Name: Analisi della sintesi proteica dellepididimo e secrezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri i protocolli di immunofluorescenza per localizzare la dinamina nel tessuto epididimale del topo e nelle cellule mECap18. Questi metodi permettono di isolare proteine secretorie e studiare la maturazione degli spermatozoi.

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Gli autori desidera ringraziare il National Health and Medical Research Consiglio di Australia progetto Grant APP1103176 per il supporto di questo lavoro.

Tutte le procedure sperimentali riguardanti la raccolta di tessuto animale sono state approvate dal comitato di etica e cura degli animali dell'Università di Newcastle.
1. immunofluorescenza delle sezioni dell'epididimo paraffina (figure 1 e 2)
<ol><li>Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti tramite inalazione di CO2 (topi svizzeri, oltre 8 settimane di vita), accuratamente sezionare l'epididimo (utilizzando forbici e pinzette) gratuita di sovrastante del tessuto connettivo e grasso e immergere nel fissativo del Bouin soluzione (> dieci volte il peso volume/tessuto) per la fissazione durante la notte.</li>
	<li>Lavare il tessuto con etanolo al 70% con 2 × cambi al giorno per 2 giorni e poi disidratare attraverso graduale etanolo (70%, 95% e 100%) in preparazione per l'infiltrazione e l'incorporamento in un blocco di paraffina.</li>
	<li>Sezione i blocchi di paraffina con uno spessore di 4-6 µm e Monte sugli scivoli in preparazione per colorazione di immunofluorescenza.</li>
	<li>In una cappa, Sparaffinatura le sezioni di paraffina epididimaria aggiungendo una quantità sufficiente di xilene per il vaso di diapositiva per immergere completamente la sezione di tessuto (3 × 5 minuti ogni volta).</li>
	<li>Reidratare le sezioni di tessuto tramite l'immersione in soluzioni graduali etanolo diluito in purificato H2O (etanolo 100% 5 min, 100% etanolo 5 min, 90% etanolo 1 min, 1 min, etanolo al 70% di etanolo di 80% 1 min e 50% etanolo 1 min).</li>
	<li>Lavare le sezioni in un barattolo di diapositiva una volta per 5 min con sufficiente tamponato fosfato salino (PBS) per immergere completamente l'intero tessuto sezione (seguire queste indicazioni per tutti i successivi lavaggi).</li>
	<li>Decantare la soluzione per lo smascheramento dell'antigene appropriato (cioè., 10 mmol/L sodio citrato, 50 mmol/L Tris pH 10,5 o antigene alternativi recupero soluzione/i, a seconda l'antigene per essere rilevato) in un portavetrini e forno a microonde fino a ebollizione. Immergere i vetrini in questa soluzione e le sezioni di tessuto sono soggetti alle condizioni di recupero calore-indotta dell'antigene ottimizzate per singoli anticorpi (Vedi tabella 1). Attenzione: Accertarsi che le diapositive sono completamente immersi nella soluzione di smascheramento dell'antigene durante il processo di recupero dell'antigene.</li>
	<li>Rimuovere il contenitore di diapositiva dal forno a microonde e raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini con PBS e utilizzare un pennarello liquido-repellente diapositiva traccia intorno alla sezione di tessuto.</li>
	<li>Porre i vetrini in un contenitore umidificato (creato da un tessuto umido alla base del contenitore) e applicare la soluzione bloccante (3% BSA/PBS, precedentemente filtrata attraverso un filtro da 0,45 µm) per 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Sciacquare le diapositive una volta con PBS.</li>
	<li>Incubare le sezioni con appropriato anticorpo primario diluito ad una concentrazione sperimentalmente ottimizzata nel filtrato 1% BSA/PBS a 4 ° C durante la notte (1: 60 per anti-DNM1, DNM2 e DNM3 anticorpi; 1: 100 per l'anticorpo anti-ATP6V1B1, Vedi tabella materiali per i dettagli dell'anticorpo). Nota: Per distinguere specifico da anticorpi non specifici, è necessario includere rigorosa negativo (cioè., anticorpo secondario primario, unico anticorpo preabsorbed contro immunizzare peptide) e controlli positivi24.</li>
	<li>Riscaldare le diapositive mettendo a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Lavare il × di diapositive 3 con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 10 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare le sezioni con anticorpo secondario appropriato diluito in 1% BSA/PBS (filtrata attraverso un filtro da 0,45 µm) a 37 ° C per 1 h (diluizione di 1: 400 per tutti gli anticorpi secondari, Vedi Tabella materiali particolari anticorpi). Attenzione: Tenere il contenitore di scivolo al buio da questo punto in poi. Per l'etichettatura dual, scegliere una combinazione compatibile di anticorpi secondari (cioè., anticorpi secondari devono sono stati sollevati in specie diverse).</li>
	<li>Lavare il × di diapositive 3 con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 10 minuti ciascuno.</li>
	<li>Colorante di contrasto le sezioni con ioduro di propidio (PI, 7.48 μmol/L) o 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) per 2 min a temperatura ambiente per etichettare il nucleo delle cellule.</li>
	<li>Lavare i vetrini due volte con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Montare i profili con Mowiol 4-88 preparati in una soluzione di 30% glicerolo in 0,2 mol/L di Tris (pH 8.5) del 10% e 2.5% 1, 4 - diazabiciclo-(2.2.2)-ottano.</li>
	<li>Sigillare il coprioggetto con smalto e archiviare le diapositive a 4 ° C per l'osservazione futura. Attenzione: Si consiglia di eseguire l'imaging delle diapositive appena possibile dopo la preparazione per evitare un'eccessiva perdita di fluorescenza.</li>
</ol>2 isolamento di Epididymosomes da Mouse Caput epididimo (Figura 3)
<ol><li>Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti tramite inalazione di CO2 (topi svizzeri oltre 8 settimane di vita), irrorare il loro sistema vascolare con PBS (pre-riscaldato a 37 ° C) per ridurre al minimo la contaminazione di sangue del tessuto epididimario. Attenzione: il plasma sanguigno contiene diverse popolazioni di esosomi, che sono di dimensioni simili al epididymosomes25. L'efficacia della clearance di sangue dal tessuto epididimario sono accessibili tramite l'ispezione del segmento iniziale, un segmento epididimario altamente vascularized trova prossimale al segmento caput (cioè., zona 1 in Figura 1A)</li>
	<li>Accuratamente sezionare l'epididimo gratuitamente sovrastante grasso e tessuto connettivo e risciacquare con modificata medio Biggers, Whitten e Whittingham (BWW; pH 7.4, osmolalità di 300 mmol/kg acqua26,27) per ridurre qualsiasi potenziale di superficie contaminazione del sangue.</li>
	<li>Asciugare il tessuto epididimario di rimuovere supporti in eccesso, sezionare caput epididimo (cioè., zone 2-5 in Figura 1A) e trasferimento in una capsula Petri fresco (35 × 10mm) contenenti BWW mezzo. Assicurarsi che la quantità del mezzo sia sufficiente per il recupero finale. Nota: Per 6 caput epididimi, si consiglia di utilizzare 1,1 mL di terreno per consentire un recupero di ~ 900 µ l, che è poi uniformemente diviso e applicato in cima di 2 gradienti pre-preparati (Vedi punto 2.9).</li>
	<li>Fare una serie di piccole incisioni nel tessuto caput con una lama di rasoio. Non tritare il tessuto e quindi evitare di contaminare il campione con eccessivo contenuto citosolico. Incubare la piastra che contiene il tessuto con lieve agitazione a 37 ° C per 30 min rilasciare il contenuto luminale.</li>
	<li>Filtrare la sospensione risultante attraverso 70 µm membrane per rimuovere i detriti cellulari.</li>
	<li>Raccogliere il filtrato e questo soggetto a passaggi successivi centrifugazione a 4 ° C con l'aumento di velocità al fine di eliminare i detriti cellulari (cioè., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min ciascuna; 17.000 × g per 20 minuti e infine 17.000 × g per altri 10 minuti o fino a quando non pellet è formata dopo la centrifugazione). Attenzione: È importante valutare il colore della pallina dopo il passo di centrifugazione iniziale di 500 × g per garantire anima minima contaminazione è presente. Scartare qualsiasi esempi in cui questo pellet Visualizza colorazione rosa.</li>
	<li>Preparare discontinuo di iodixanol (composto da 40%, 20%, 10%, 5% strati) diluendo un mezzo di gradiente di densità (composto da 60% (p/v) di iodixanol acquosa) con una soluzione di saccarosio di 0,25 mol/L e 10 mmol/L Tris (pH 7.5).</li>
	<li>Preparare il gradiente in un tubo di ultracentrifuga (11 × 35 mm), con ogni frazione di 450 µ l (Figura 3). Ispezionare visivamente il gradiente dopo l'applicazione di ogni frazione per assicurare che le interfacce sono formate con successo fra ogni strato prima di caricare il campione fluido epididimario. Preparare ogni sfumatura fresco il giorno di utilizzo, tuttavia, il campione di fluido luminal dell'epididimo può essere conservato a 4 ° C per 2 h prima dell'imbarco.</li>
	<li>Aggiungere con cautela 450 µ l di epididimaria luminal sospensione fluido (corrispondente al materiale raccolto da caput di 3 epididimi) sulla cima di una singola sfumatura.</li>
	<li>Ultracentrifuga le pendenze a 160.000 × g a 4 ° C per 18 h. Attenzione: Poiché questa centrifugazione viene condotta a velocità molto elevata, tutti ultracentrifuga tubi devono essere accoppiati e bilanciati con precisione. Verifica le provette per assicurare che essi siano privi di danni visibili che possano compromettere la loro integrità.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente 12 frazioni uguali (ciascuno composto da 185 µ l) a partire dal livello più alto e procedendo verso la parte inferiore della sfumatura. Piscina le frazioni equivalenti recuperate da ogni sfumatura, se applicabile (fino a due pendenze). Nota: Mouse epididymosomes sono più altamente arricchito in frazioni 9-1122, Vedi Figura 4 e discussione.</li>
	<li>Dopo il recupero e la messa in comune delle frazioni 9 – 11, diluire in 2 mL di PBS e ultracentrifuga i campioni alle 100.000 × g a 4 ° C per 3 h (13 × 56 mm tubo) a pellet il epididymosomes. Attenzione: Poiché il pellet di epididymosome può essere difficile da vedere, accertarsi che l'orientamento dei tubi è noto come essi sono collocati nel rotore e contrassegnare il tubo per indicare la posizione in grande aspettativa del pellet epididymosome. Garantire che ogni tubo contiene un volume sufficiente (cioè., supera il 50% della sua capacità totale) per escludere il rischio di collasso del tubo.</li>
	<li>Attentamente aspirare e scartare il supernatante senza disturbare il pellet epididymosome.</li>
	<li>Valutare la purezza di epididymosome (Figura 4).</li>
	<li>Risospendere il pellet di epididymosome in mezzo desiderato secondo le applicazioni a valle. Per esempio, BWW mezzo è generalmente usato per gli esperimenti che coinvolgono co-incubazione con spermatozoi o, in alternativa, un buffer di lisi appropriato in preparazione per la risoluzione del proteoma dell'epididimo tramite SDS-PAGE.</li>
</ol>3. immunofluorescenza colorazione delle cellule mECap18
<ol><li>Preparazione dei vetrini coprioggetto sterili (da effettuarsi in un cappuccio di cultura cellulare)<ol>
<li>Immergere i vetrini coprioggetti (12 × 12 mm) in etanolo al 70% per 10 min e disinfettare con l'essiccazione ad alta temperatura sopra una lampada di etanolo.</li>
		<li>Raffreddare il coprioggetto per 10 s prima di trasferire in un piatto ben 12.</li>
		<li>Applicare la soluzione sterile di poli-L-lisina per coprire il vetrino coprioggetto e accontentarsi di 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare la soluzione di poli-L-lisina e sciacquare il vetrino coprioggetto con sterile H2O o del caso medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di mECap18 di preparazione<ol>
<li>Passaggio le aliquote delle 2 cellule di mECap185 × 10 in ciascun pozzetto della piastra ben 12 contenente i coprioggetti.</li>
		<li>Coltura delle cellule con mECap18 cellulare medio (DMEM completate con 1% L-Glutammina, piruvato di sodio 1%, 1% di penicillina/streptomicina e 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) contenente 10% siero fetale di vitello (FBS) in un incubatore a 37 ° C in un atmosfera 5% CO2 durante la notte.</li>
		<li>Una volta che le cellule aderiscono al vetrino coprioggetto, eliminare il terreno e sciacquare le cellule due volte con PBS.</li>
		<li>Aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide al 4% (PFA) diluita in PBS per immergere il vetrino coprioggetto intero e fissare le cellule a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Scartare la soluzione PFA e sciacquare i vetrini coprioggetti due volte in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colorazione di immunofluorescenza<ol>
<li>Permeabilize mECap18 cellule mediante immersione in 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 min.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini coprioggetti con PBS.</li>
		<li>Bloccare le cellule mECap18 con 3% BSA e procedere con immunolabeling di cellule che utilizzano protocolli equivalenti a quelle descritte per le sezioni di tessuto epididimario.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento delle proteine dal mezzo di coltura cellulare condizionato
<ol><li>Collezione di mezzo di coltura cellulare condizionato<ol>
<li>Le aliquote di passaggio di 4 cellule di mECap185 × 10 in ciascun pozzetto di 6 piastra bene con mECap18 mezzo di cellulare supplementato con 10% FBS per 24 h.</li>
		<li>Lavare le cellule mECap18 tre volte con mezzo di cellulare mECap18 (preparato senza FBS) per rimuovere residui FBS e qualsiasi associato contaminanti di proteina.</li>
		<li>Aggiungere 1,5 mL di medium di cellulare mECap18 (preparato senza FBS) ad ogni pozzetto e incubare con cellule mECap18 per 12 h in un incubatore a 37° C inferiore al 5% di CO2. Nota: mECap18 cellule in questa fase possono essere valutate per gli antigeni di destinazione diverso secondo il disegno sperimentale.</li>
		<li>Dopo 12 h di incubazione, raccogliere il medium cellulare e centrifugare a 2.000 × g per 10 min rimuovere tutti i detriti cellulari. Nota: La durata dell'incubazione è in grado di essere modificati in conformità con la valutazione sperimentale di progettazione/endpoint e in considerazione di tolleranza della cella di trattamento applicato. Si consiglia di personalizzare i tempi di incubazione basato su regimi sperimentali specifici per garantire il raggiungimento di risultati ottimali.</li>
		<li>Valutare mECap18 la vitalità cellulare tramite l'applicazione di un saggio di esclusione standard trypan blu28. Eliminare tutto il materiale in cui attuabilità delle cellule è diminuita inferiore al 90% per eliminare la discriminazione introdotta da proteine rilasciate da cellule morte o moribonde.</li>
		<li>Isolare proteine da medium cellulare come indicato di seguito o preservare medio a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento di proteine (da effettuarsi in una cappa aspirante)<ol>
<li>Aggiungere 20% del volume di refrigerati acido tricloroacetico al 100% a 80% del volume di medium condizionato delle cellule per precipitare le proteine rilasciate dalle cellule coltivate mECap18. Incubare a 4 ° C durante la notte con miscelazione costante.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, pellet proteine precipitate mediante centrifugazione (17, 000 × g, 4 ° C per 10 min). Nota: A causa della limitata quantità di proteina prevista per essere secreto nel mezzo, è possibile che il pellet non sarà facilmente visibili dopo la centrifugazione. È quindi imperativo correttamente orientare il tubo prima della centrifugazione e fare attenzione a non per disturbare la posizione della pallina in grande aspettativa durante la rimozione del surnatante.</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare la pallina due volte con acetone refrigerate prima la ri-centrifugazione (17, 000 × g, 4 ° C per 10 min).</li>
		<li>Rimuovere con cautela e scartare il surnatante prima di essiccamento ad aria qualsiasi residuo acetone all'interno di una cappa aspirante.</li>
		<li>Risospendere il pellet di proteina in un tampone di estrazione appropriato in preparazione per l'analisi dell'endpoint rilevare profili proteina secretoria completa e/o proteine target individuali (ad es., SDS-PAGE, immunoblotting).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questi studi incorporato l'uso del tessuto epididimario fisso di Bouin che era stati sottoposti a protocolli standard di sezionamento e di inclusione in paraffina. Soluzione fissante di Bouin comprende una miscela di formaldeide, acido picrico e acido acetico, con ogni componente con una funzione specifica e complementare. Così, formaldeide reagisce con le ammine primarie per formare legami incrociati della proteina, acido picrico penetra lentamente il tessuto formando sali e quindi la coagulazione delle proteine basiche...

Gli spermatozoi di tutte le specie di mammiferi acquisiscono il potenziale per visualizzare avanti motilità progressiva e di fecondare un ovulo durante la loro discesa prolungata attraverso l'epididimo, una regione altamente specializzata del sistema del maschio condotto extra-testicolari, che possono prendere 7-14 giorni per navigare (a seconda della specie)1. A causa della estrema condensazione della cromatina paterna e lo spargimento della maggior parte del citoplasma che accompagna il cytodifferentiation degli spermatozoi all'interno dei testicoli, la loro successiva maturazione funzionale è guidato esclusivamente dalla loro interazione con il microambiente dell'epididimo. Questo ambiente è, a sua volta, creato dall'attività secretiva e assorbente del soma epididimaria fodera e visualizza un livello eccezionale di segmenti variazione1. Così, i segmenti più attivi in termini di sintesi delle proteine e secrezione sono quelli situati nella parte prossimale dell' epididimo (vale a dire, il caput e corpus)2. Questa attività rispecchia il profilo funzionale degli spermatozoi, con l'inizio primo di celle per visualizzare i tratti distintivi di competenza funzionale (cioè., motilità progressiva e la capacità di legarsi a zona acido-solubilizzato glicoproteine) seguente loro passaggio attraverso l' epididimo caput3. Questi attributi funzionali continuano a svilupparsi prima di raggiungere i livelli ottimali come lo sperma raggiunge il segmento distale dell'epididimo (cauda), in cui sono memorizzati in stato di quiescenza nella prontezza per eiaculazione precoce. La formazione e la manutenzione di questo serbatoio di immagazzinaggio dello sperma è anche intimamente legata all'epitelio di rivestimento, che nella cauda è dominato dalla forte attività assorbente4,5. Anche se le differenze anatomiche sono stati segnalati6,7,8, tale divisione regionalizzata del lavoro sembra essere una caratteristica dell'epididimo che è condivisa tra la maggior parte delle specie di mammiferi studiato fino ad oggi, compreso il nostro9,10. Infatti, da un punto di vista clinico, è noto che la disfunzione dell'epididimo dà un importante contributo all'eziologia del fattore maschio sterilità11, evidenziando così l'importanza della comprensione della regolazione di questo tessuto specializzato.
È quindi deplorevole che la nostra comprensione della fisiologia dell'epididimo e i meccanismi che regolano le fasi sequenziale di maturazione degli spermatozoi e archiviazione all'interno di questo tessuto, rimangono per essere completamente risolto. Tra i fattori di contributo, limitanti avanzamenti nella ricerca dell'epididimo sono la complessità di questo tessuto e la conoscenza dei meccanismi che esercitano il controllo normativo sopra suo microambiente luminale. Anatomicamente, sappiamo che di là della distinzione dei segmenti caput, corpus e cauda, l'epididimo può essere ulteriormente suddivisi in diverse zone (Figura 1A), ciascuno separati da setti12 e caratterizzata da profili discreti di proteina/del gene espressione13,14,15,16,17,18. Infatti, sulla base di dettagliate profiling trascrizionale dell'espressione genica segmentale nell'epididimo, oltre 6 e 9 zone distinte dell'epididimo sono stati segnalati nei modelli di topo e di ratto, rispettivamente19,20. Tale complessità presumibilmente riflette la composizione del soma dell'epididimo, un epitelio pseudostratified composto da numerosi tipi cellulari differenti; ogni diverse rispetto alle loro attività di abbondanza, distribuzione e secretiva/assorbente lungo la lunghezza del tratto. Così, le cellule principali sono di gran lunga la più abbondante dell'epididimo cella tipo che costituisce verso l'alto di 80% di tutte le cellule epiteliali. Di conseguenza, le cellule principali sono responsabili per la maggior parte della proteina dell'epididimo biosintesi e secrezione5. Al contrario, la popolazione di cellule chiare, che si allineano come il tipo di cella secondo più abbondante all'interno del soma dell'epididimo, è principalmente coinvolti in assorbimento selettivo di luminal componenti e l'acidificazione di questo microambiente5. Aggiunta di un altro livello di complessità, androgeni e altri fattori di lumicrine di origine testicolare esercitano controllo differenziale su ciascuno di questi tipi di cellule dell'epididimo a seconda del loro posizionamento lungo il tratto.
Nonostante le limitazioni imposte da tale complessità, incursioni significative continuano a essere trasformato in risoluzione la base meccanicistica della funzione dell'epididimo. Una chiave per questi studi è stata l'applicazione di strategie avanzate spettrometria di massa per stabilire gli inventari di larga scala del proteoma dell'epididimo, in tandem con analisi dettagliate delle singole proteine scelti fra queste indagini iniziali. Un'illustrazione di questo approccio è la nostra recente caratterizzazione della famiglia DNM di mechanoenzymes nel modello del mouse21. Il nostro interesse iniziale in DNM è stato alimentato da sua duplice azione nell'accoppiamento di exo - ed endocitosi processi. Basandosi su queste osservazioni, siamo stati in grado di dimostrare che le tre isoforme di canoniche di DNM (DNM1 - DNM3) sono altamente espressi nell'epididimo del mouse e posizionate in modo appropriato per soddisfare i ruoli regolatori in proteina secrezione e assorbimento21 . Inoltre, siamo stati in grado di distinguere chiaramente ciascuna isoforma DNM sulla base della loro localizzazione cellulare e subcellulare, suggerendo così che possiedono complementari, al contrario di attività ridondanti, all'interno l' epitelio dell'epididimo21.
Qui, descriviamo la metodologia sperimentale impiegata per lo studio dell'espressione di DNM nell'epididimo del mouse con la speranza che queste informazioni saranno trovare ampia applicazione nella caratterizzazione delle proteine dell'epididimo alternativi e contribuire così alla nostra comprensione della funzione di questo importante elemento del tratto riproduttivo maschio. In particolare, descriviamo lo sviluppo di una metodologia robusta per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio in paraffina sezioni dell'epididimo e il successivo rilevamento della distribuzione spaziale di queste proteine tramite immunofluorescenza microscopia. Documentiamo ulteriormente il nostro recentemente ottimizzato protocolli22 per l'isolamento e la caratterizzazione di epididymosomes; piccole vescicole di esosomi-come che costituiscono gli elementi chiave del profilo secretivo dell'epididimo e sembrano tenere un ruolo di primo piano nella promozione di maturazione degli spermatozoi23. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza di proteine bersaglio in una linea cellulare di topo immortalizzate caput epididimario epiteliali (mECap18) e l'uso di questa risorsa come un modello con cui esplorare il regolamento di epididimaria l'attività secretiva in vitro.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo dinamina 1</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td><forte>Specie ospite</forte>: Coniglio, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>Anticorpo dinamina 2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td><forte>Specie ospite</forte>: Capra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonale</td></tr><tr><td>Dynamin 3</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><<td>strong>Specie ospite: Coniglio, Isotipo: IgG, Class: anticorpo policlonale</td></tr><tr><td>ATP6V1B1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>Specie ospite: Capra, Isotipo: IgG, Class: anticorpo policlonale</td></tr><tr><td>CD9</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>Specie ospite: Ratto, Isotipo: IgG, Class: anticorpo monoclonale</td></tr><tr><td>Flotillin-1</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>Specie ospite: Coniglio, Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: </td></tr><tr><td>anticorpo policlonale ALOX15</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>Specie ospite: Coniglio, Isotipo: IgG, Class: anticorpo policlonale</td></tr><tr><td>TUBB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>Specie ospite: Topo, Isotipo: IgG, Class: anticorpo monoclonale</td></tr><tr><td>PSMD7</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>Specie ospite: Coniglio, Isotipo: IgG, Class: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>Specie ospite: Capra, Isotipo: IgG, Class: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055<</td><td>strong>Specie ospite: Asino, Isotipo: IgG, Class: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>Specie ospite: Asino, Isotipo: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td><forte>Specie ospite</forte>: Capra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Coniglio HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td><forte>Specie ospite</forte>: Capra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>Specie ospite</forte>: Capra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>Anti Topo HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td><forte>Specie ospite</forte>: Capra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonale</td></tr><tr><td>4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di propidio (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&alfa;-androstan-17&beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>piruvato di sodio</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-etilendiamminotetraacetico acido (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astrale</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabiciclo-(2.2.2)-ottano</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Tripano blu</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (alcool vinilico)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Densità Gradiente Medio Sigma</td><td></td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifughe</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Grande Agitatore Orbitale</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH da laboratorio</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Segnavetrini idrorepellente</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &; m filter</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga (2,2 ml, 11 &volte; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga (3,2 ml, 13 & 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70 &; m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri 35 & 10 mm con camme</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Vaso per vetrini</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

L'epididimo mammiferi genera uno dei fluidi intraluminale più complessi di qualsiasi ghiandola endocrina al fine di sostenere la maturazione post-testicolare e la conservazione degli spermatozoi. Tale complessità presenta dovuto l'attività secretiva e assorbente combinata delle cellule epiteliali di rivestimento. Qui, descriviamo le tecniche per l'analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione focalizzando l'attenzione sulla famiglia delle proteine modello della dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasi grandi che hanno il potenziale per regolare gli eventi traffico di membrana bi-direzionale. Per lo studio dell'espressione proteica in tessuto epididimario, descriviamo solida metodologia per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio nelle sezioni di paraffina e la successiva rilevazione della distribuzione spaziale di queste proteine tramite microscopia di immunofluorescenza. Inoltre descriviamo la metodologia ottimizzata per l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi come vescicole, noto come epididymosomes, che sono secreti nel lume dell'epididimo di partecipare a comunicazione intercellulare con la maturazione delle cellule dello sperma. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza delle proteine bersaglio in una linea cellulare di SV40-immortalato mouse caput epididimario epiteliali (mECap18). Inoltre discutiamo l'utilità della linea cellulare mECap18 come un modello adatto in vitro con cui esplorare il regolamento di attività secretiva dell'epididimo. Per questo scopo, si descrivono i requisiti coltura per il mantenimento della linea cellulare mECap18 e l'uso di regimi di inibizione farmacologica selettiva che sono in grado di influenzare il loro profilo di proteine secretorie. Questi ultimi sono prontamente valutati tramite raccolta del medium condizionato di cultura, la concentrazione di proteine secrete tramite precipitazione di acido tricloroacetico/acetone e la loro successiva analisi tramite SDS-PAGE e immunoblotting. Sosteniamo che questi metodi combinati sono adatti per l'analisi dei bersagli proteici epididimaria alternativo come un preludio alla determinazione del loro ruolo funzionale in maturazione degli spermatozoi e/o deposito.

Figura 1 e Figura 2 mostrano risultati rappresentativi della localizzazione di immunofluorescenza di DNM nell'epididimo caput del mouse. Ognuna delle tre isoforme DNM studiati i profili di visualizzazione localizzazione distinta. Così, DNM1 è caratterizzato da modesta etichettatura diffusa delle cellule dell'epididimo in tutto il segmento e caput dell'epididimo iniziale (Figura 2A). ...

Qui, segnaliamo la localizzazione di immunofluorescenza della dinamina per illustrare i protocolli per il rilevamento delle proteine nelle sezioni dell'epididimo paraffina-incastonato del mouse e quelli di una linea di cellulari immortalizzate epididimaria (mECap18). Inoltre descriviamo i protocolli per l'isolamento delle proteine secretorie da sia fluido epididimario e media condizionato delle cellule.

Analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Questo master combinato può rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'epididimo, come ad esempio quali bersagli proteici sono coinvolti nella regolazione della maturazione e della conservazione degli spermatozoi. Il vantaggio principale della tecnica di isolamento dell'epididimo è che è applicabile anche per isolare una popolazione simile da altre regioni dell'epidermide tra specie diverse. Per iniziare questa procedura, trasferire le sezioni di paraffina dell'epididimo in una cappa aspirante.Aggiungere una quantità sufficiente di xilene al barattolo per immergere completamente la sezione di tessuto. Reidratare le sezioni di tessuto immergendole in soluzioni di etinolo graduale diluite in acqua purificata come indicato nel protocollo di testo. Lavare le sezioni in un barattolo per vetrini per cinque minuti con una quantità sufficiente di PBS per immergere completamente l'intera sezione di tessuto.Quindi, decantare la soluzione appropriata per il recupero dell'antigene in un rack per vetrini. Cuocere la soluzione nel microonde fino a quando non bolle. Immergere completamente i vetrini nella soluzione, sottoponendo le sezioni di tessuto a soluzioni di recupero dell'antigene indotte dal calore.Dopodiché, rimuovi il contenitore del vetrino dal microonde e lascialo raffreddare a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini in un barattolo contenente PBS per cinque minuti. Utilizzando un pennarello a scorrimento idrorepellente, tracciare intorno alla sezione di tessuto.Trasferire i vetrini in un contenitore umidificato. Applicare la soluzione bloccante per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi, sciacquare i vetrini una volta con PBS.Incubare le sezioni con un anticorpo primario appropriato diluito a una concentrazione ottimizzata sperimentalmente in PBS filtrato all'1% di BSA a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver riscaldato nuovamente i vetrini a temperatura ambiente, lavare i vetrini con PBS su una piattaforma di agitazione a 60 giri/min per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.Incubare le sezioni con un anticorpo secondario appropriato diluito in PBS BSA filtrato all'1% a 37 gradi Celsius per un'ora. Da qui in poi, tieni le diapositive al buio. Lavare i vetrini tre volte con PBS su una piattaforma di agitazione a 60 giri/min per 10 minuti per lavaggio.Quindi, colorare, montare e sigillare i campioni come indicato nel protocollo di testo. Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti, cospargere la loro vascolarizzazione con PBS che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius per ridurre al minimo la contaminazione ematica del tessuto epididimale. Sezionare con cura l'epididimo privo di grasso e tessuto connettivo sovrastanti e risciacquare con un terreno BWW modificato per ridurre qualsiasi potenziale contaminazione del sangue superficiale.Tamponare il tessuto epididimo per rimuovere il terreno in eccesso e sezionare l'epididimo caput. Quindi, trasferire il caput epididimo sezionato in una capsula di Petri fresca contenente terreno BWW, assicurandosi che la quantità di terreno sia sufficiente per il recupero finale. Usando una lama di rasoio, fai una serie di piccole incisioni nel tessuto caput.Non tritare il fazzoletto. Incubare a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per 30 minuti per rilasciare il contenuto luminale. Utilizzando membrane da 70 micrometri, filtrare la sospensione risultante e rimuovere i detriti cellulari.Raccogliere la sospensione e sottoporla a successive fasi di centrifugazione a quattro gradi Celsius con velocità crescente per eliminare i detriti cellulari. Quindi, preparare gradienti discontinui di iodixanolo come indicato nel protocollo di testo. Preparare il gradiente in una provetta da ultracentrifuga utilizzando ciascuna frazione di 450 microlitri.Ispezionare visivamente il gradiente dopo l'applicazione di ogni frazione per assicurarsi che le interfacce si formino correttamente tra ogni strato. Aggiungere con cautela 450 microlitri di sospensione di fluido luminale epididimo su un singolo gradiente. Ultracentrifugare i gradienti a 160.000 volte g e quattro gradi Celsius per 18 ore.Rimuovere delicatamente 12 frazioni uguali dal gradiente centrifugato, partendo dallo strato più alto e progredendo verso il fondo del gradiente. Se applicabile, raggruppare le frazioni equivalenti recuperate da ciascun gradiente. Dopo che le frazioni da nove a 11 sono state recuperate e raggruppate, diluirle in due millilitri di PBS.Ultracentrifugare i campioni a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per tre ore per pellettare gli epididimismi. Quindi, aspirare e scartare accuratamente il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet di epididimismo. È essenziale valutare la purezza dell'epididimismo prima di qualsiasi applicazione a valle.Dopo aver preparato i vetrini coprioggetti sterili, far passare aliquote di 200.000 mEcap 18 cellule in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente i vetrini. Coltiva le cellule come indicato nel protocollo di testo. Una volta che le cellule hanno aderito al vetrino coprioggetti, scartare il terreno e sciacquare le cellule due volte con PBS.Aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide al 4% per immergere l'intero vetrino coprioggetti e fissare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, scartare la soluzione di paraformaldeide e sciacquare due volte i vetrini coprioggetti in PBS. Immergere i vetrini coprioggetti risciacquati in 0.1 Triton X-100 in PBS per 10 minuti per permeabalizzare le cellule.Risciacquare, bloccare e immunomarcare le cellule come indicato nel protocollo di testo. In primo luogo, il passaggio delle aliquote delle cellule mEcap 18 in una piastra a 6 pozzetti come indicato nel protocollo di testo. Una volta aderite, lavare le cellule tre volte con un terreno cellulare mEcap 18 privo di FBS per rimuovere i residui di FBS e gli eventuali contaminanti proteici associati.Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di terreno cellulare mEcap 18 privo di FBS a ciascun pozzetto. Incubare per 12 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in un'atmosfera del 5% di CO2. Successivamente, raccogliere il terreno cellulare e centrifugare a 2.000 volte g per 10 minuti per rimuovere tutti i detriti cellulari.Utilizzando un test standard di esclusione del blu di tripano, valutare la vitalità delle cellule mEcap. Aggiungere il 20% in volume di acido tricloroacetico refrigerato al 100% all'80% in volume di terreno cellulare condizionato per precipitare le proteine rilasciate dalle cellule mEcap 18 in coltura. Incubare a quattro gradi Celsius per una notte mescolando costantemente.Quindi, centrifugare a 17.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare due volte il pellet proteico con acetone raffreddato. Quindi, centrifugare nuovamente a 17.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Rimuovere con cautela ed eliminare nuovamente il surnatante. Quindi, asciugare all'aria i campioni nella cappa aspirante per rimuovere eventuali residui di acetone. Ciascuna delle isoforme DNMI studiate mostra un profilo di localizzazione dell'immunofluorescenza distinto.La DNMI è caratterizzata da una marcatura diffusa relativamente modesta delle cellule dell'epididimo in tutto il segmento iniziale e nell'epididimo caput. L'isoforma DNM2 viene prima rilevata in prossimità del bordo basale e apicale opposto delle cellule nel segmento iniziale, prima di riposizionarsi nel dominio sopranucleare nelle cellule all'interno del segmento caput adiacente a valle. L'intensità di questa marcatura diminuisce gradualmente tra le zone due e cinque dell'epididimo caput, che essenzialmente rispecchia l'attività secretoria di questi segmenti epididimali.La marcatura sopranucleare di DNM2 è successivamente vista corrispondere alla distribuzione dell'apparato di Golgi all'interno delle cellule principali del caput. L'isoforma DNM3 è rilevata principalmente nel dominio apicale di un piccolo numero di cellule epiteliali caput, che si vede corrispondere alla sottopopolazione di cellule chiare mediante co-marcatura con il marcatore di cellule chiare riconosciuto ATP6V1B1. Successivamente, una linea cellulare immortalizzata di mEcap 18 viene utilizzata come modello in vitro per studiare l'attività secretoria delle cellule dell'epididimo.Si è visto che i modelli di distribuzione sono coerenti con quelli osservati nelle sezioni di tessuto epididimo caput, con DNM1 rilevato in tutto il citoplasma delle cellule mEcap 18, DNM2 concentrato all'interno del sopranucleo di queste cellule e DNM3 caratterizzato da focolai discreti di colorazione della membrana all'interno di un piccolo numero di sottopopolazioni. Quando si tenta di rilevare l'immunofluorescenza, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni per ciascun antigene. Le popolazioni isolate della zona dell'epididimo sono facilmente suscettibili per l'uso in applicazioni a valle, tra cui la co-incubazione con spermatozoi e l'analisi di ocalgo per limatura, entrambi approcci potenti per migliorare la nostra comprensione del ruolo dell'epididimosoma nella regolazione della maturazione degli spermatozoi dell'epididimo.

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JoVE Journal

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