Name: Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Scopri come rilevare e isolare corpi apoptotici con elevata purezza utilizzando citometria a flusso e centrifugazione differenziale. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi cellulari dell'apoptosi.

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1. induzione di apoptosi
<ol><li>Centrifugare il campione di cellule a 300 x g per 5 min ed eliminare il surnatante per rimuovere eventuali detriti cellulari pre-esistenti. Nota: Quando si utilizza cellule aderenti, cellule del seme in anticipo e lavare con soluzione tampone fosfato (PBS) prima di induzione di apoptosi: 1x.</li>
	<li>Determinare il numero di cell e raccogliere le cellule. Nota: A seconda post-dell'isolamento di test, si consiglia un numero di cellulare iniziale di almeno 1 x 107 cellule.</li>
	<li>Risospendere in completa per i media (mezzo rispettivo contenente siero fetale di vitello di 10% (vol/vol), 50 UI/mL penicillina, 50 µ g/mL di miscela di streptomicina) per una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Aliquotare ~ 2 x 106 cellule per pozzetto di una piastra ben 6.</li>
	<li>Per indurre l'apoptosi, rimuovere il coperchio della piastra e irradiare le cellule a 150 mJ/cm2 utilizzando un irradiatore UV. Questo dovrebbe prendere circa 30-60 s. Nota: Prima di irradiamento, assicurarsi che ~0.5 x 106 celle vengono mantenute per il controllo di cella 'Non trattato'. Nota: L'apoptosi può essere indotta anche tramite altri metodi quali anti-Fas o siero fame6.</li>
	<li>Incubare a 37° C, 5% CO2 per 2-8 ore, a seconda della linea cellulare.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio chiaro superiore di panca, visualizzare le cellule per confermare la presenza di morfologie apoptotici, come blebbing, formazione di apoptopodia e ApoBD. Nota: ingrandimento 40x è sufficiente</li>
	<li>Utilizzando una pipetta P1000, pipettare e raccogliere campioni di apoptotic.</li>
	<li>Lavare la piastra con PBS 1X e si combinano con campione rimanente per garantire il massimo rendimento.</li>
	<li>Raccogliere ~1/10th per il 'intero Apoptotic campione' (WAS) di controllo.</li>
	<li>Raccogliere il campione 'Non trattato'.</li>
	<li>Centrifugare i campioni non trattato sia WAS a 3.000 x g per 6 min.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di PBS 1X e mettere da parte il ghiaccio.</li>
	<li>Per l'isolamento di ApoBD, continuare a passo 2 o 3 con il restante campione di apoptotic.</li>
</ol>2. ApoBD isolamento tramite FACS
<ol><li>Centrifugare il campione intero a 3.000 x g per 6 min.</li>
	<li>Rimuovere la maggior parte del surnatante senza interrompere il pellet.</li>
	<li>Risospendere in una soluzione colorante contenente 1 mL di buffer di associazione x A5 1, 75 µ l di A5-FITC e 2 µ l di TO-PRO-3 a 1 x 107 cellule.</li>
	<li>Incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 1-2 mL di buffer di associazione x A5 1 e centrifugare il campione a 3.000 x g per 6 min rimuovere macchie in eccesso. Nota: Per le popolazioni delle cellule miste o campioni di tessuto, eseguire un anticorpo che macchia passo utilizzando una combinazione di indicatori specifici del tipo delle cellule in 1 tampone di associazione x A5 e incubare in ghiaccio per 20 minuti (o secondo il protocollo del produttore) prima centrifugazione a 3.000 x g per 6 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet di campione in 3 mL di tampone di FACS (1x PBS, 1 tampone di associazione x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) per 1 x 107 cellule.</li>
	<li>Filtrare con un colino di cella 70 µm in un fondo di turno, tubo in polipropilene (citometria a flusso) e mantenere i campioni sul ghiaccio e al buio.</li>
	<li>Accendere la macchina di FACS ed eseguire set standard utilizzando un ugello di 100 µm, eseguire il ritardo di goccia e garantire un flusso stabile.</li>
	<li>Caricare l'esempio e impostare la velocità di acquisizione a ~ 1000 eventi/s.</li>
	<li>Regolare FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) e tensioni di FITC (A5) e posizionare gli eventi entro le trame di FACS affinché le popolazioni possono essere chiaramente separati.</li>
	<li>Registrare eventi di 20.000.</li>
	<li>Impostare una strategia di gating come in parte 4.</li>
	<li>Nel layout di sorta, è necessario aggiungere l'ultimo cancello di ApoBD come la popolazione di ordinamento desiderata.</li>
	<li>Iniziare l'acquisizione del campione ed eseguire una sorta di prova attraverso la raccolta di 5.000-10.000 ApoBDs in una nuova provetta contenente ~ 250 µ l di tampone FACS.</li>
	<li>Eseguire un sistema torna a filo e carico ordinato ApoBDs.</li>
	<li>Acquisire e registrare test-ordinamento ApoBDs.</li>
	<li>Verificare che la purezza di ApoBD ~ 99% confrontando vs FSC (asse y) A5 (eventi asse x). Nota: A5 macchiatura può ridurre leggermente quando ri-analisi dei campioni a causa di sbiancamento laser.</li>
	<li>Una volta ottenuta la elevata purezza, caricare il campione originale e continuare l'ordinamento fino a quando il numero desiderato di ApoBDs è stato ottenuto. Nota: Se necessario, l'ordinamento dual può essere eseguita per isolare contemporaneamente ApoCells e ApoBDs. Nota: Durante l'ordinamento per un lungo periodo di tempo, si raccomanda di incubare la provetta di raccolta a 4 ° C.</li>
	<li>Una volta che l'ordinamento è completo, raccogliere una piccola porzione di ApoBDs post-ordinamento, post-ordinamento ApoCells, non trattato e WAS apoptosi di convalidare e confermare post-ordinamento purezza. Nota: Anche se la prova-ordinamento e la purezza di post-ordinamento non dovrebbe differire significativamente, questo si basa sulle impostazioni di flusso e stabilità.</li>
</ol>3. ApoBD isolamento tramite centrifugazione differenziale
<ol><li>Centrifugare il campione di apoptotic rimanenti a 300 x g per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante, lasciando ~ 500 µ l per evitare di interrompere il pellet cellulare e aggiungere in una nuova provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Rimuovere i rimanenti 500 µ l e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di PBS 1X (questo rappresenta la frazione di ApoCell-arricchita.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante raccolto per 20 min a 3.000 g.</li>
	<li>Controllare una pallina e rimuovere con cautela il surnatante (il supernatante può contenere piccole vescicole extracellulari tra cui microvescicole ed esosomi).</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di PBS 1X (questo rappresenta la frazione 'arricchita di ApoBD')</li>
	<li>Raccogliere 100 µ l di ogni vitali, WAS, arricchita di ApoCell e ApoBD-arricchita di campioni in un nuovo fondo di turno, tubo di polistirolo (citometria a flusso).</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di macchia contenente 2 buffer obbligatorio x A5, 1: 100 A5-FITC e 1:1,000 TO-PRO-3</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 10 min al buio.</li>
	<li>Analizzare i campioni mediante citometria a flusso, utilizzando la strategia di gating come descritto in precedenza per convalidare la riuscita induzione di apoptosi e la purezza della frazione arricchita di ApoBD.</li>
</ol>4. flusso Cytometry Gating strategia
<ol><li>Plot TO-PRO-3 (asse y) contro FSC (asse x) per separare le cellule necrotiche (TO-PRO-3alta) da tutti gli altri eventi non-permeabilized (TO-PRO-3basso/intermedio).</li>
	<li>Selezionare tutti gli eventi non-permeabilized e trama SSC contro A5. Due popolazioni tra cui popolazione 1 (P1), SSCintermedio/alto, A5basso/intermedio celle e popolazione 2 (P2), tutti gli altri eventi del cancello.</li>
	<li>Da P2, plot TO-PRO-3 contro A5 e selezionare A5intermedio/alto eventi per escludere tutti i detriti cellulari.</li>
	<li>Selezionare tutti gli eventi positivi A5 e plot FSC contro A5. Separare ApoBDs (FSCbasso) da ApoCells (FSCintermedio/alto). Nota: Quando gating ApoBDs per l'isolamento di ApoBD tramite l'approccio basato su FACS, consigliamo un passaggio finale selezionando ApoBDs e confronto a-PRO-3-A5 e tutti gli eventi. Questo assicura che il cancello di ordinamento finale utilizza fluorescenza piuttosto che i parametri FSC/SSC.</li>
	<li>Per l'analisi di cellule vitali, selezionare P1 ed effettuare una delle due strategie di Gate. Per l'analisi generale delle cellule vitali, plot FSC contro A5 e selezionare tutte le celle FSCintermedio/alto , quindi rimozione detriti cellulari rimanenti. In alternativa, per un'analisi approfondita, cellule vitali possono essere separate da A5– ApoCells primi tracciando TO-PRO-3 contro FSC. Selezionare a-PRO-3basso, cellule vitali di FSCintermedio/alto e TO-PRO-3intermedio, FSCintermedio/alto A5– ApoCells presto.</li>
</ol>

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<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
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<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Dalla sua descrizione iniziale nel 1950, il campo dell'apoptosi ha avanzato notevolmente, diventando una zona prominenti di ricerca. Nonostante il vasto interesse e gli sforzi profusi, alcuni aspetti dell'apoptosi, in particolare la formazione di ApoBDs, non sono stati studiati bene a causa della mancanza di adeguate metodologie. Queste comprendono in particolare la limitazione in progressione di apoptosi e ApoBD formazione contemporaneamente usando la citometria a flusso tradizionale analisi A5/PI e le impurità di isola...

Apoptosi, una forma ben studiata di morte cellulare programmata, sono necessaria per mantenere l'omeostasi fisiologica e rimuovere le cellule potenzialmente dannose all'interno del corpo umano1. Dopo l'induzione dell'apoptosi, cellule apoptotiche (ApoCells) possono subire una serie di cambiamenti morfologici e smontare in piccole vescicole di membrana-limita, chiamate ApoBDs. Nel complesso, questo processo è noto come smontaggio delle cellule apoptotiche e può essere diviso in 3 fasi distinte sulla base di morfologia2,3. Passaggio 1 (membrana plasmatica blebbing) è caratterizzata dalla formazione di aerostato-come le strutture sulla superficie delle cellule, noto come vescichette4,5. Passaggio 2 (formazione di protrusione apoptotici) comprende la formazione di protrusioni di membrana lungo come apoptopodia, apoptopodia in rilievo e microtubuli picchi6,7,8. Infine, passo 3 (formazione di ApoBD) include la frammentazione apoptotica protrusioni e/o ApoCells per generare ApoBDs6,9. I risultati precedenti hanno suggerito un ruolo di ApoBDs in favoreggiamento liquidazione delle cellule apoptotiche e mediare la comunicazione intercellulare. Ad esempio, si propone che la frammentazione di un ApoCell in ApoBDs può generare piccoli pezzi 'bite-sized' che potrebbero essere facilmente rimossi da circostante fagociti2,10,11. Inoltre, ApoBDs può harbor una serie di biomolecole quali DNA, RNA e proteine, che possono essere vittime di tratta a cellule circostanti per facilitare cella comunicazione12,13,14. Per funzionalmente studiare questi processi, è fondamentale per confermare tre parametri chiave, tra cui (i) validazione di induzione di apoptosi e ApoBD formazione, (ii) isolamento di ApoBDs e (iii) la conferma dell'ApoBD purezza.
In precedenza, una serie di metodi tra cui citofluorimetria e microscopia elettronica è stata usata per studiare l'apoptosi e ApoBDs15,16,17,18. Tuttavia, quantificazione e rilevamento di ApoBD sono spesso difficili o trascurato. Per esempio, l'apoptosi di base di citometria a flusso più ordinariamente utilizzati test impiega Annessina V (A5, una proteina che lega l'esternalizzati ' mangiare-me' segnale fosfatidilserina (PtdSer)) e dell'acido nucleico macchia propidio ioduro (PI)19. Tuttavia, con questa combinazione di macchia universale, analisi presuppone che ci sono solo tre tipi di sottoinsiemi di cellule (cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche) nel campione. Inoltre, anche se considerata come "gold standard" da molti ricercatori per apoptosi, analisi di citometria a flusso e l'analisi successiva dei dati spesso esclude ApoBDs attraverso un passaggio di gating iniziale selezionando eventiintermedio-alto FSC/SSC. Di conseguenza, abbiamo recentemente sviluppato un'analisi di citometria a flusso romanzo usando A5 e TO-PRO-3, un'altra macchia di acido nucleico che può essere preso in modo selettivo di caspase 3/7-attivato Pannexina 1 (PANX1) canali7,20. Come attivazione di caspase 3-induced PANX1 precede l'esposizione PtdSer nella fase iniziale dell'apoptosi, TO-PRO-3 macchie differenzialmente apoptotici e cellule necrotiche. Inoltre, questo approccio combinato con il nostro romanzo gating strategia include eventi tutti acquisiti durante l'analisi dei dati e di conseguenza, sei sottoinsiemi di cellule/particella sono identificati, tra cui: (i) cellule vitali (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso , A-PRO-3bassa), (ii) A5– primi ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso, TO-PRO-3intermedi), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , A-PRO-3intermedi), cellule necrotiche (iv) o tardo ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta, TO-PRO-3alta), (v) ApoBDs (FSC/SSCbasso, A5intermedi, a-PRO-3basso / intermedio) e (vi) detriti (FSC/SSCbasso, A5basso, TO-PRO-3basso)20. Il nostro approccio sottolinea l'importanza di analizzare tutti i sottoinsiemi di cellule/particella e, cosa ancora più importante, la separazione di ApoBDs dalle cellule e detriti20. Quindi, questo approccio dimostra una tecnica efficace per convalidare l'induzione di apoptosi e ApoBD formazione simultaneamente.
Tradizionalmente, i ApoBDs sono stati isolati attraverso una varietà di approcci di centrifugazione differenziale per cui ApoBDs può essere separato dalle cellule o altre vescicole extracellulari in base alla densità. Tuttavia, tali metodi di centrifugazione sono spesso limitati dalla bassa ApoBD purezza, mancanza di una fase di quantificazione per confermare la purezza del campione e/o incapacità di separare cella tipo-specific ApoBDs17,21,22. Di conseguenza, abbiamo sviluppato recentemente due approcci, basati su FACS e un nuovo approccio differenziale basato su centrifugazione che può essere accoppiato con il nostro metodo di citometria a flusso precedentemente stabilito per convalidare l'induzione di apoptosi e campione purezza23. ApoBD isolamento tramite nostro approccio basato su FACS può arricchire ApoBDs fino a 99% di purezza e può essere accoppiato con una varietà di anticorpi specifici del tipo delle cellule per isolare ApoBDs da popolazioni di cellule miste, campioni di tessuti e fluidi corporei23. Inoltre, il nostro approccio riveduto centrifugazione differenziale viene illustrato un metodo efficiente per isolare ApoBDs a > 90% purezza23.
In questo articolo, descriviamo dettagliatamente la nostra procedura sperimentale per convalidare l'induzione di apoptosi e per rilevare e quantificare ApoBD formazione. I flussi di lavoro di isolamento ApoBD utilizzando metodi basati su centrifugazione differenziali e basati su FACS anche elaborati e confrontati. I dati rappresentativi dimostrano che la metodologia descritta fornisce un efficace strumento all'avanguardia per gli studi futuri di ApoBD.

<table><tbody><tr><td>Cellule, ad es. monociti THP-1 umani in coltura (numero di clone: TIB-202)</td><td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Miscela penicillina-streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD </td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td>ioduro</td> Life <td>Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Evitare il contatto diretto.</td></tr><tr><td>10x tampone legante l'annessina V</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (1,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III Citometro a flusso, configurato con due laser per il rilevamento FITC e APC</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II Citometro a flusso, configurato con due laser per il rilevamento FITC e APC</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1 software</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 8.8.6 software</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

I membri principali della famiglia delle vescicole extracellulari, con ApoBDs essendo uno del più grande tipo di corpi apoptotici (ApoBDs), microvescicole ed esosomi. È stato proposto che ApoBDs può aiutare la liquidazione delle cellule, come pure la comunicazione intercellulare attraverso traffico biomolecole. Gli approcci convenzionali utilizzati per l'identificazione e l'isolamento di ApoBDs sono spesso limitati dalla mancanza di quantificazione accurata e purezza basso del campione. Qui, descriviamo un flusso di lavoro per confermare l'induzione di apoptosi, convalidare ApoBD formazione e isolare ApoBDs di elevata purezza. Inoltre, contorni e confrontare approcci di centrifugazione differenziale basato per isolare ApoBDs e fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Inoltre, la purezza del ApoBDs isolato verrà confermata utilizzando un stabilire in precedenza flusso cytometry-based colorazione e metodo analitico. Presi insieme, utilizzando l'approccio descritto, THP-1 del monocito apoptosi e apoptotica delle cellule lo smontaggio è stato indotto e validato, e ApoBD generati dai monociti THP-1 sono stati isolati per una purezza del 97-99%.

Utilizzando la procedura descritta qui, è stato indotto apoptosi monociti THP-1 e ApoBDs sono stati rilevati e isolato tramite un FACS-based o un approccio di centrifugazione differenziale (Figura 1). In primo luogo, l'apoptosi è stata indotta da irradiazione UV e campioni sono stati raccolti dopo 2-3 h di incubazione, quando le cellule hanno esibito apoptotica morfologie, compreso blebbing, formazione di protrusione della membrana apoptotici e la generazione...

Un flusso di lavoro utilizzando una centrifuga di flusso cytometry o differenziale è stato sviluppato per individuare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da un campione di apoptotic di elevata purezza.

Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di rilevare e isolare i corpi apoptotici ad alta purezza. I corpi apoptotici sono un tipo di vescicole extracellulari generate per aiutare l'induzione dell'ematosi. Sono il tipo più grande di famiglia fisica extracellulare che in genere varia da uno a cinque micrometri di diametro.Sta diventando evidente che i corpi apoptotici possono aiutare i processi cellulari, come la clearance cellulare apoptotica e la comunicazione intracellulare. Pertanto, lo sviluppo di una metodologia accurata per rilevare, quantificare e isolare i corpi apoptotici è fondamentale per la personalizzazione delle loro funzioni e meccanismi. In questa serie di approfondimenti vi mostreremo come rilevare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da campioni apoptotici.Parte A, l'induzione dell'apoptosi. Per indurre l'apoptosi nelle linee cellulari, come i monociti THB1, iniziare prima raccogliendo le cellule. Contare le cellule e raccogliere circa 10 milioni di cellule o secondo necessità.Raccomandiamo 10 milioni per l'analisi dei corpi apoptotici. Alloquatare due milioni di cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Rimuovere il coperchio dalla piast

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Un metodo accurato per la valutazione della morte cellulare è descritto. Il protocollo migliora convenzionale annessina V / propidio ioduro (PI), i protocolli, che mostra fino al 40% di falsi positivi eventi in linee cellulari e cellule primarie da una vasta gamma di modelli animali.

Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando...

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

In questo video, il test TUNEL viene eseguito per rilevare la presenza di cellule apoptotiche in un campione. Lo studio prevede l'utilizzo di una speciale DNA polimerasi - deossinucleotidil transferasi terminale - che catalizza l'aggiunta di dUTP marcate all'estremità 3' del DNA frammentato, che può essere osservato e identificato al microscopio a fluorescenza.

Marcatura terminale di dUTP Nick mediata dalla transferasi terminale: saggio TUNEL: un metodo in situ per rilevare la frammentazione del DNA nelle cellule apoptotiche

In questo video, dimostriamo il test di efferocitosi per studiare la clearance delle cellule apoptotiche utilizzando la microscopia confocale. L'efferocitosi è un processo in più fasi in cui le cellule apoptotiche vengono inghiottite dai fagociti e degradate all'interno di vescicole chiamate efferosomi. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare porzioni internalizzate e non internalizzate di singole cellule apoptotiche e quantificare l'efferocitosi.

Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione degli eventi di segnalazione intracellulare indotti in cellule vitali dall'interazione fisica con cellule morte o morenti adiacenti. Il protocollo si concentra sugli eventi di segnalazione indotti dal riconoscimento mediato dal recettore delle cellule morte, in contrapposizione al loro assorbimento fagocitario o al rilascio di mediatori solubili.

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

L'apoptosi può essere caratterizzata dall'analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici precoci e tardivi. La linea cellulare del cancro cervicale, SiHa, è stata analizzata per i biomarcatori dell'apoptosi dopo il trattamento con actinomicina D utilizzando un citometro a flusso da banco.

Analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici in cellule di cancro cervicale SiHa trattate con attinomicina D

Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell'elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.

Composizione di misurazione del complesso di segnalazione che induce la morte CD95 ed elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso

Scopri come rilevare e isolare corpi apoptotici con elevata purezza utilizzando citometria a flusso e centrifugazione differenziale. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi cellulari dell'apoptosi.

Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

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