TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura
January 23rd, 2019
Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come quante modifiche cromatiche sono regolate in modo specifico in un tipo di cellula insieme ai genomi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare la cromatina dalle cellule prese di mira e poi seguire la tipica zingara a valle. Quindi questo metodo può fornire informazioni sul trimincil specifico dei neuroni, lysinc 4, opisoncilly.
Può anche essere applicato ad altre modifiche istono, altri tipi di cellule e quindi altri organismi modello. A dimostrare la procedura sarà Mari Mito, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, usa le forbici a molla fini per sezionare il tessuto di interesse in piccoli pezzi.
Aggiungere i frammenti di tessuto a un contenitore pulito pieno di azoto liquido. Quindi, trasferire i frammenti di tessuto in due tubi millilitro riempiti con azoto liquido. Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per cinque minuti con il tappo aperto per evaporare l'azoto liquido.
Posizionare i tubi contenenti i campioni di tessuto su una griglia di ghiaccio metallica refrigerata. Quindi, posizionare un proiettile metallico in un tubo da 1,5 millilitri e raffreddarlo con azoto liquido. Posizionare il proiettile metallico refrigerato su uno dei tubi campione.
Chiudere il tappo e impostare il tubo nel supporto del tubo di una smerigliatrice criogenica. Immediatamente, immergere il supporto del tubo assemblato in azoto liquido per un minuto. Inserire il portatubi congelato nella cassetta esterna della smerigliatrice criogenica.
E scuotilo vigorosamente per 30 secondi, 60 volte. Dopo questo, smontare la smerigliatrice criogenica, rimuovere il proiettile metallico. E posizionare il tubo in un dispositivo di raffreddamento del campione pre-refrigerato.
Conservare il dispositivo di raffreddamento a -20 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere quindi 900 microlitri di formaldeide all'1% al tubo e alla pipetta da mescolare. Trasferire la sospensione su un nuovo tubo da due millilitri con 900 microlitri di formaldeide all'1%.
Quindi, fissare la sospensione per 10 minuti con una rotazione delicata a 23 gradi Celsius. Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 microlitri di glicina molare 2.5 al tubo. E centrifugare a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo questo, scarta il super supernatante. Aggiungere un millilitro di PBS al tubo e al vortice da mescolare. Centrifuga a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Ripetere questo passaggio di lavaggio, altre due volte. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi uno al pellet e alla pipetta da mescolare. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.
Aggiungere un millilitro di tampone dilisi due al pellet e al vortice da mescolare. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Successivamente, aggiungere 800 microlitri di tampone di asssay di immunoprecipitazione radio con cocktail inibitore della proteasi al pellet e pipetta da mescolare.
Centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi al pellet. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.
Aggiungere un millilitro di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi. Immediatamente dopo aver aggiunto il tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi, trasferire il lysate su un tubo sonicatore. E posizionare il tubo su un ultrasonicatore.
Utilizzando le impostazioni delineate nel protocollo di testo, tagliare la cromatina. Quindi, trasferire il campione in un tubo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. E centrifugarlo per cinque minuti a 20.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius.
Raccogliere il supernatante dal campione e trasferirlo in un nuovo tubo proteico a basso legame. In questo protocollo è stato introdotto e dimostrato il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina tandem. Durante la procedura, la qualità del DNA è stata testata in più fasi.
Subito dopo la sonicazione, il DNA tranciato è stato isolato e testato con la macchina per l'elettroforesi microfluidica. Dopo aver usato anticorpi anti-FLAG e anticorpi anti-H3K3me3 per eseguire la purificazione dell'affinità, la qualità del DNA è stata nuovamente controllata. La specificità della purificazione immunitaria del DNA su H2B-FLAG è stata confermata con campioni di controllo negativi.
Dove sono state rilevate quantità trascurabili di DNA. Più avanti nel protocollo, è stata verificata la qualità della libreria di sequenziamento. Il ChIP e il T-ChIP di successo sono stati evidenziati attraverso l'analisi dell'arricchimento utilizzando primer rivolti alla regione promotrice del gene GAPDH.
Sono state ottenute ridistribuzioni rappresentative lungo tre geni neuronali. E l'arricchimento delle letture alle cinque estremità principali dei geni da parte del neurone T-ChIP cerca su tutto il cervello ricerca T-ChIP è stato osservato. Dopo una stabilizzazione, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo epigenetico per esplorare la modifica specifica dell'istono del tipo di cellula ampiamente nei neuroni nei topi.
Non dimenticare che lavorare con la formaldeide può essere estremamente pericoloso e prendere precauzioni come indossare indumenti e occhiali di gomma dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per il sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq), evidenziando la sua applicabilità nell'analisi delle modificazioni degli istoni specifiche del tipo cellulare nel genoma. Isola la cromatina dalle cellule bersaglio, questo metodo permette ai ricercatori di esplorare la regolazione epigenetica e di arricchire le conoscenze sulle modificazioni degli istoni specifiche dei neuroni.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Epigenetica
- Analisi delle modificazioni degli istoni
- Specificità del tipo cellulare
Contesto
- Importanza delle modificazioni della cromatina nella funzione cellulare
- Potenziale per la comprensione dello sviluppo e della funzione dei neuroni
- Necessità di metodi precisi per studiare le modificazioni degli istoni
Metodi utilizzati
- Sequenziamento di immunoprecipitazione della cromatina tandem (tChIP-Seq)
- Cellule di neuroni di topo come modello biologico
- Purificazione per affinità ed elettroforesi per la verifica della qualità del DNA
Risultati principali
- Confermato l'arricchimento delle modificazioni degli istoni specifiche per le cellule dei neuroni
- Dimostrata la specificità della purificazione immunitaria con controlli negativi
- Osservazioni dettagliate delle modificazioni degli istoni lungo i geni dei neuroni
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo prezioso per esplorare le modificazioni degli istoni in modo specifico per il tipo cellulare.
- Evidenzi l'importanza del tChIP-Seq nel far progredire la ricerca nell'epigenetica, in particolare nella comprensione della biologia dei neuroni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
