Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in vari campi di ricerca sulle malattie metaboliche sulle alterazioni molecolari dell'energia epatica e della biosintesi proteica nell'obesità, nel fegato grasso analcolico e nel diabete di tipo due. I principali vantaggi di questa tecnica sono che facilita l'isolamento degli epatociti del topo primario funzionale e rileva le proteine nascenti epatiche attraverso un substrato di etichettatura nonradioattivo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di perfusione è difficile da imparare a causa dei piccoli e sottili vasi sanguigni del topo.

Per la perfusione epatica, inserire con cura un catetere calibro 24 nella Vena Cava inferiore o nell'IVC proprio alla biforcazione con la vena renale destra. Rimuovere l'ago del catetere mantenendo la posizione della cannula all'interno dell'IVC e collegare una cannula calibro 24 con tubo di perfusione utilizzando il connettore. Inizia a perfondere il fegato con HBSS caldo meno a una portata permanente di quattro millilitri tagliando rapidamente la vena splenica per drenare il sangue interno.

Dopo 10 minuti, perfondere il fegato di topo con 35 millilitri di HBSS più integrato con collagenasi tipo X ad una portata di quattro millilitri al minuto, bloccando la vena splenica per circa 10 secondi ogni pochi minuti per facilitare la distribuzione del perfusato in tutto il fegato. Quando tutta la collagenasi è stata perfusa, trasferire il fegato su un tessuto da laboratorio prima di fermare la pompa per evitare il riflusso di sangue nel fegato. Utilizzare le fasci per rimuovere la cistifellea e pulire delicatamente il fegato con un tessuto da laboratorio fresco per rimuovere qualsiasi sangue.

Mettere il fegato in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente cinque millilitri di HBSS caldo fresco più integrato con collagenasi e utilizzare forcep con punta vagante per rimuovere delicatamente la capsula del fegato. Utilizzare le forcep per disperdere accuratamente il tessuto parenchimico e aggiungere 15 millilitri DMEM freddo alla piastra di Petri. Agitare delicatamente il fegato strappato per rilasciare le cellule parenchimali residue nel mezzo e aggiungere altri 15 millilitri di DMEM freddo al piatto per acquisire il resto delle cellule.

Quindi filtrare i liquami tissutali attraverso un colino cellulare da 100 micron in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per isolare gli epatociti primari del topo, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 10 millilitri di DMEM fresco. Sovrapporre accuratamente le celle su un buffer di gradiente di densità del 40% per la separazione del gradiente di densità, eliminando le celle dagli strati superiore e medio dopo la centrifugazione.

Rimospendò il pellet primario di epatociti parenchimali con da due a tre millilitri del Medium E di William per evitare di raccogliere cellule morte dalla parete del tubo e trasferire le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri. Mescolare le cellule con altri sette-otto millilitri del Mezzo E di William prima della centrifugazione e rimorsi il pellet in 10, 20 o 30 millilitri di E medio di William fresco a seconda delle dimensioni del pellet. Dopo il conteggio, seme sei volte 10 alla quinta parte di ogni pozzo di una piastra di sei pozzi per un'incubazione da due a tre ore a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e anti-anti per rimuovere le cellule morte e non attaccate e riportare le cellule nell'incubatrice durante la notte. Per l'etichettatura delle proteine nascenti modificate dall'azide, aggiungere da 20 a 40 microgrammi di litolato cellulare a 50 microlitri di tampone di reazione 2X. Portare il volume a 80 microlitri con acqua deionizzata distillata e vortice la soluzione proteica per cinque secondi.

Aggiungere cinque microlitri di solfato di rame alle cellule per un altro vortice di cinque secondi, seguiti da cinque microlitri di additivo tampone di reazione uno con cinque secondi di vortice. Dopo un'incubazione di tre minuti, aggiungere 10 microlitri di additivo tampone di reazione ricostituito due alle cellule per un altro vortice di cinque secondi e ruotare il campione per 20 minuti a quattro gradi Celsius su una macchina multi-rotatore protetta dalla luce. Al termine della rotazione, aggiungere 300 microlitri di metanolo al lisato, seguiti da 75 microlitri di cloroformio e 200 microlitri di acqua distillata doppia.

Raccogliere la proteina etichettata per centrifugazione e aggiungere 250 microlitri di metanolo fresco al pellet. Dopo il vortice, centrifugare nuovamente il lisato e coprire il pellet nudo con un tessuto privo di pelucchi per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'analisi PAGE, solubilizzare il pellet essiccato in 20 microlitri di tampone di carico senza beta-mercaptoetanolo e vortice il pellet per 10 minuti.

Successivamente, riscaldare la proteina in un blocco termico di 70 gradi Celsius per 10 minuti e caricare il campione su un gel di solfato di dodecil di sodio al 10% per il rilevamento della tetrametillrhodamina. Quindi utilizzare uno scanner laser in modalità variabile per la quantificazione precisa delle proteine nascenti etichettate AHA. Istologicamente, gli epatociti primari vivi e attaccati appaiono tipicamente di forma poligonale o esagonale con un confine membranoso chiaramente delineato dopo 24 ore di coltura.

Per confermare se le cellule isolate sono epatociti primari, in questo esperimento, i livelli di espressione delle proteine dell'albumina sono stati confrontati nei fibroblasti embrionali del topo, una linea cellulare di epatoma del topo, epatociti di topo primari isolati e fegati di topo. L'espressione della proteina dell'albumina è stata rilevata negli epatociti primari del topo e nei fegati di topo, ma non era rilevabile né nei fibroblasti embrionali del topo né nelle cellule della linea cellulare dell'epatoma. Il trattamento primario con epatociti con Rotenone micromolare per quattro o sei ore ha rivelato una robusta induzione della protein chinasi epatica attivata dall'AMP rilevata dall'aumento dei livelli di fosforilazione sulla proteina chinasi Epatica attivata da AMP T172 simile a quelle osservate in vivo.

Infatti, cinque ore di trattamento rotenone micromolare 10 hanno avuto profondi effetti inibitori sulla nascente sintesi proteica negli epatociti primari trattati rispetto alle cellule di controllo non trattate come dimostrato da un saggio di reazione di ligation chemioselettiva. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare in anticipo tutti i reagenti e i mezzi necessari. Questa tecnica ha spianato la strada al ricercatore nel campo della fisiopatologia metabolica epatica per esplorare il meccanismo molecolare della regolazione delle proteine energetiche nell'obesità e il diabete di tipo due nell'epatocita primario isolato del topo.