Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei biomateriali, come il modo in cui le interazioni della matrice cellulare influenzano il solfato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che genera il primo materiale che riflette accuratamente i micro ambienti biochimici della corteccia renale nativa. Allineare un cappuccio di coltura tissutale con un sottospazzole.

Mettere un bicchiere da un litro contenente una barra di agitazione, un piatto sterile di coltura tissutale da 150 millimetri e l'intero rene nel cappuccio. Riempire il becher con 500 millilitri di soluzione 1%SDS. Posizionare il rene nel piatto sterile di coltura tissutale.

Rimuovere tutto il grasso perirenale radendo leggermente intorno alla capsula renale con un bisturi. Quindi, fare un'incisione superficiale da otto a 10 centimetri attraverso l'estremità superiore del rene, per rompere la capsula renale senza danneggiare il tessuto della corteccia sottostante. Utilizzare due morsetti emostatici per rimuovere la capsula renale staccandola dal tessuto della corteccia.

Bisect il rene lungo il piano coronale usando il bisturi lungo il lato laterale del rene. Isolare il tessuto della corteccia da entrambe le metà ritagliando la regione medulare con il bisturi. Quindi, tagliare a dadini il tessuto della corteccia in pezzi a cubetti di 0,5 centimetri e rimuovere eventuali vasi grandi e visibili.

Per isolare la matrice extracellulare dal rene, posizionare il tessuto della corteccia a dadini nel becher contenente soluzione di SDS. Coprire il becher con un foglio di alluminio autoclavato e posizionarlo su una piastra di agitazione a circa 400 giri/min, al di fuori della cappa di coltura tissutale. Dopo 24 ore di agitazione, porta il becher in un cappuccio di coltura tissutale.

Aggiungere un filtro cellulare sterile da 40 micron realizzato con rete di nylon. E poi, riempire un bicchiere separato da 1000 millilitri con 200 millilitri di candeggina, e posizionare nel cappuccio di coltura tissutale. Smaltire la soluzione SDS attraverso il filtro cellulare, nel becher contenente candeggina.

Pipettare qualsiasi soluzione di SDS rimanente, fino a quando solo il tessuto decellularizzato e il filtro cellulare rimangono nel becher. Lasciare il filtro cellulare nel becher e aggiungere 500 millilitri di soluzione SDS fresca. Coprire il becher con la stessa lamina di alluminio e posizionarlo su una piastra di agitazione alla stessa velocità di prima.

Dopo la decellularizzazione e il lavaggio, trasferire il tessuto decellularizzato, indicato come ECM renale da questo momento in poi, in un tubo conico autoportato da 30 millilitri. E riempirlo con acqua di coltura cellulare, fino a quando tutto il tessuto non è sommerso. In primo luogo, utilizzare un omogeneizzatore tissutale per omogeneizzare l'ECM renale nel tubo conico per due minuti, fino a ottenere una soluzione opaca senza pezzi visibili di ECM.

Quindi, immergere il tubo conico contenente l'ECM renale in azoto liquido fino a quando l'ebollizione che circonda il tubo non persiste più. Conservare l'ECM renale a meno quattro gradi Celsius durante la notte. Per lyophilizzare il tessuto decellularizzato congelato, allentare leggermente il tappo del tubo conico per consentire lo scambio di gas e posizionare il tubo in una macchina di lyophilization.

Liofilizzare l'ECM renale per tre giorni o fino a quando non assomiglia a una polvere fine e bianca. Per digerire e solubilizzare chimicamente il gel, aggiungere pepsina gastrica suina pesata con cura e 0,01 acido cloridrico normale a una vile a scintillazione contenente una barra di agitazione. Mescolare a circa 500 giri/min, fino a quando tutta la pepsina non si è sciolta.

Quindi, trasferire l'ECM renale liofilizzato alla scintillazione vile e lasciare la soluzione su una piastra di agitazione a circa 500 giri/min per tre giorni per rendere il rene di magazzino idrogel ECM. In una cappa di coltura tissutale, pipettare i volumi richiesti di mezzi di coltura cellulare, un normale idrossido di sodio e integratore M199, in un tubo conico autonomo sterile da 30 millilitri. Mescolare la soluzione di reagente neutralizzante con una micro spatola.

Utilizzare una siringa sterile da un millilitro per trasferire il volume appropriato di idrogel ECM di rene di serie alla soluzione di reagente neutralizzante. Utilizzare una micro spatola per mescolare delicatamente la soluzione fino a ottenere una soluzione omogenea di colore idrogel. Evitare di introdurre bolle d'aria mescolando lentamente e delicatamente.

Per incorporare le cellule nell'idrogel ECM renale, resopensare trecentomila cellule in 10 microlitri di mezzo per ogni idrogel. Pipet 10 microlitri di sospensione cellulare nel gel ECM renale finale. Mescolare la soluzione con una micro spatola fino a quando le cellule non sono distribuite uniformemente.

Utilizzare una siringa millilitro per riempire il dispositivo di coltura cellulare desiderato con l'idrogel ECM renale. Lasciare che il gel si metta a 37 gradi Celsius per un'ora prima di trasferire o placcare le cellule sull'ECM renale nel dispositivo di coltura cellulare. L'analisi del tessuto della corteccia decellularizzata mediante spettrometria di massa, ha rivelato la presenza di proteine associate alla lamina basilico, con Collagen-IV e Collagen-I che sono i più rappresentati.

Le catene Collagen-IV, A1 e A2, onnipresenti in tutte le membrane basali sono state conservate. Sono state rilevate anche catene collagene-IV, A3 e A5, presenti solo nelle membrane basali del glomerulo. Sono state rilevate anche forme isoci comuni di laminine e collagene-I.

Le cellule endoteliali microvascolari peritubulari renali umane, o HKMEC, coltivate con Collagen-I, ECM renale e un gel miscela 1:1, hanno mostrato differenze nel fenotipo. Gli HKPC coltivati su Collagen-I, mostravano un'espressione CD31 uniforme, vista in rosso. Mentre gli HKMEC coltivati sui due gel contenenti ECM renale, mostravano un'espressione CD31 ridotta in distribuzioni irregolari.

Il tipo di matrice non sembra influire sull'espressione VWF, visualizzata in verde. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di omogeneizzare completamente il tessuto della corteccia renale decellularizzata. Inoltre, quando si mescola il gel con reagenti neutralizzanti, evitare l'introduzione di bolle d'aria.

I sistemi microsi fisiologici consentono lo studio della funzione dell'organo in un ambiente di laboratorio controllato. La creazione di tali sistemi richiede l'implementazione di cellule, matrici e stimoli. L'idrogel kECM qui fabbricato, ci permetterà di studiare tali sistemi che ricapitolano i micro ambienti renali.