Name: Fegato-on-a-Chip colture di epatociti primari e cellule di Kupffer per infezione da Virus dellepatite B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri il metodo "liver-on-a-chip" per colture di epatociti primari e cellule di Kupffer. Questo sistema microfluidico permette di studiare l'infezione da virus dell'epatite B in un microambiente epatico fisiologico per periodi prolungati.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione di Starter dal Consiglio europeo della ricerca (637304), un Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) e dalle innovazioni Bio CN.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le sfide nel mantenimento di colture a lungo termine di PHH hanno guidato lo sviluppo di diversi modelli di cultura con una maggiore funzionalità e longevità, ciascuno che esibiscono differenziali vantaggi e svantaggi. Ora è ampiamente riconosciuto che culture statiche 2D di PHH sono che imita alcuni aspetti della biologia dell'epatocita per quantità molto limitata di tempo. Così, bioerodibili cocultures12,13, sferoide culture14,15, e16,di culture di fegato-on-a-chip 3D17 stanno rapidamente sostituendo questi sistemi più di base. Soprattutto quando lo studio delle malattie infettive, che hanno si con il loro ospite di utilizzare specifici microambienti, il requisito per fornire ambienti fisiologici è sostenuto dalla natura spesso impegnativa di coltura umana-Tropico malattie infettive, tra cui il virus dell'epatite C, HBV e la malaria.
La fase più critica nell'esecuzione 3D fegato-on-a-chip culture è la qualità dei tipi cellulari primarie inizialmente provenienza. Queste cellule devono essere testate per la loro capacità di aderenza e solo placcabili PHH lotti dovrebbero essere utilizzati al fine di garantire la formazione di tessuto di successo e la generazione di cultura. Anche se PHH appena isolato può essere utilizzato, loro crioconservazione è solitamente complicato e richiede speciali congelatori tasso-controllato.
In contrasto con le colture 2D statiche convenzionali, il background genetico di host è trascurabile per quanto riguarda la suscettibilità all'infezione da HBV, e tutti i donatori dell'epatocita testata-finora sono in grado di stabilire l'infezione di HBV4.
Anche se derivato paziente HBV stabilisce infezioni delle culture 3D, è imperativo utilizzare PEG-precipitata e saccarosio cuscino-purificato HBV ogni volta utilizzando viscoelastica HBV produttore cella linee per la generazione di inoculi virali. Surnatanti delle cellule direttamente applicati alle culture di fegato-on-a-chip 3D, sia attraverso la presenza di fattori inibitori o a causa di un'incompatibilità di fattori di crescita presenti con epatociti, non facilmente provocare infezione. Inoltre, quando si seleziona paziente-derivato inoculi virali, solo siero dovrebbe essere usato, poiché al plasma inevitabilmente coagula e ostruisce la circolazione di microfluidica della piattaforma cultura.
Indipendentemente dal fatto l'inoculo virale utilizzato, garantendo la vitalità cellulare e la differenziazione, nonché a garantire la rimozione completa dell'inoculo iniziale da HBV, è chiave a successo studi di infezione a lungo termine. Il modo più conveniente per fare questo è campionamento culture dopo la rimozione dell'inoculo virale, come pure la misurazione dei livelli di albumina sierica umana per tutto il periodo di cultura. Della nota, allo stesso modo per tutte le altre piattaforme descritte, l'infezione da HBV, una volta stabilito, non prontamente diffuso a cellule non infette. Il meccanismo di fondo per questo rimane evasivo, poiché l'infezione da HBV in vivo prontamente infetta la maggior parte degli epatociti all'interno del fegato.
Per quanto riguarda cocultures delle cellule PHH e Kupffer, si consiglia di eseguire prove del lotto delle cellule stellate per valutare la secrezione di IL6 e TNFα in risposta alla stimolazione dei LPS, poiché non tutti i donatori di cellule di Kupffer disponibili in commercio hanno una reattività uguale.
Cosa importante, per tutti i trattamenti farmacologici o infezione iniziale delle culture con HBV, il volume totale del pozzo (1,4 mL), anche a partire dal canale microfluidico (0,2 mL), deve tener conto per il calcolo delle concentrazioni di farmaco o dell'inoculo. Al fine di garantire un dosaggio preciso, viene eseguita una fase di lavaggio con mezzo contenente HBV o farmaci al fine di adescare il canale microfluidico.
La piattaforma utilizzata utilizza 600.000 PHH per pozzetto, che assicura gli epatociti multistrati all'interno di impalcature. Anche se il numero di cellulare può essere variato, la concentrazione di cellule selezionate garantisce risultati ottimali. Il formato di piastra detiene un totale di 12 ponteggi, che può essere aggiornata a 36 impalcature. Tuttavia, a causa dei requisiti di microfluidica, scalabilità di numeri ben più alti non è possibile fino ad oggi.
Utilizzando questi approcci, culture possono essere mantenute con prestazioni ottimali delle cellule per almeno 40 giorni, che, finora, offre opportunità senza precedenti per valutare nuovi farmaci candidati, come pure di studiare l'interazione complessa tra differenti delle cellule epatici popolazioni durante l'infezione da HBV.

Lo studio di HBV è stato complicato dalla scarsa suscettibilità dei sistemi di coltura, che richiedono diverse centinaia di migliaia di copie del genoma HBV per cella per avviare l' infezione1. Inoltre, epatociti umani primari sono generalmente estremamente fragili e rapidamente dedifferentiate durante le colture convenzionali2. Questo è dovuto principalmente al fatto che le superfici in plastica piane e dura non imitare gli ambienti naturali extracellulari trovati all'interno del fegato e la generale mancanza di ossigenazione delle culture in assenza di circolazione di microfluidica. Culture tradizionali dell'epatocita statico sulle piastre rivestite con collagene rapidamente dedifferentiate e perdono la loro suscettibilità all' infezione di HBV3. Qui, descriviamo il set-up e l'infezione di PHH coltivate in 3D culture di fegato-on-a-chip, che sono enormemente vantaggiose sopra le colture statiche 2D convenzionali PHH sulle piastre rivestite con collagene grazie alla loro estesa competenza funzionale e metabolica, facilitando colture a lungo termine di almeno 40 giorni4. In questo sistema, PHH sono seminati su impalcature rivestite con collagene, che sono continuamente irrorate con terreno di coltura per la fornitura di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule. Anche se sistemi di cultura alternativa per PHH basati su complessi cocultures di fibroblasti murini o sviluppo 3D in sferoidi sono stati convalidati e sono suscettibili di infezione da HBV con molteplicità di infezione di 500 equivalenti di genoma (GE) di HBV per la cellula, 3D fegato-on-a-chip culture rimangono il sistema unico modello in vitro suscettibile di 0.05 GE di HBV per cella4. Questo è inoltre sostenuto dalla necessità dell'utilizzo di alte concentrazioni di solfossido dimetilico (DMSO) e polietilenglicole (PEG) per stabilire l'infezione da HBV in queste culture, che non è indispensabile per l'infezione dei sistemi di coltura di fegato-on-a-chip 3D 4. tra i principali tratti distintivi dell'HBV infezione è la piscina di cccDNA, che agisce come il modello trascrizionale per tutti de novo–prodotto virioni5,6. Anche se cccDNA può essere rilevata in convenzionale dell'epatocita culture7,8, rimane poco chiaro se la regolazione del cccDNA ed eventuali approcci terapeutici volti a sua eliminazione sono ricapitolati parzialmente o completamente dedifferentiated epatociti. Abbiamo dimostrato che cccDNA funzionalmente è formata nelle culture di fegato-on-a-chip 3D, risponde a stimoli fisiologici e possa essere mirato interferendo con l'accessibilità del macchinario trascrizionale al genoma cccDNA4.
Risposta dell'ospite all'infezione di HBV in 3D mimica di fegato-on-a-chip quelli osservati in pazienti con infezione da HBV, che consentano l'identificazione di biomarcatori per infezione, così come successo terapeutico. Tra le caratteristiche uniche delle culture di fegato-on-a-chip è la capacità di valutare le risposte ospite a lungo termine tra PHH e altre cellule parenchimale all'interno del fegato, incluse Kupffer cellule4e cellule stellate9fegato sinusoidale cellule endoteliali10,11. Questo offre l'opportunità unica per valutare interazioni cellula/cellula in un microambiente 3D complessa.
Inoltre, il periodo di coltura estesa di questa piattaforma facilita la valutazione dei trattamenti farmacologici sequenziale e il loro impatto sulla persistenza di HBV, che non sono possibili utilizzando sistemi di coltura convenzionale dell'epatocita.
Questo protocollo descrive come 3D fegato-on-a-chip culture vengono generate, monocolture di PHH o per cocultures di PHH con cellule di Kupffer. Inoltre, descriviamo la produzione di HBV purificata per gli studi di basso-molteplicità di infezione, come pure l'analisi successiva di host e risposte virali.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, senza rosso fenolo</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Epatocita Scongelamento Medium</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Epatociti primari Integratori per lo scongelamento e la placcatura</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Integratori per il mantenimento degli epatociti primari</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>avanzato GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, origine USA, inattivato al calore, filtrato sterile, adatto per colture cellulari</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Tripano blu</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Collagene da pelle di vitello</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio anidro</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico, 99,999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (umana)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp; Albumina sierica bovina, frazione V, trattata con shock termico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride da Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits/Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana sterile</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Piastra per colture cellulari di perfusione</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip coperchio per piastra di coltura</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro rotonda sterile</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Scaffold per l'attacco cellulare</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Anello di ritegno</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Stantuffo sterile</td><td>CN Bio innovations</td> Kit per sangue e tessuti <td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Saggio Luminex magnetico umano</td><td>R & D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di substrato Ultra TMB-ELISA in 1 fase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Mini set di accessori per RNA virale QIAamp</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>contenente trasportatore di RNA</td></tr><tr><td>Millicell HY Pallone per coltura cellulare a 5 strati, T-1000, sterile</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica a 384 pozzetti PFHYS1008 MicroAmp con</td><td>tecnologie Barcode Life</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp</td><td>Tecnologie Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td> Nastro sigillante 442404 <td></td></tr><tr><td>per piastre a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtri monouso sterili a flusso rapido per bottiglie con membrana PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Vetrini microscopici con bordi rettificati, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Ultratrasparente, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cellule primarie / Linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Plateable Hepatocytes, trasportatore qualificato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Cellule di Kupffer umane crioconservate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 linea cellulare</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers/Probes/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA primer diretto</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA primer diretto</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>primer inverso</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>primer diretto</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>primer inverso</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frazione IgG dell'antigene centrale dell'antigene del virus anti-epatite B (policlonale)</td><td>DAKO</td><td>ha interrotto</td><td>la produzione Lotto 10102505</td></tr><tr><td>anticorpo all'albumina umana, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo crossadsorbito all'albumina umana, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio IgG di capra (H + L), Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lotto 1431810</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pompa per vuoto</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pneumatic Hookup</td><td>CN Bio innovazioni</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma LiverChip</td><td>CN Bio innovazioni</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip dock di lavaggio delle piastre</td><td>CN Bio innovazioni</td><td></td><td></td>CN</tr><tr><td>Pinza metallica autoclavabile</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Aspirazione medica Alto vuoto ad alto flusso</td><td>MGE in tutto il mondo</td><td>&nbsp; SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE SERIE 5800 incubatore</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Coppia di precisione automatizzata</td><td>CN Bio innovazioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coppia manuale</td><td>CN Bio innovazioni</td><td></td><td></td>Compressore</tr><tr><td></td><td>LiverChip CN Bio innovazioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 Strumento con xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocco separatore magnetico portatile Millipore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima Plate Reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Avvitatori elettrici di precisione</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Alimentatore</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Air Equipment</td><td>Fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sistema di PCR in tempo reale Integra Vacuboy</td><td></td> INTEGRA ViiA 7 con blocco a 384 pozzetti ThermoFisher Scientific 4453536 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

"fegato-on-a-chip" colture di epatociti primari e cellule di kupffer per infezione da virus dell'epatite b

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Nonostante l'eccezionale infettività del virus dell'epatite B (HBV) in vivo, dove solo tre genomi virali possono comportare una cronicità di scimpanzé infettati sperimentalmente, più modelli in vitro richiedono diverse centinaia di migliaia di genomi virali per la cellula in al fine di avviare un infezione transitoria. Inoltre, 2D statici colture di epatociti umani primari (PHH) consentono solo studi di breve durata a causa della loro rapida dedifferenziazione. Qui, descriviamo culture di fegato-on-a-chip 3D di PHH, monocolture o in cocultures con altre cellule di fegato-residente parenchimale. Questi offrono un miglioramento significativo nello studio a lungo termine infezioni da HBV con risposte di host fisiologico delle cellule. Oltre a facilitare gli studi di efficacia del farmaco, analisi tossicologica e indagini sulla patogenesi, questi sistemi di cultura microfluidici consentono la valutazione delle terapie curative per l'infezione da HBV volti ad eliminare covalentemente chiuso, circolare (ccc) del DNA. Presentato il metodo descrive il set-up di monocolture PHH e PHH/Kupffer cellule co-culture, loro infezione con HBV purificato e l'analisi della risposta ospite. Questo metodo è particolarmente indicato per la valutazione degli effetti a lungo termine dell'infezione da HBV, combinazioni di trattamento e patogenesi.

Descriviamo una piattaforma semplice e versatile per la coltura a lungo termine delle cellule di Kupffer umane primarie e/o epatociti e loro infezione con HBV. Cellule umane primarie sono seminate su impalcature di polistirolo rivestite con collagene all'interno di un gruppo di piastra microfluidica, che continuamente perfuses le cellule con crescita medio (Figura 1a).
PHH, che sono solitamente solo stabile per un periodo di tempo limitato in sistemi di coltura convenzionale, può essere mantenuta in modo funzionale per lunghi periodi di tempo. Albumina umana, che è secreta dagli epatociti funzionali ed è considerato il migliore indicatore per la valutazione del metabolismo epatico, è stabile e altamente espressi da culture 3D fino al giorno 40 post-semina (Figura 2). Per cocultures, vitalità e funzionalità delle cellule di Kupffer possono essere valutate dalla secrezione di citochine specifiche (ad es., IL6 e TNF). Per misurare la produzione di citochine, l'uso di mezzi di rilevamento basato su acquisizione LPS-stimolazione di cocultures è raccomandato (Figura 3).
Le cellule formano microtissues epatica, di solito entro 3 giorni dalla semina del PHH, dimostrando Duttuli Biliari funzionale e polarizzazione cellulare completo (Figura 2). Oltre mantenendo il loro fisiologico metabolismo cellulare, queste culture diventano eccezionalmente suscettibili di infezione da HBV. HBV DNA e altri marcatori virali, a differenza di altri sistemi di coltura, diventano facilmente rilevabile da post-infezione giorno 2 (Figura 4). Oltre a secreti marcatori di infezione virale, impalcature degli epatociti contenenti possono essere estratto dalle colture e utilizzate per la rilevazione di immunofluorescenza di antigeni virali (ad es., HBsAg, HBcAg) (Figura 4). Dove culture dell'epatocita convenzionali richiedono l'inoculazione con almeno 500 HBV GE per cella e l'aggiunta di 2% DMSO e 4% PEG, minor come 0,05 HBV GE sono in grado di avviare l'infezione in 3-d culture senza il requisito di DMSO o PEG (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figura 1: set-up delle culture di fegato-on-a-chip 3-d. (un) questo è un layout schematico per l'assemblaggio della piastra di coltura al fine di garantire l'istituzione di microfluidica circolazione. (b) questo pannello mostra una vista ravvicinata dei pozzi di cultura, tra cui la carta da filtro, impalcatura e anello di ritegno. (c) questo pannello mostra il processo di equilibrazione piastra prima della semina le culture. I prossimi due pannelli mostrano il processo di semina per (d) dell'epatocita monocolture e cellulare dell'epatocita/Kupffer (e) cocultures. (f) questo pannello mostra i passaggi di lavaggio coinvolti nei cambiamenti medi. (g) questo pannello mostra l'assetto di infezione di HBV, compresa la rimozione dell'inoculo. S.M. = semina medio, M.M. = mezzo di manutenzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figura 2: microtessuti epatico formazione e dell'epatocita attuabilità. (un) questo pannello mostra le immagini di campo chiaro longitudinale delle monocolture 3D dell'epatocita dimostrando microtessuti formazione segue semina. (b) questo pannello mostra le immagini di immunofluorescenza delle culture per nuclei (blu) e albumina umana (verde). (c) questo pannello mostra longitudinale totale albumina, come pure per la cellula adeguando la produzione di albumina, durante 40 giorni delle monocolture dell'epatocita, come determinato da ELISA. I dati riportati sono la media ± SD Questa figura è adattata da Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figura 3: funzionalità di cellule di Kupffer in 3-d cocultures. Questi pannelli mostrano la secrezione di (un) IL6 e (b) TNFα in monocolture dell'epatocita e cellulare dell'epatocita/Kupffer cocultures 11 giorni post-semina in risposta ai LPS esogenicamente aggiunto al giorno 9 post semina, come determinato tramite umano magnetico Dosaggio di Luminex. Questa figura è adattata da Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figura 4: infezione da HBV nel fegato-on-a-chip culture. (un) questo pannello mostra la rilevazione di microscopia di immunofluorescenza di HBcAg (rosso), HBsAg (verde) e nuclei (blu) 10 giorni che seguono l'infezione delle colture con HBV. (b) questo pannello mostra la sensibilità delle colture all'infezione di HBV utilizzando diverse molteplicità di infezione, come determinato da una quantificazione del DNA di HBV nei sovranatante. (c) questo pannello mostra la quantificazione dell'accumulo longitudinale di HBV pgRNA riguardante il gene housekeeping RPS11. I dati riportati sono la media ± SD Questa figura è adattata da Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire una guida dettagliata per eseguire esperimenti di 3D "fegato-on-a-chip" infezione con virus dell'epatite B.

"Fegato-on-a-Chip" colture di epatociti primari e cellule di Kupffer per infezione da Virus dell'epatite B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle infezioni epatotropiche e nei campi delle malattie del fegato. Come il contributo delle popolazioni cellulari residenti nel fegato, alla patogenesi virale, alla cinetica longitudinale delle infezioni, ai meccanismi di replicazione virale, all'invasione immunitaria, in un sistema di modelli fisiologici e studi di test farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di ricapitolare un microambiente epatico.Che può essere mantenuto per lunghi periodi di tempo ed è naturalmente suscettibile all'infezione da epatite B a livelli fisiologici rilevanti. Questo è stato in precedenza un vincolo fondamentale nel campo dell'epatite B. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia o la diagnosi dell'infezione da HBV perché gli studi di test farmacologici possono essere eseguiti in una piattaforma fisiologica per durate prolungate.Ciò consente la valutazione dei trattamenti sequenziali dei farmaci insieme all'analisi dell'efficacia delle strategie di trattamento esistenti e nuove. Questo metodo può fornire comprensione nell'epatite B e può anche essere applicato ad altri studi di malattia, tra cui altre infezioni epatotrope, malattie del fegato o studi sul metabolismo dei farmaci. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché richiede attenzione a particolari dettagli per consentire il successo del mantenimento del tessuto epatico per lunghi periodi di tempo.E anche la familiarizzazione con gli strumenti e le attrezzature specializzate. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Compreso il montaggio delle piastre, nonché lo scongelamento e la semina delle cellule.Poiché i passaggi coinvolti nella coltura a lungo termine delle cellule derivate dal fegato sono impegnativi quando si utilizza un nuovo sistema di coltura. In primo luogo, accendere sia il compressore che la pompa per vuoto associata alla piattaforma di chip epatici. Procedere a un armadio per tubi di vetro per assemblare ed equilibrare le piastre.Posizionare una membrana sterile sulla base della piastra per iniziare a assemblare aseticamente le piastre microfluidiche. Assicurarsi che la membrana sterile poggia senza intoppi sui due perni della piastra di base. Quindi aggiungere la piastra superiore ben contenente.Aggiungere un coperchio sterile della piastra. E utilizzare una coppia di precisione automatizzata, impostata su 33 libbre. Utilizzo di una sequenza di serraggio a spirale per stringere le viti alla base della piastra.Utilizzando una coppia manuale, assicurarsi che tutte le viti siano serrate a 35 libbre. Successivamente, pre-riscaldare il mezzo di semina dell'epatocita fino a 37 gradi Celsius prima dell'adescamento. Posizionare la piastra completamente assemblata nella banchina di lavaggio.E assicurati che la piastra si agganci completamente. Aggiungere 400 microlitri di mezzo di semina epatocita sul lato del serbatoio di ogni pozzo per innescare la piastra. Successivamente, avviare il flusso verso l'alto per 3,5 minuti a un microlitro al secondo.Gli indicatori rossi sul lato della piastra indicheranno se la circolazione microfluidica funziona correttamente. Una volta che il mezzo è pompato sul lato di crescita cellulare della piastra, aggiungere altri 1,2 millilitri di mezzo di semina epatocita. Trasferire con cura la piastra nell'alloggiamento di entrata all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2.Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 16 ore. Successivamente, trasferire la piastra in un molo di lavaggio. Pipettare delicatamente su e giù per eliminare eventuali bolle.Utilizzando una forcep sterile, aggiungere una carta filtrante rotonda sterile ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un'impalcatura di attacco cella e un anello di fissaggio a ciascun pozzo. Utilizzare uno stantuffo sterile per spingere verso il basso ogni pozzo e bloccare gli anelli di contenimento e le impalcature in posizione.Quindi, aspira tutto il mezzo. E aggiungere delicatamente 400 microlitri di mezzo di semina epatocito pre-riscaldato sopra l'impalcatura. Avviare il flusso in direzione verso il basso a un microlitro al secondo per 3 minuti e mezzo.Aspirare tutto il mezzo pompato fuori dal lato del serbatoio della piastra. Aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di semina epatocita ad ogni bene. Quindi riportare la piastra sul dock per portare il volume totale per pozzo fino a 1,6 millilitri.In primo luogo, pre-riscaldare il mezzo di scongelamento dell'epatocita e il mezzo di semina degli epatociti fino a 37 gradi Celsius. Successivamente, scongelare una fiala di epatociti umani primari secondo le istruzioni del fornitore. In un armadio a tubo di vetro, rimospendare le cellule in un millilitro di mezzo di semina epatocita.Quindi posizionare le cellule rimorsi su ghiaccio. Utilizzando trypan blue, contare le celle per assicurarsi che la vitalità delle celle sia superiore al 90%Trasferire la piastra completamente assemblata sul banco di lavaggio. E aspirare tutto il mezzo dai pozzi.Recuperate le cellule dal ghiaccio e aggiungete 600.000 epatociti ad ogni pozzo in un volume di 500 microliter di mezzo di semina degli epatociti. Avviare il flusso verso il basso ad una portata di un microliter al secondo. Aggiungere 900 microlitri di mezzo di semina epatocita ad ogni pozzo per portare il volume totale in ciascuno a 1,6 millilitri.Trasferire la piastra all'alloggiamento di applicazione all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e con 5%CO2. Avviare il flusso verso il basso ad una portata di un microlitro al secondo per otto ore. Successivamente, invertire il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per otto ore.Quindi trasferire la piastra sul banco di lavaggio e aspirare tutto il mezzo dai pozzi. Aggiungere 400 microlitri di mezzo di manutenzione degli epatociti ad ogni pozzo. E avviare il flusso nella direzione verso il basso ad una portata di un microlitro al secondo per 3 minuti e mezzo.Successivamente, aspirare tutto il mezzo dal serbatoio e aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di manutenzione degli epatociti. Trasferire la piastra nell'alloggiamento di entrata all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 48 ore.Dopo 48 ore, lavare la piastra trasferendola al banco di lavaggio. Aspirare tutto il mezzo dai pozzi. E aggiungere 400 microlitri di mezzo di manutenzione.E avviare il flusso nella direzione verso il basso a un microlitro al secondo per 3,5 minuti. Quindi aspirare tutto il mezzo che appare nel lato del serbatoio dei pozzi. Aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di manutenzione degli epatociti.Quindi trasferire la piastra di nuovo alla docking station nell'incubatore umidificato. Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 48 ore. Sostituire il mezzo utilizzando questo processo di lavaggio e sostituzione ogni 48 ore.Gli epatociti umani primari sono solitamente stabili solo per un periodo di tempo limitato quando si utilizzano sistemi di coltura convenzionali. Tuttavia, utilizzando il protocollo qui descritto, possono essere mantenuti funzionalmente per lunghi periodi di tempo. L'albumina umana è secreta da epatociti funzionali ed è considerata il miglior marcatore per valutare la funzionalità epatica.L'albumina è vista come stabilmente e altamente espressa dalle culture 3D fino almeno al giorno 40 dopo il seeding. Per le co-colture, la funzionalità e la vitalità delle cellule di Kupffer vengono valutate misurando la secrezione di citochine specifiche. Come si vede qui, i livelli misurati di IL-6 e TNF alfa indicano che le cellule sono state mantenute funzionalmente e vitali.Oltre a mantenere il loro fisiologico metabolismo cellulare, queste colture sono diventate eccezionalmente suscettibili all'infezione da HBV. Il DNA HBV e altri marcatori virali sono facilmente rilevabili dal secondo giorno dopo l'infezione. Mentre le colture convenzionali richiedono l'inoculazione con almeno 500 equivalenti di genoma HBV integrati con DMSO e PEG, queste colture 3D sono infettate da appena 05 equivalenti di genoma non sommentati.Oltre ai marcatori secreti di infezione virale, da queste colture vengono recuperate impalcature contenenti epatociti. La microscopia ad immunofluorescenza rivela che queste impalcature contengono antigeni virali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere gentili quando si maneggiano gli epatociti prima della semina per evitare la morte cellulare.Inoltre, è essenziale assicurarsi che le piastre siano assemblate correttamente e che tutti i canali di flusso consentano una corretta circolazione dei supporti prima di seminare gli epatociti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza per rispondere a domande aggiuntive. Compresa la posizione e la frequenza delle cellule infette all'interno del tessuto.Lo stato fisiologico degli epatociti può anche essere valutato mediante colorazione per albumina o strutture epatiche tra cui la proteina di giunzione stretta ZO-1. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare l'infezione da epatite B e le risposte immunitarie in un sistema fisiologico modello 3D. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite B può essere pericoloso e precauzioni come la vaccinazione precedente, l'uso di DPI appropriati e lavorare secondo adeguate linee guida sulla biosicurezza dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Qui si descrive un virus dell'epatite B recentemente sviluppato (HBV) sistema reporter per monitorare le prime fasi del ciclo di vita HBV. Questo semplificata nel sistema vitro sarà di aiuto nella proiezione di agenti anti-HBV utilizzando una strategia ad alto rendimento.

Sviluppo di un virus System Reporter dell&#39;epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV) in nuove cellule 293T ingegnerizzate (293T-NE-3NRs, che esprime NTCP umana, HNF4, RXR e PPAR) e cellule epatiche tradizionali (HepG2-NE, che esprimono NTCP umani).

Modellazione dell'infezione da virus dell'epatite B nelle cellule non epatiche 293T-NE-3NRs

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l'affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L'efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).

Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Qui, descriviamo una piattaforma che consente l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Il flusso di lavoro spazia dalla generazione di sferoidi da cellule epatiche primarie al trapianto nell'occhio di topo e all'imaging in vivo a risoluzione cellulare mediante microscopia confocale.

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Scopri il metodo "liver-on-a-chip" per colture di epatociti primari e cellule di Kupffer. Questo sistema microfluidico permette di studiare l'infezione da virus dell'epatite B in un microambiente epatico fisiologico per periodi prolungati.

"Fegato-on-a-Chip" colture di epatociti primari e cellule di Kupffer per infezione da Virus dell'epatite B

Esplora altri video