Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ammino-ingegneria. Ad esempio, qual è il ruolo delle proprietà fisiche delle particelle sulle interazioni e l'attivazione delle cellule immunitarie dei biomateriali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un controllo indipendente delle dimensioni e della forma delle particelle biomimetiche.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del cancro in quanto è una terapia con particelle fuori dallo scaffale che può causare risposte immunitarie mediate in cellule in vivo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'amminoterapia del cancro, può anche essere applicato ad altri sistemi. Come, malattie infettive o diabete di tipo Uno.

Per la sintesi di microschede, iniziare pesando 100 milligrammi di poli (acido lattico-co-glicolico) o PLGA, in una fiala a scintillazione e sciogliendo il PLGA in cinque millilitri di diclorometano mediante vortice. Posizionare un omogeneizzatore in un bicchiere contenente 50 millilitri di alcol polivinilico all'1% o soluzione di PVA, in modo che l'omogeneizzatore sia il più vicino possibile al fondo del becher senza toccarlo. Accendere l'omogeneizzatore alla velocità appropriata e aggiungere la soluzione PLGA al becher per un minuto di omogeneizzazione.

Al termine dell'omogeneizzazione, versare la soluzione di micro-particelle PLGA alcoliche polivinilici in un bicchiere contenente 100 millilitri di soluzione di 5%PVA su una piastra di agitazione in una cappa chimica e mescolare la soluzione per almeno quattro ore. Quando il solvente è evaporato, versare la soluzione di particelle in tubi conici da 50 millilitri e raccogliere le particelle mediante centrifugazione. Sostituire il supernatante in ogni tubo con 20 millilitri di acqua deionizzata e sospendere di nuovo le particelle con vortice.

Quindi portare il volume finale in ogni tubo fino a 50 millilitri con acqua deionizzata fresca e lavare le particelle altre due volte come appena dimostrato. Per la sintesi di nanoparticelle, sciogliere 200 milligrammi di PLGA in cinque millilitri di diclorometano e posizionare una sonda sonicatore in un bicchiere contenente 50 millilitri di soluzione di 1%PVA sul ghiaccio senza toccare il fondo del becher. Iniziare la sonicazione a 12 watt e aggiungere immediatamente la soluzione PLGA al becher per una sonicazione di due minuti per generare nanoparticelle con un diametro approssimativo di 200 nanometri.

Dopo la sonicazione, versare la soluzione di nanoparticelle PLGA al 1% di alcol polivinile in un bicchiere contenente 100 millilitri di soluzione di 5 PVA su una piastra di agitazione per quattro ore di evaporazione del solvente in una cappa chimica dei fumi. Quando tutto il solvente viene evaporato, versare la soluzione di particelle in tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione per rimuovere eventuali micro-particelle e rimuovere i supernatanti. Quindi trasferire le nanoparticelle in tubi di centrifuga ad alta velocità per tre lavaggi in acqua deionizzata come dimostrato.

Per la fabbricazione di particelle polimeriche, dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le particelle in circa un millilitro di acqua deionizzata fresca e aggiungere la soluzione di fusione del film alle particelle ad una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per particelle millilitre. Trasferire la sospensione delle particelle in aliquote da 10 millilitri in piastre di Petri rettangolari da 75 per 50 millimetri per uno stiramento unidimensionale. O in aliquote da 15 millilitri in piastre di Petri quadrate da 100 per 100 millimetri per lo stretching bidimensionale.

Dopo l'asciugatura notturna in una cappa chimica, utilizzare una pinzetta per rimuovere le pellicole e tagliare i bordi con le forbici. Per lo stretching 1D, posizionare i due bordi corti di una pellicola tra due pezzi di gomma neoprene per il montaggio sui blocchi di alluminio di un asse di un dispositivo di stiramento automatico a film sottile. Quindi utilizzare una chiave inglese Allen per avvitare le impugnature metalliche sopra la gomma per tenere il film in posizione.

Per lo stiramento 2D, montare tutti e quattro i bordi su quattro blocchi di alluminio per allungare la pellicola su entrambi gli assi misurare e registrare la lunghezza della pellicola tra i blocchi di alluminio su un asse per uno stiramento D o entrambi gli assi per lo stiramento 2D e calcolare la distanza necessaria per allungare la pellicola in una o due direzioni in base all'allungamento della piega desiderato. Quindi posizionare il dispositivo di stiramento caricato in pellicola in un forno a 90 gradi Celsius accanto a un becher più grande di una piccola quantità di acqua per portare il film a temperatura superiore a 10 minuti. Al termine dello stiramento, lasciare raffreddare il film a temperatura ambiente per 20 minuti.

Per lo stretching 1D, tagliare il film dal dispositivo di allungamento ai bordi. Per lo stiramento 2D, ritagliare e salvare il quadrato centrale della pellicola che è uniformemente allungato su entrambi gli assi. Posizionare le pellicole in tubi conici da 50 millilitri con non più di due pellicole per tubo e aggiungere circa 25 millilitri di acqua deionizzata a ciascun tubo per il vortice.

Quando le pellicole si sono sciolte, lavare le particelle tre volte in acqua deionizzata come dimostrato. Sospensione delle particelle in circa un millilitro di acqua deionizzata fresca per tubo dopo l'ultimo lavaggio. Quindi congelare le particelle a meno 80 gradi Celsius per un'ora o la liofilizzazione notturna.

La mattina seguente, sospendere di nuovo le micro o nanoparticelle lyophilizzate a 20 milligrammi per millilitro in tampone MES appena preparato con vortice. Aggiungere 100 microlitri della soluzione particellare a un tubo di micro centrifuga in polipropilene contenente 900 microlitri di buffer MES e aggiungere 100 microlitri di soluzione EDC NHS appena preparata. Mescolare le particelle vortice e incubare le particelle su un inverter a temperatura ambiente per 30 minuti.

Alla fine dell'incubazione, raccogliere le particelle per centrifugazione e sospendere di nuovo i pellet di microparticelle in un millilitro di PBS vortice o ri-sospendere le nanoparticelle in un millilitro di PBS di cinque secondi di sonicazione a due o tre watt. Successivamente, aggiungere otto microgrammi di un segnale adatto una proteina e 10 microgrammi di anticorpo CD28 anti topo alle microparticelle, o 16 microgrammi del segnale una proteina e 20 microgrammi di CD28 anti topo alle nanoparticelle. Portare il volume finale in ogni tubo a 1,1 millilitro con PBS e incubare le particelle durante la notte su un inverter a quattro gradi Celsius.

Il giorno dopo, lavare le particelle tre volte in acqua deionizzata come dimostrato. Queste nano e microparticelle PLGA sono state sintetizzati utilizzando le singole tecniche di emulsione come dimostrato e immaginato usando la microscopia elettronica a trasmissione e scansione. Dopo l'omogeneizzazione, le micro-particelle hanno dimostrato un diametro medio di circa tre micrometri.

Le micro-particelle sferiche avevano una razione di aspetto di circa una, mentre le particelle ellissoidali prolate 1D avevano un rapporto di aspetto più grande di circa tre anni e mezzo e le particelle ellissoidali oblate allungate 2D avevano un rapporto di aspetto di circa 1,2, mantenendo approssimativamente un rapporto di aspetto di uno. I risultati dell'efficienza coniugazione rivelano le quantità simili di proteine sulla superficie delle cellule di presentazione dell'antigene micro-artificiale sferico ed ellissoidale, o AAPC e nano-AAPC, dimostrando che l'accoppiamento proteico durante la sintesi AAPC avviene in modo dipendente dalla concentrazione. Si è scoperto che l'AAPC ellissoidale prolato induce livelli più elevati di proliferazione cellulare T a dosi sub-sature rispetto all'AAPC sferico con la migliore separazione raggiunta a una dose di 01 milligrammi.

Dopo sette giorni, il conteggio manuale delle cellule T ha rivelato che l'AAPC ellissoidale prolato stimola più efficacemente le cellule T rispetto alle loro controparti sferiche su scala micro e nano in modo dipendente dalla dose. Seguendo questa procedura, AAPC può essere amministrato in vivo per misurarne l'efficacia terapeutica e la farmacocinetica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito a spianare la strada ai ricercatori nel campo dell'immuno-ingegneria per esplorare l'effetto dell'anisotropia sull'efficacia AAPC.