Name: Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Scopri un biosensore microbico anaerobico per valutare la biodisponibilità di mercurio e cadmio in ambienti anossici. Questo metodo fornisce dati in tempo reale essenziali per comprendere il ciclo biogeochimico dei metalli tossici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vorremmo ringraziare commenti da due revisori anonimi come ben membri del Poulain Lab per penetranti discussione sullo sviluppo del biosensore anaerobico. Un precoce Researcher Award dalla provincia dell'Ontario e una sovvenzione di Discovery e un supplemento di acceleratore da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada per A.J.P finanziato questo studio.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Microbiche biosensori sono strumenti utili per identificare i meccanismi con cui i metalli stanno interagendo con microbi. Qui, descriviamo un metodo che consente di quantificare anaerobicamente HgII e CdII biodisponibilità di una cellula ospite gram-negativi (Escherichia coli) e dare un risultato quantificabile entro poche ore. Uno dei maggiori punti di forza di questo protocollo è che permette un controllo esteso di speciazione nel mezzo di esposizione evitando di ligandi di forte legame o componenti che possono portare alla precipitazione del metallo. Speciazione è stato modellato e testato in questo mezzo di esposizione utilizzando PHREEQC17, tuttavia altri software di speciazione può essere distribuito. Nel caso di nessun aggiunto ligandi, Hg speciazione è previsto per essere presenti come 97% Hg(OH)2 e 3% Hg (NH3)22 +, mentre Cd speciazione sarà presente come 59% Cd-β-glicerofosfato, 25% Cd2 +e 16% CdSO4. Utilizzando un semplice software di modellazione termodinamico, l'utente può progettare esposizione media e testare per la biodisponibilità del metallo di interesse. Inoltre, la cellula ospite biosensore (NEB5α die. coli ) è praticabile su una vasta gamma di pH (5-8,5) e la concentrazione di NaCl (0-0,55 M)17.
Hg la metilazione è un processo anaerobico, e il protocollo descritto in questo studio non è un requisito per l'ossigeno, consentendo per la descrizione più accurata del metabolismo anaerobico sulla biodisponibilità del metallo. Questo è importante perché la presenza di ossigeno altera gene expression profili48,49 e quindi, potenziale di trasporto vie; Pertanto, questo metodo presenta un vantaggio sopra attualmente esistente aerobiche alternative. Il costrutto di biosensori presentato qui potenzialmente può essere utilizzato con altri host anaerobica che potrebbero essere più pertinenti per la metilazione di mercurio (ad esempio Geobacter, Desulfovibrio), ma forse meno trattabili di e. coli. Una limitazione di corrente dell'approccio presentato qui è che il nostro limite di rilevazione non ha ancora raggiunto i livelli di pM, contrariamente alle esistenti sistemi aerobici4,19,37. È tuttavia importante notare che per raggiungere questi limiti di rilevabilità basso diversi passaggi devono essere scattata44: io) aggiunta di legante è necessaria per assicurare che Hg rimane in soluzione e non adsorbe sulla parete della cellula microbica (Hg sarà irreversibile con associazione alla cella tioli superfici impedendo la sua biodisponibilità25,27; Vedi la risposta di soglia per Hg in Figura 3A), ii) modifiche alla densità delle cellule, o iii) modificare il costrutto genetico per includere proteine di trasporto della mer-operone (vale a dire merT e merP), crescente flusso di Hg all'interno la cella50,51. Queste modifiche sarebbe utile nella rilevazione di basse concentrazioni di Hg, ma non necessariamente ideale quando valutare situazioni ambientali rilevanti. Considerando che precedente biosensori di cadmio esistano principalmente come una "prova di principio", furono progettati nel complesso media che non permettono al ricercatore di valutare il ruolo della speciazione su biodisponibilità41,42, 43 , 44.
Il biosensore è uno strumento incredibilmente utile nel determinare meccanismi in cui specie metalliche sono biodisponibili. Perché l'organismo ospite non è un Hg-methylator, può essere utilizzato solo per sviluppare un modello per come Hg possono entrare batteri gram-negativi e non una definitiva spiegazione razionale per quanto Hg-methylators acquisire Hg. Esistono altri metodi per determinare la biodisponibilità di Hg, come metilazione, come un risultato dell'assorbimento o l'utilizzo di un bilancio di massa approccio10,15,20,45,46. Detto questo, il metodo presentato qui offre il vantaggio di quasi tempo reale biodisponibilità dati in cellule vitali. Non è consigliabile questo metodo essere utilizzato per quantificare i livelli totali di Hg o Cd in una matrice ambientale. Nonostante l'uso proposto di biosensori per determinare le concentrazioni di metalli nel ambiente36, molti più facilmente disponibili metodi standard sono disponibili quali ICP-MS, FAAS (per analisi di Cd) o spettroscopia di assorbimento atomico di vapore freddo (per Hg analisi). Il biosensore può tuttavia essere utilizzato per determinare se una data matrice ambientale ha il potenziale per migliorare o ostacolare la biodisponibilità; Ciò si ottiene eseguendo aggiunte standard.
Il pH dell'esposizione media può essere alterato per ovunque all'interno della gamma di 5 e 8.5, purché l'acido libero di MOPS (buffer) viene scambiato con un acido libero alternativo di un buffer con il pKa appropriato (si veda elenco di buffer appropriato (Ferreira et al. (2015) 47) e regolato con KOH al pH appropriato quando si effettua l'esposizione media. Inoltre, il metodo non è limitato a Hg e Cd, ma potrebbe essere esteso ad altri metalli con altri regolatori della trascrizione.
Il test di esposizione può essere modificato per esplorare l'influenza di altri accettori come O2 e fumarato sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Piccole modifiche al metodo di utilizzare sia O2 e fumarato come accettori sono disponibili su richiesta.
In sintesi ci piacerebbe sottolineare i seguenti punti: io) è imperativo che le concentrazioni di stock di Cd e Hg sono noti nel passaggio 2, questi verranno utilizzati per calibrare il biosensore. II) il giorno di esposizione, la crescita delle cellule deve essere interrotta in un OD600 di 0,6 (± 0,1) e che la cura è presa quando risospensione delle colture cellulari, come il biosensore è calibrato per la densità delle cellule. III) , infine, è importante che il mezzo di esposizione fatta meticolosamente il giorno dell'esposizione. Per garantire il successo del protocollo, le colture multiple devono essere coltivate contemporaneamente (per eludere la possibilità di guasto di sviluppo) e il mezzo di crescita dovrebbe essere rifatto settimanale (per eludere la metastabilità dei media e della possibile contaminazione). Si deve anche osservare che replicati biologici (più colture cellulari) esprimono la variabilità quando si tratta di produzione del segnale. Anche se le risposte fluorescente possono variare da cultura a cultura, le tendenze fluorescente in risposta a una determinata variabile dovrebbero rimanere lo stesso nel corso di numerose repliche biologiche.

Mercurio (Hg) è un inquinante globale e la sua biodisponibilità per Hg metilazione microbi è il primo passo verso la biomagnificazione attraverso reti alimentari e suoi possibili effetti neurotossici in essere umano e della fauna selvatica1. Attualmente si pensa che la metilazione Hg microbica è un processo intracellulare che richiede: i) la specie di Hg per essere bioavailable2,3,4,5,6,7 e ii) per la cella per essere fisiologicamente in grado di metilazione Hg8,9,10. Cadmio (Cd) bioaccumulabile negli organismi, ma fa non magnificazione in foodwebs e viene ampiamente utilizzata nei processi industriali e commerciali che comunemente causano le esposizioni acute nelle persone e l' ambiente11. Anche se i microbi svolgono diversi ruoli chiave nel destino di Hg nell'ambiente, maggior parte degli studi su Cd geochimica ed ecotossicologia concentrarsi su eucarioti microbici12. Consumo di colture agricole (per esempio, riso) è la principale fonte di esposizione diretta al cadmio; in questo caso, la biodisponibilità del Cd ai microbi di rizosfera influenza direttamente la quantità piante possono accumularsi13.
Percorsi di trasporto HG sono complesse e possibilmente coinvolgono un trasporto attivo passaggio14. Quando è coinvolto un trasportatore, il lavoro recente ha suggerito che HgII utilizza un ZnII o MnII trasportatore7,15,16,17. Considerando che CdII è supposto per essere accidentalmente trasportato nel citosol attraverso percorsi di trasporto metalli bivalenti (particolarmente MnII o ZnII), meccanismi di CdII trasporto dentro le cellule rimangono via trasporto speculativa e no Cd-specifico è stato identificato13,18. Indipendentemente dalla natura dei trasportatori coinvolti, tre fattori meccanicistici in definitiva determinano la capacità dei metalli per immettere una cella: i) la speciazione del metallo nella soluzione2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) le proprietà biophysiochemical della membrana cellulare17,24,25,26,27,28,29 ,30,31e iii) la possibilità per il metallo accedere a un sito di trasporto7,32. È improbabile che esiste come ioni liberi in condizioni microbiche fisiologicamente rilevanti a causa della loro alta affinità per dissolto Organic Matter (DOM), CD e Hg chelanti contaminanti (ad esempio, EDTA), o ridotto zolfo moiety33, 34,35 (CdII può esistere come un libero dello ione o forma coppie ioniche in assenza di questi leganti). C'è una mancanza di metodi efficienti nel determinare come queste specie metalliche sono biodisponibili in condizioni pertinenti al loro destino nell'ambiente. Per esempio, Hg è metilato sotto condizioni anaerobiche14, e sia cadmio Hg sono metalli teneri (o cationi di classe B), che richiedono che i loro speciazione essere studiati in condizioni tali da mantengono l'integrità dei gruppi ridotti dello zolfo.
Microbiche biosensori sono cellule batteriche che emettono un segnale quantificabile in risposta alle concentrazioni intracellulari di un metallo, in questo caso Hg o Cd. Come tali, essi sono strumenti ideali per capire come metalli inserire una cella36, purché le condizioni di esposizione vengono accuratamente controllate per. Biosensori di Hg in genere contengono fusioni del gene fra i circuiti regolatori del mer-operone (inclusi geni codificanti per il regolatore della trascrizione Armando nonché l'operatore e promotore regioni dell'operone) e reporting geni (per esempio, Lux, gfp, lac geni). Quando il mercurio è presente nel citoplasma, assocerà al MerR, conseguente trascrizione dei geni segnalazione e successivo segnale produzione19,37. Specifiche Cd biosensori sono solitamente progettati utilizzando cadC, cadAC, zntA o zntR codificati trascrizione regolatori38, ma vale la pena notare che MerR ha un'affinità più bassa, ancora quantificabile a Cd5. A causa di restrizione aerobico della maggior parte comunemente utilizzato proteine reporter fluorescenti o luminescenti, fino a recentemente microbiche biosensori è rimasto incapace di offrire intuizioni la biotrasformazione dei metalli in condizioni anossiche. Questo rende anaerobica rilevamento della biodisponibilità di metalli molto difficile in una gamma di condizioni pertinenti al loro destino ambientale, in particolare in presenza di redox sensibili ligandi (ad es., solfuro e tioli)4, 5 , 39.
Per alleviare la transenna metodologica di live imaging in assenza di ossigeno, Drepper et al. (2007) hanno sviluppato una proteina fluorescente flavina-base (FbFp), basato su dominio di tensione di ossigeno luce della proteina SB2 da p. putida. Questa famiglia di proteine è in grado di essere flourescente in assenza di ossigeno40. Basandosi sul lavoro di Drepper et al., il nostro laboratorio progettato un biosensore anaerobico permettendo per lo studio della biodisponibilità di Hg in condizioni ossidanti e anossiche e sopra una vasta gamma di salinità 17. Nella carta attuale, descriviamo come preparare e utilizzare il biosensore per testare influenza le variabili di ambiente sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Anche se abbiamo sviluppato il biosensore per HgII, abbiamo scelto di eseguire esperimenti con CdII come un mezzo per attirare l'attenzione del lettore sul fatto che i biosensori possono anche rispondere a fattori di stress multipli che sono suscettibili di co-accadono in campo ambientale matrici; in questo caso CdII è stato studiato perché è noto da associare al regolatore trascrizionale MerR5. Qui, indichiamo calibrazione rappresentativo e funzionale lineare gamme rispetto o metallo. Diamo anche un esempio quando i risultati di biosensore sono conclusivi (MgII e MnII sulla biodisponibilità di Hg) e inconcludenti (ZnII sulla biodisponibilità di Hg).

<table><tbody><tr><td>Flaconcino standard da 7 ml, interno arrotondato</td><td>Delta Scientific</td><td>200-007-20</td><td>34</td></tr><tr><td>consigliato Vassoio per flaconcini, aperture da 21 mm</td><td>Delta Scientific</td><td>730-2001</td><td>4 per (griglia 4 x 8)</td></tr><tr><td>24 mm Chiusura</td><td>Delta Scientific</td><td>600-024-01</td><td>32 consigliato</td></tr><tr><td>TACCA ANGOLARE COPERCHIO BLK STR CS/50</td><td>Corning</td><td>Corning 3931</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96- micropiastra con superficie non vincolante a fondo chiaro</td><td>Corning</td><td>Corning 3651</td><td></td></tr><tr><td>Camera anaerobica (glovebox)</td><td></td><td></td><td>L'aria nella camera anaerobica deve essere (97 % N2 &plusmn; 2 % e 3 % H2 &plusmn; 2 %)</td></tr><tr><td>Catalizzatore</td><td></td><td></td> <td>di palladioConverte O2 in H2O nella camera anaerobica. Non richiesto ma consigliato.</td></tr><tr>Lettore <td></td><td></td><td></td><td>di micropiastre</td></tr><tr><td>450 (&plusmn; 10) Filtro nM per il lettore</td><td></td><td></td><td></td>di micropiastre</tr><tr><td>500 (&plusmn; 10) Filtro nM per il lettore</td><td></td><td></td><td></td>di micropiastre</tr><tr><td>Fiala per coltura anaerobica (provette di balch) + tappi in gomma Spettrofotometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Modificato per provette per colture anaerobiche</td></tr><tr><td>MA-3000 (analizzatore di mercurio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td> pH <td>Qualsiasi sonda pH funzionerà</td></tr><tr><td>con provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 mL.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtro per siringa in polietersulfone + siringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flaconi</td><td></td><td></td> di vetro sterili/puliti <td>Per terreni di crescita e standard</td></tr><tr><td>Flaconi</td><td></td><td></td> sterili/puliti in plastica o PTFE <td>Per soluzioni alcaline (NaOH/KOH)</td></tr><tr><td>Reagenti in polvere: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, sale sodico di ampicillina, sali minimi Difco M9, glucosio, MgSO4, tiamina HCl, NaNO3, l-leucina, l-isoleucina valina, sale sodico EDTA, FeSO4, beta-gilcerofosfato di sodio, acido libero da mops, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> sterile Milli-Q <td>sterilizzata in autoclave o con filtro va bene.</td></tr><tr>Brodo <td></td><td></td><td></td><td>di lisogenia</td></tr><tr><td>Grado analitico H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Biodisponibilità di mercurio (Hg) ai microbi è un passo fondamentale per tossici Hg biomagnificazione in reti alimentari. Trasformazioni di cadmio (Cd) e la biodisponibilità di batteri controllano la quantità che si accumula nelle colture di alimento di base. La biodisponibilità di questi metalli dipende dalla loro speciazione in soluzione, ma più specialmente sotto condizioni anossiche dove Hg è metilato per tossici monomethylmercury (MeHg) e Cd persiste nella rizosfera. Intero-cellula microbiche biosensori dare un segnale quantificabile quando un metallo entra nel citosol e quindi è strumenti utili per valutare la biodisponibilità del metallo. Purtroppo, maggior parte degli sforzi di biosensori finora sono stata vincolata agli ambienti ossidanti a causa della limitata capacità di proteine reporter esistenti di funzionare in assenza di ossigeno. In questo studio, presentiamo il nostro sforzo per sviluppare e ottimizzare un'analisi di cellule intere biosensore in grado di funzionare anaerobicamente in grado di rilevare metalli in condizioni anossiche in tempo quasi-reale ed entro le ore. Descriviamo come il biosensore può aiutare a valutare come chimiche variabili rilevanti per il ciclismo ambientale di metalli influenzano la loro biodisponibilità. Il seguente protocollo include metodi per (1) preparare Hg e Cd standard in condizioni anossiche, (2) preparare il biosensore in assenza di ossigeno, (3) progettazione ed eseguire un esperimento per determinare l'influenza di una serie di variabile biodisponibilità Hg o Cd e (4) quantificare e interpretare i dati biosensore. Mostreremo le gamme lineari dei biosensori e fornire esempi che mostrano la capacità del metodo di distinguere tra metallo biodisponibilità e tossicità utilizzando ceppi sia metallo-viscoelastico e costitutive.

Una volta che i picchi di fluorescenza sono stati quantificati secondo punto 5.3, il risultato dei picchi di fluorescenza possa essere rappresentati graficamente secondo la concentrazione variabile che illustra come tale variabile influenza la biodisponibilità relativa di Hg o Cd. Ad esempio, la curva di taratura della fluorescenza sopra [HgII] dalla Figura 2 produrrà i dati viscoelastici presentati in Figura 3A. Per HgII calibrazione, la curva sarà sempre contengono 3 componenti per il ceppo Hg-inducible; una risposta di soglia di circa 1-2 nM HgII prima produzione del segnale di fluorescenza è linearmente proporzionale [HgII], la gamma lineare dove 5 nM HgII sarà affidabile sempre al centro di tale intervallo e un altopiano dove [HgII] non è più consigliabile aumentare segnale di fluorescenza. Nessun cambiamento nella produzione del segnale sul ceppo costitutivo dimostra che la tossicità da [HgII] non pregiudica la produzione del segnale. Per CdII in Figura 3B, ci sono sempre 2 componenti per il ceppo inducibile; una gamma lineare dove 200-300 nM CdII sarà affidabile sempre al centro del campo lineare e un plateau. Una diminuzione del segnale di fluorescenza con crescente [CdII] Mostra che le più alte concentrazioni di Cd sono tossiche per le cellule e possono spiegare una diminuzione della produzione di fluorescenza viscoelastica dopo l'altopiano a 1000 nM CdII. Pertanto, quando si prova Cd o Hg biodisponibilità rispetto a una variabile di ambiente, si consiglia di utilizzare 5 nM per HgII e 300 nM per CdII.
In alcuni casi, produzione del segnale può essere correttamente attribuito alla biodisponibilità Hg o Cd, ma in altri casi, la produzione del segnale può essere influenzata da variazione dello stato fisiologico della cellula ospite biosensore (ad es., il metallo di interesse o condizioni ambientali testate sono tossiche). In Figura 4A, biodisponibilità di Hg 5 nM è stato testato su una sfumatura di Zn (0-10 µM). Hg-inducible sia in ceppi costitutive, c'è una simile diminuzione nel segnale con un aumento delle concentrazioni di Zn. Di conseguenza, uno non può discriminare se il segnale deriva dalla biodisponibilità abbassata o è il risultato di tossicità di Zn. In Figura 4B e 4C, 5nM biodisponibilità di Hg è stato testato su una sfumatura di MgII (0-10 mM) e MnII (0-10 µM). Mg di aumentare le concentrazioni diII II e Mn sono diminuito il segnale di fluorescenza del ceppo inducibile. D'altra parte, il ceppo costitutivo non ha mostrato una diminuzione in fluorescenza con l'aumento di Mg concentrazioni diII II e Mn (MgII e MnII sono benefiche per le cellule nella produzione di FbFp, come dimostrato da un aumento del segnale di fluorescenza). Questo dimostra che le cellule sono vitali e la diminuzione di fluorescenza del ceppo Hg-inducible deriva da una diminuzione della biodisponibilità di Hg. Questi dati sottolinea quanto sia importante per tutti i saggi di biosensore anche fornire misurazioni costitutive della forma fisica generale delle cellule.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figura 3: gamme lineari del biosensore con mercurio e cadmio. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) HgII (0-15 nM) e B) CdII (0-1.000 nM) in condizioni anaerobiche. Fluorescenza è stata che la media di 3 tecnici replica a 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figura 4: esempio di un risultato inconcludente con zinco e un risultato conclusivo con magnesio e Manganese. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), e C) MnII (0-10 µM) in condizioni anaerobiche. [HgII] è stata impostata a 5 nM per tutti i trattamenti e fluorescenza era la media dei 3 replicati tecnici a 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un biosensore microbico anaerobico di cellule intere di valutare come le diverse variabili ambientali influenzano la biodisponibilità di Hg e Cd ai batteri in ambienti anossici.

Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il ciclo biogeochimico del cadmio e del mercurio, ad esempio come le diverse variabili ambientali influenzano la loro biodisponibilità ai batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre dati di biodisponibilità quasi in tempo reale e cellule vitali indipendentemente dalla presenza di ossigeno. Generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché ci sono molti passaggi sensibili al tempo che richiedono un'attenzione molto meticolosa ai dettagli.A dimostrare la procedura sarà Ben, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prepararsi al saggio, recuperare il biosensore induttibile al mercurio e il biosensore espresso in modo costitutivo da un porcile criogenico di meno 80 gradi Celsius. Placcare le cellule su piastre di brodo di lisogenia contenenti 120 microgrammi per millilitro di ampicillina.Far crescere le colture di piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Tra le 16:30 e le 17:00.m. inoculare una coltura in dieci millilitri di LB con ampicillina e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.Tra le nove e le dieci .m la mattina successiva portare la cultura e il mezzo di crescita precedentemente preparato nella camera anaerobica. Quindi aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita fresco e 210 microgrammi per millilitro di ampicillina in un tubo di balsamo sterile.Ora raccogli due millilitri della coltura coltivata durante la notte e trasferisci in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo aver centrifugato a 10.000 RCF per 90 secondi, rimuovere il supernatante e rimescolare in due millilitri di mezzo di crescita fresco. Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente otto millilitri di mezzo di crescita fresco e ampicillina.Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo prima di rimuoverlo dalla camera anaerobica. Quindi posizionare il tubo in un'incubatrice e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le tre e le cinque p.m.portare il tubo di balsamo con la coltura, un nuovo tubo di balsamo sterile e il mezzo di crescita nella camera anaerobica. Aggiungere 100 microlitri della coltura a 10 millilitri di mezzo di crescita fresco con ampicillina nel tubo di balsamo sterile. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo.Rimuovere il tubo dalla camera anaerobica prima di coltivarlo durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le nove e le .m giorno successivo, trasferire la cultura e il mezzo di crescita alla camera anaerobica.Aggiungere nuovamente otto millilitri di mezzo di crescita e ampicillina in un tubo di balsamo sterile. Trasferire due millilitri della coltura coltivata durante la notte in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo la centrifugazione come prima, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in due millilitri di mezzo di crescita fresco.Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente il mezzo di crescita fresco e l'ampicillina. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo. Rimuoverlo dalla camera e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.Monitorare la crescita della coltura utilizzando uno spettrofotometro vortice la coltura e quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600. Dopo tre o quattro ore di crescita prevista, la cultura dovrebbe raggiungere un OD600 di 6. Ora porta il tubo nella camera anaerobica e trasferisci la coltura in due tubi di micro centrifuga a due millilitri.Dopo la centrifugazione come prima rimuovere il supernatante e rimescolare ogni palato cellulare in due millilitri di mezzo di esposizione fresca. Ripetere questa fase di lavaggio una volta per rimuovere qualsiasi traccia del mezzo di crescita. Ora combina entrambi i tubi di micro centrifuga della coltura cellulare in una fiala standard PTFE da sette millilitri per ottenere il materiale del biosensore da utilizzare nel saggio di esposizione.Prima di iniziare l'esperimento controllare il monitor anaerobico per assicurarsi che non vi sia ossigeno nella camera anaerobica. Progettare il layout della piastra secondo un modello di pozzo 96. Per eseguire esperimenti in repliche tecniche di tre questo consentirà 32 trattamenti diversi, che è meglio rappresentato con una griglia quattro per otto per impostare le fiale.Impostare la griglia quattro per otto in base al layout della piastra di dosaggio. Quindi posizionare sette flaconcini standard PTFE millilitro nel vassoio. Le fiale devono essere gestite solo manipolando l'esterno del flaconcino.Aggiungere il volume medio di esposizione in ogni flaconcino corrispondente a ciascun trattamento. Ad ogni flaconcino aggiungere il volume corrispondente della variabile chimica da testare in base alla disposizione della piastra. Ora aggiungere nitrato a ogni flaconcino in modo che la concentrazione sia di 200 micromolari.Escludere questo passaggio per gli spazi vuoti costitutivi per il trattamento del biosensore. Per aggiungere mercurio alle fiale, prima prendi il titolo da quattro a otto micromolare e scuoti bene. Diluire la soluzione e il mezzo di esposizione in una fiala PTFE da sette millilitri a una concentrazione da 100 a 250 nanomolare per creare una soluzione di mercurio funzionante.Da questa soluzione di lavoro, aggiungere mercurio alle fiale richieste in base al layout della piastra. Dopo aver aggiunto il mercurio o il cadmio scuotere manualmente la piastra in un moto orbitale. L'esperimento può essere messo in pausa ora a seconda del tempo necessario al mercurio o al cadmio per speciare in soluzione.Quando l'esperimento viene ripreso, pipettare delicatamente il materiale del biosensore di pipette avanti e indietro per garantire l'omogeneità. Quindi aggiungere 100 microlitri del materiale biosensore a ogni fiala e scuotere manualmente la piastra come prima. Riscaldare il lettore di lastre a 37 gradi Celsius e impostare una corsa cinetica per dieci ore con letture ogni due punti da cinque a cinque minuti.Uno scuotimento orbitale tra una lettura e l'altro. Impostare la corsa per effettuare misurazioni della fluorescenza con un'eccitazione a fluorescenza di 440 nanometri e un'emissione di 500 nanometri. Ora pipetta 200 microlitri da ogni flaconcino PTFE nella griglia quattro per otto nei pozzi corrispondenti della piastra del pozzo 96.Pipetta avanti e indietro cinque volte prima di trasferire ogni 200 microlitri. Anziché scartare la punta della pipetta, lasciare la punta della pipetta nel flaconcino PTFE per tenere traccia dell'avanzamento della pipetta. Posizionare la piastra del pozzo 96 nel vassoio del lettore di lastre.Quindi posizionare il coperchio sulla piastra del pozzo 96 e iniziare il saggio. Ecco i risultati rappresentativi che mostrano i dati corretti sulla fluorescenza in funzione del tempo. La fluorescenza è mostrata con concentrazioni crescenti di mercurio al biosensore indutbile.Tutti i valori sono vuoti per il controllo no mercury. I picchi fluorescenti possono essere quantificati per mostrare il segnale fluorescente in funzione della concentrazione di mercurio o cadmio. Sia per i biosensori induttibili che per i biosensori costitutivi, la concentrazione di mercurio o cadmio al centro dell'intervallo lineare dei sensori induttibili deve essere utilizzata per le variabili di prova.Ecco esempi di un risultato inconcludente con lo zinco. E un risultato conclusivo con magnesio e manganese sulla biodisponibilità di mercurio al biosensore. Il risultato con lo zinco è inconcludente perché la fluorescenza costitutiva decade con fluorescenza induttiva che indica tossicità.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di inserire le concentrazioni di cadmio o mercurio in quanto queste verranno utilizzate per calibrare il biosensore. Seguendo questa procedura, altri metodi come la modellazione termodinamica dei sistemi acquosi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come specifiche specie chimiche di mercurio o cadmio influenzano la loro biodisponibilità. Non dimenticare che lavorare con cadmio e mercurio e acidi forti come l'acido solforico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia ambientale per esplorare il mercurio anaerobico quasi in tempo reale o la biodisponibilità di cadmio e i microbi geneticamente trattabili.

an-anaerobic-biosensor-assay-for-the-detection-of-mercury-and-cadmium

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Fonte: Barber, A. E., et al. Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per la rilevazione presuntiva di residui di arma da fuoco. J. Vis. Exp. (2019).Questo video mostra la rilevazione di analiti specifici utilizzando un biosensore batterico. Viene prelevata una coltura batterica che trasporta un plasmide con un gene della proteina fluorescente rossa (RFP) sotto un promotore sensibile all'analita. Dopo aver pulito accuratamente la superficie del test, una piccola sezione...

Rilevamento di un analita target utilizzando un biosensore batterico

Fonte: Stenzler, B. R. et. al., Un saggio di biosensore anaerobico per il rilevamento di mercurio e cadmio. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'uso di biosensori batterici geneticamente modificati per misurare con precisione la frazione biodisponibile degli ioni mercurio in condizioni anaerobiche. Variando la concentrazione di solfato di magnesio, il test garantisce che il biosensore risponda selettivamente agli ioni di mercurio liberi, come indicato dalle variazioni dell'intensità della...

Saggio del biosensore batterico per la rilevazione del mercurio biodisponibile in condizioni anaerobiche

L'integrazione della coltivazione di microalghe con i gas di combustione industriali introdurrà infine metalli pesanti e altri composti inorganici nei mezzi di crescita. Questo studio presenta una procedura utilizzata per determinare il destino finale e l'impatto dei metalli pesanti e dei contaminanti inorganici sulla crescita di Nannochloropsis salina coltivata in fotobioreattori.

Quantificazione dei metalli pesanti e altri contaminanti inorganici sulla produttività delle microalghe

Data l'importanza e ampio uso di palladio, oro e cobalto   metalli in attrezzature ad alta tecnologia, il loro recupero e riciclaggio costituiscono un importante sfida industriale. Il sistema di recupero di metallo qui descritto è un semplice, a basso costo mezzi per un'efficace individuazione, rimozione e recupero di questi metalli dalla miniera urbana.

Rilevamento e recupero di palladio, oro e metalli di cobalto dalla miniera urbana Utilizzando novelli Sensori / Adsorbenti designate con nanoscala Wagon a forma di ruote pori

Viene presentata la caratterizzazione dei complessi formati in diversi rapporti relativi di mercurio (II) e dicicesteinil tetrapeptidi mediante spettrometria di massa orbitrap a ionizzazione elettrospray.

Uno studio della Complessazione di Mercurio (II) con Dicysteinyl Tetrapeptidi da Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Viene descritto l'uso di molecole di polideossinucleotide (aptamero 44-mer) per rilevare lo ione gadolinio (III) non chelato in una soluzione acquosa. La presenza dello ione viene rilevata tramite un aumento dell'emissione di fluorescenza del sensore.

Un sensore Aptamero-based per Unchelated gadolinio (III)

Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.

Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata

Questo lavoro ha discusso il protocollo per la progettazione e lo sviluppo di un dispositivo POCT E-Eye-Enable per rilevare Fe, Cr, As e F in campioni ambientali, campioni biologici e alimenti e bevande. Sono stati testati quasi 2000 campioni e i risultati concordano con la tecnica gold standard.

TD-DFT Tecnica avanzata di rilevamento E-Eye guidata per la quantificazione in loco di Fe, Cr, F e As nei campioni ambientali, biologici e alimentari

Questo documento descrive la progettazione, la costruzione, e la funzione di un impianto di 1.000 m 2 contenente 24 singoli appezzamenti 33,6 m 2 campi attrezzati per la misurazione dei volumi totali di deflusso con il tempo e la raccolta di sottocampioni di deflusso a intervalli selezionati per la quantificazione dei componenti chimici in acqua di deflusso da prati casa simulati.

Progettazione e Costruzione di un Research Facility deflusso urbano

Scopri un biosensore microbico anaerobico per valutare la biodisponibilità di mercurio e cadmio in ambienti anossici. Questo metodo fornisce dati in tempo reale essenziali per comprendere il ciclo biogeochimico dei metalli tossici.

Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Esplora altri video