-EDTA-NaCl. Preparare 1 brodo M, pH 8.0.</td></tr><tr><td>0,1 M EGTA pH neutro</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>Per tampone di lisi 2</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>Per bloccare la degradazione del</td></tr><tr><td>tampone RIPA</td> proteico <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Per la lisi cellulare e il lavaggio</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>Provetta sonicatrice. Accessorio dell'ultrasuonatore focalizzato</td></tr><tr><td>Ultrasuoni focalizzati</td><td>Covaris</td><td>S220 o E220</td><td>Per digerire il DNA in dimensioni adeguate per ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10%</td><td>SDS Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>Per ChIP Tampone di eluizione</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>Per purificare il DNA dalla proteinasi K del lisato</td></tr><tr><td>, ricombinante, grado PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td><td>Per purificare il DNA dal lisato</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>Prepara una soluzione al 70%</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-FLAG M2 prodotto nel topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Per purificare la cromatina espressa nelle cellule di interesse</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Pecora Anti-Topo IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>Questo può essere utilizzato per anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>Anti-tri-metil istone H3 (K4), anticorpo monoclonale di topo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>Qualsiasi altro anticorpo che funziona per l'analisi ChIP funzionerà</td></tr><tr><td>10x Reagente bloccante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Per il blocco durante la purificazione di affinità</td></tr><tr><td>Denhardt' s soluzione</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>Per il blocco durante la purificazione di affinità</td></tr><tr><td>Glicogeno (5 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Per purificare il DNA dal lisato</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>Per la quantificazione del DNA isolato</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Per la quantificazione del DNA isolato</td></tr><tr><td>Provetta da 0,5 mL</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Per la quantificazione mediante Qubit</td></tr><tr><td>Fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>Per purificare il DNA dal lisato</td></tr><tr><td>Perline AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perline magnetiche SPRI per la preparazione della libreria</td></tr><tr><td>Portaghiaccio in metallo</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>Per mantenere congelato</td></tr> <tr><td>il lisato cellulareRaffreddatore di campioni</td><td>New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>Aiuta a fissare le cellule con danni minimi</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>Per controllare la qualità dei frammenti di DNA isolati. È possibile utilizzare un altro analizzatore di frammenti.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>Fornito con il Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Per verificare la qualità dei frammenti di DNA isolati Kit di</td></tr><tr><td>preparazione della libreria KAPA LTP</td><td>Roche</td><td>07961898001</td><td>Fornito con 10 tamponi per la riparazione dell'estremità KAPA, la miscela di enzimi per la riparazione dell'estremità KAPA, il tampone per la coda A KAPA, l'enzima per la coda A KAPA, il tampone per la legatura KAPA, la DNA ligasi KAPA e la soluzione PEG/NaCl</td></tr><tr><td>Codici a barre per DNA NEXTflex</td><td>Adattatore BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>per la preparazione della libreria. Fornito con adattatori per codici a barre DNA e miscela di primer.</td></tr><tr><td>Kit di amplificazione per librerie in tempo reale KAPA</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>Fornito con 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix e standard fluorescenti 2x</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>Per la preparazione della libreria. Inoltre, questo enzima può essere necessario per il kit di amplificazione della libreria in tempo reale KAPA</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5 per l'eluizione del DNA</td></tr><tr><td>Piastra qPCR a 386 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Per la PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 7 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>Per quantificare la</td></tr><tr><td>pellicola adesiva ottica DNA MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Per PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva trasparente MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>Per la sigillatura di piastre</td></tr><tr><td>Master mix</td><td></td><td></td> di riparazione finale <td>Combina 1,4 &; L di 10x KAPA Tampone di riparazione fine, 1 & micro; L di KAPA End Repair Enzyme Mix, e 1,6 &micro; L di H2O</td></tr><tr><td>A-taling master mix</td><td></td><td></td><td>Combine 1 &micro; L di tampone KAPA A-Tailing, 0,6 & micro; L dell'enzima KAPA A-Tailing e 8,4 &micro; L di H2O</td></tr><tr>Miscela <td></td><td></td><td>tampone di legatura</td><td>Combine 2 &micro; L del tampone di legatura KAPA e 6 &micro; L di H2O</td></tr><tr>Miscela <td></td><td></td><td>master PCR in tempo reale</td><td>Combina 5 &; micro; L di 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix in tempo reale, 0,35 &; L di PCR Primer Mix (10 &micro; M ciascuno di primer diretto AATGATACGGCGACCACCGAG e primer inverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), e 3.15 &micro; L di H2O</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td></td><td></td><td>Combine 10 &; micro; L di 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 &micro; L di PCR Primer Mix e 0,6 &micro; L di H2O</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>Browser del genoma per visualizzare i dati di sequenziamento</td></tr><tr><td>DNA olgionucleotide: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Un primer per amplificare la regione del promotore dell'olgionucleotide del DNA GAPDH</td></tr><tr><td>: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Un primer per amplificare la regione del promotore di GAPDH</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td><td>Per quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>Per quantificare il DNA corrispondente alla regione del promotore GADPH</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: cellula-tipo-specifico epigenome profilatura

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Regolazione epigenetica svolge ruoli centrali nell'espressione genica. Dal momento che la modifica dell'istone è stato scoperto nel 1960, le sue funzioni fisiologiche e patologiche sono stati studiati estesamente. Infatti, l'avvento della nuova generazione sequenziamento profondo e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) via gli anticorpi specifici istone modifica ha rivoluzionato il nostro punto di vista della regolazione epigenetica in tutto il genoma. Al contrario, tessuti in genere consistono di tipi cellulari diversi e loro miscela complessa pone sfide analitiche ad indagare l'epigenoma in un tipo di cella specifica. Per risolvere lo stato di tipo-specific cromatina delle cellule in un modo del genoma, recentemente abbiamo sviluppato il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), che è basato sulla purificazione selettiva della cromatina di proteine istoniche core contrassegnati dalla cella tipi di interesse, seguita da ChIP-seq. L'obiettivo del presente protocollo è l'introduzione delle migliori pratiche di tChIP-segg. Questa tecnica fornisce uno strumento versatile per epigenome tessuto-specifica indagine in modificazioni istoniche diversificata e organismi modello.

Qui, descriviamo la dissezione del tessuto, fissazione, lisi cellulare, purificazione tandem della cromatina e preparazione libreria DNA Sequencer di prossima generazione. Durante le procedure, si può testare la qualità del DNA, che è la chiave del successo sequenziamento, a più passaggi (Figura 2). Poiché un singolo nucleosoma è in genere circondato da 147 bp DNA 4, tranciata DNA non dovrebbe essere più breve di quella dimensione. Sub...

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come quante modifiche cromatiche sono regolate in modo specifico in un tipo di cellula insieme ai genomi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare la cromatina dalle cellule prese di mira e poi seguire la tipica zingara a valle. Quindi questo metodo può fornire informazioni sul trimincil specifico dei neuroni, lysinc 4, opisoncilly.Può anche essere applicato ad altre modifiche istono, altri tipi di cellule e quindi altri organismi modello. A dimostrare la procedura sarà Mari Mito, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, usa le forbici a molla fini per sezionare il tessuto di interesse in piccoli pezzi.Aggiungere i frammenti di tessuto a un contenitore pulito pieno di azoto liquido. Quindi, trasferire i frammenti di tessuto in due tubi millilitro riempiti con azoto liquido. Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per cinque minuti con il tappo aperto per evaporare l'azoto liquido.Posizionare i tubi contenenti i campioni di tessuto su una griglia di ghiaccio metallica refrigerata. Quindi, posizionare un proiettile metallico in un tubo da 1,5 millilitri e raffreddarlo con azoto liquido. Posizionare il proiettile metallico refrigerato su uno dei tubi campione.Chiudere il tappo e impostare il tubo nel supporto del tubo di una smerigliatrice criogenica. Immediatamente, immergere il supporto del tubo assemblato in azoto liquido per un minuto. Inserire il portatubi congelato nella cassetta esterna della smerigliatrice criogenica.E scuotilo vigorosamente per 30 secondi, 60 volte. Dopo questo, smontare la smerigliatrice criogenica, rimuovere il proiettile metallico. E posizionare il tubo in un dispositivo di raffreddamento del campione pre-refrigerato.Conservare il dispositivo di raffreddamento a -20 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere quindi 900 microlitri di formaldeide all'1% al tubo e alla pipetta da mescolare. Trasferire la sospensione su un nuovo tubo da due millilitri con 900 microlitri di formaldeide all'1%.Quindi, fissare la sospensione per 10 minuti con una rotazione delicata a 23 gradi Celsius. Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 microlitri di glicina molare 2.5 al tubo. E centrifugare a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo questo, scarta il super supernatante. Aggiungere un millilitro di PBS al tubo e al vortice da mescolare. Centrifuga a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Ripetere questo passaggio di lavaggio, altre due volte. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi uno al pellet e alla pipetta da mescolare. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.Aggiungere un millilitro di tampone dilisi due al pellet e al vortice da mescolare. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Successivamente, aggiungere 800 microlitri di tampone di asssay di immunoprecipitazione radio con cocktail inibitore della proteasi al pellet e pipetta da mescolare.Centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi al pellet. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.Aggiungere un millilitro di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi. Immediatamente dopo aver aggiunto il tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi, trasferire il lysate su un tubo sonicatore. E posizionare il tubo su un ultrasonicatore.Utilizzando le impostazioni delineate nel protocollo di testo, tagliare la cromatina. Quindi, trasferire il campione in un tubo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. E centrifugarlo per cinque minuti a 20.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius.Raccogliere il supernatante dal campione e trasferirlo in un nuovo tubo proteico a basso legame. In questo protocollo è stato introdotto e dimostrato il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina tandem. Durante la procedura, la qualità del DNA è stata testata in più fasi.Subito dopo la sonicazione, il DNA tranciato è stato isolato e testato con la macchina per l'elettroforesi microfluidica. Dopo aver usato anticorpi anti-FLAG e anticorpi anti-H3K3me3 per eseguire la purificazione dell'affinità, la qualità del DNA è stata nuovamente controllata. La specificità della purificazione immunitaria del DNA su H2B-FLAG è stata confermata con campioni di controllo negativi.Dove sono state rilevate quantità trascurabili di DNA. Più avanti nel protocollo, è stata verificata la qualità della libreria di sequenziamento. Il ChIP e il T-ChIP di successo sono stati evidenziati attraverso l'analisi dell'arricchimento utilizzando primer rivolti alla regione promotrice del gene GAPDH.Sono state ottenute ridistribuzioni rappresentative lungo tre geni neuronali. E l'arricchimento delle letture alle cinque estremità principali dei geni da parte del neurone T-ChIP cerca su tutto il cervello ricerca T-ChIP è stato osservato. Dopo una stabilizzazione, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo epigenetico per esplorare la modifica specifica dell'istono del tipo di cellula ampiamente nei neuroni nei topi.Non dimenticare che lavorare con la formaldeide può essere estremamente pericoloso e prendere precauzioni come indossare indumenti e occhiali di gomma dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.

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