Name: Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri l'imaging del calcio nelle cellule muscolari e di Schwann alla giunzione neuromuscolare del topo. Questo metodo permette di visualizzare in tempo reale la segnalazione cellulare durante la stimolazione nervosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto con fondi del National Institutes of Health (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e dal centro nazionale per le risorse di ricerca 5P20RR018751 e il National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (per G.W.H.).

Zootecnia e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente alla istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e il IACUC presso l'Università del Nevada.
1. preparazione dei diaframmi e nervi frenici da topi transgenici
<ol><li>Acquisto di topi transgenici e iniettori del oligonucleotide di genotipo questi topi. Nota: Gli iniettori sono elencati nella pagina "Informazioni" per ciascuno di questi topi.<ol>
<li>Allevare un mouse di 3-6 mesi esprimendo una copia dell'allele appropriato transgenici/knock-in Cre-driver e zero copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale con un secondo mouse della stessa età che esprime una o due copie del condizionale GCaMP3 / 6 allele e zero copie dell'allele Cre-driver.</li>
		<li>Genotipo i cuccioli e mark quelli che hanno condizionato GCaMP3/6 alleli e Cre — questi sarà d'ora in poi chiamati topi transgenici doppio (ad es., Myf5-Cre, GCaMP3 condizionale)6. Nota: In questo modo, tutti i dati deriverà da topi che esprimono una copia del condizionale GCaMP3/6 alleli e Cre. Ciò è particolarmente importante quando l'aggiunta di queste croci in altri topi mutanti (ad es., Ko).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando i topi transgenici doppio sono di età adeguata (ad es., postnatale giorno 0 o 5 [P0 o P5] o adulto), eutanasia i topi di decapitare loro con le forbici (per topi più giovane di P10) o inserendoli in una camera di inalazione isoflurane — quando sono non è più reattivo a pizzicare la coda con un paio di pinze, sono pronti per il sacrificio.</li>
	<li>Sacrificare l'animale per decapitazione con un paio di forbici.</li>
	<li>Trasversalmente sezione attraverso l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore ed i polmoni con le forbici iridectomy.</li>
	<li>Via sezionare il fegato, il cuore e i polmoni, facendo attenzione a mantenere una lunghezza del nervo frenico che è sufficientemente lungo per essere disegnata in un elettrodo di aspirazione (cioè, 1-2 cm). Nota: Il nervo frenico sinistro può essere identificato come un pezzo di tessuto che entra la porzione mediale del diaframma sinistro bianco. Esso non deve essere tagliato quando si rimuovono i polmoni. Il nervo frenico di destra viene eseguito all'interno di un pezzo della fascia che inoltre contiene la vena cava superiore ed è più sottile e più bianca di vena cava. Insieme, entrambi riescono a penetrare il diaframma mediale di destra.</li>
	<li>Più ulteriormente rimuovere la gabbia toracica e la colonna vertebrale, fatta eccezione per la cresta sottile intorno al diaframma.</li>
	<li>Posizionare il diaframma e il campione del nervo frenico in un tubo di microfuge con la soluzione di Krebs-soneria con 594-αBTX di 1 µ g/mL per 10 min al buio. Nota: Questa concentrazione di 594-αBTX etichette recettori ACh (AChR) senza bloccare la loro funzione (osservazione personale).</li>
</ol>2. stimolazione e la registrazione dei potenziali d'azione muscolare
<ol><li>Utilizzando minutien perni, immobilizzare il diaframma da appuntare e su un piatto di 6 cm rivestiti con silicone gel dielettrico e pieno di ~ 8 mL di soluzione di Krebs-soneria ossigenato e posizionatelo sopra il tavolino del microscopio. Irrorare il diaframma con più soluzione di Krebs-soneria (8 mL/min) per 30 min. Nota: Questo risciacqua il 594-αBTX non associato, nonché equilibra il tessuto dopo la dissezione.</li>
	<li>Rendere un elettrodo di aspirazione secondo i metodi stabiliti7.<ol>
<li>Con un ingrandimento 4x, utilizzando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo aspirazione sopra il nervo frenico sinistro e aspirare tirando fuori la canna di una siringa 5 mL collegata al tubo che è collegato all'elettrodo di aspirazione. Nota: Quando correttamente disegnato nell'elettrodo di aspirazione, il nervo frenico è teso. Accendere lo stimolatore e stimolare il frenico nervo lanciando il manuale passare 1x.</li>
		<li>Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione 1-Hz esaminando visivamente con illuminazione a campo chiaro. In caso contrario, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso agonistica, che può essere verificato da un esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non è visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di trarre nuovo applicando l'aspirazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disattivare la perfusione e aggiungere la miosina del muscolo-specifico inibitore BHC6 o la tensione-gated del sodio canale antagonista µ-conotossina8 ad una concentrazione finale di 100 µM.<ol>
<li>Per rendere 100 µM BHC, 4 µ l di stock di 200 mM in DMSO e prediluire esso in 1 mL di soluzione di Krebs-soneria.</li>
		<li>Rimuovere 1 mL di soluzione di Krebs-soneria dal piatto.</li>
		<li>Aggiungere il BHC prediluito, al piatto. Nota: Questa prediluizione consente di impedire l'induzione di DMSO non diluito di una risposta fluorescente non transitorio in cellule che esprimono GCaMP3.</li>
		<li>Attendere 30 min e quindi attivare la perfusione di soluzione di Krebs-soneria fresca per un altro 20-30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'elettrodo di registrazione.<ol>
<li>Indossando guanti, inserire un vetro di borosilicato filamentato con un diametro esterno (OD) di 1 mm e un diametro interno (ID) di 0,4 mm un estrattore micropipetta e serrare le manopole per bloccarlo in posizione. Chiudere lo sportello di estrattore.</li>
		<li>Utilizzando un estrattore P-97, programmare la seguente impostazione: calore a 900, pull a 120, velocità a 75, tempo a 250, pressione a 500 e senza ulteriori cicli. Nota: Resistance (R) è misurata utilizzando il software di controllo dell'amplificatore: il software di acquisizione dati conferma la resistenza risolvendo la formula V = IR Il controller software passa una corrente nota (I) (in genere 1 nA) attraverso l'elettrodo e misura la variazione di tensione (V), consentendoci così di risolvere per R.</li>
		<li>Per membrane embrionali, assicurarsi che la resistenza sia vicino a 60 MΩ e per i più anziani diaframmi, 10-20 MΩ. Caricare l'elettrodo di registrazione con 3M KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ingrandimento 10x, abbassare l'elettrodo nel muscolo, utilizzando un micromanipolatore secondo sul lato opposto del palco come un elettrodo stimolante.</li>
	<li>Utilizzando software di acquisizione dati elettrofisiologici, attendere che il potenziale di membrana di riposo cambia da 0 a -65 mV o qui sotto.</li>
	<li>Stimolare a 1 Hz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che esibisce un modesto superamento (potenziale che si erge sopra 0 mV quando inizia il a -65 mV o qui sotto). Non confondere artefatto di stimolazione con un potenziale di azione. Nota: Potenziali sono significativamente più lunghi durata (~ 5 ms) di manufatti di stimolazione.</li>
</ol>3. formazione immagine di fluorescenza del campione
<ol><li>20 ingrandimenti, individuare il gruppo della piastra laterale al centro del muscolo cercando NMJs 594-αBTX – etichettato sotto eccitazione luce giallo/verde (550 nm). Passare per l'eccitazione di luce blu (470 nm) a immagine Ca2 + risposte nel muscolo, motoneurone o cellule di Schwann.</li>
	<li>Se lo si desidera, impostare la barra di divisione di immagine con filtri passa-banda e un filtro dicroico tagliente per l'imaging di doppio-lunghezza d'onda.</li>
	<li>Al fine di calcolare la fluorescenza massima (Fmax) esposta dal tessuto GCaMP3/6-esprimendo, aggiungere 12 µ l 3 M di cloruro di potassio (KCl) per le preparazioni di diaframma6.<ol>
<li>Esperimenti con la barra della luminosità sulla barra di tabella di ricerca impostato al 110% del livello al quale il tessuto GCaMP3/6-esprimendo esibisce saturazione a 20 ingrandimenti, senza binning in risposta al KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registra a 20 fotogrammi al secondo per non perdere alcun evento veloce.</li>
	<li>Stimolare con s 1-45 di 20-40 Hz di stimolazione del nervo fornendo un treno di impulsi utilizzando l'elettrodo aspirazione o aggiungere agonisti farmacologici da bagno applicazione o mediante perfusione e raccogliere fluorescente Ca2 + risposte dinamiche nel sottotipo di una cella insieme al segnale NMJ statico 594-αBTX. Nota: Se tessuto-specifica rossi o da' GECI o GEVI topi diventano disponibili per l'utilizzo alle NMJ, può essere utilizzati per raccogliere due segnali dinamici che riflettono due distinti elementi cellulari alle NMJ.</li>
	<li>Quando gli esperimenti elettrofisiologici o di imaging sono finiti perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, irrorare d'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua 2 x - 3 x attraverso l'elettrodo aspirazione per garantire che i sali non accumulano.</li>
</ol>4. esportazione e analisi dei dati di una mappa con deviazione Standard di intensità di fluorescenza (SDiu16)
<ol><li>Registrare sequenze di immagini registrate come pile TIFF 16 bit e caricarli nel sistema di analisi dati di imaging desiderato per l'analisi.</li>
	<li>Nel menu file del software 8D selezionare la serie di immagini di interesse e fare clic per caricare.<ol>
<li>Una volta caricato il video, la scansione attraverso il tempo per identificare una sezione che non ha alcuna attività cellulare fluorescente. Nota: Questa regione verrà essere utilizzata per creare un esempio di sfondo.</li>
		<li>Tenere premuto MAIUSC e fare clic per disegnare un'area di casella di interesse (ROI) nella zona identificata come l'area del campione di sfondo.</li>
		<li>Dopo aver creato la casella, premere la barra spaziatrice per generare un grafico di cambiamento di attività di sfondo.</li>
		<li>Pulsante destro del mouse la traccia e selezionare l'opzione assortiti per presentare l'opzione per Eseguire il Dump di ROI come testo per rendere la traccia come file di testo delle coordinate xy.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tornando al video di interesse, rieseguire la scansione per identificare l'area di tempo dove è in corso l'attività di interesse.<ol>
<li>Utilizzare il pulsante centrale del mouse, selezionare questa regione di tempo nella casella gialla ora.</li>
		<li>Fare clic destro sul video e selezionare Stack OPS e poi Stat mappa opzione 5. Nota: Questo genererà una mappa di deviazione standard (SD mappa) nella finestra di sinistra.</li>
		<li>Clicca sulla mappa SD e quindi premere il ] tasto 19 x per applicare la mappa di calore del colore appropriato.</li>
		<li>Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM caricare e salvare, che presenterà l'opzione salvare stm come tiff per salvare la mappa di SD.</li>
		<li>Poi, premere il [ chiave 19 x per tornare alla mappa di colore in scala di grigi.</li>
		<li>Premere C e poi D per richiamare strumenti di mappatura di densità. Utilizzando il pulsante sinistro del mouse e il pulsante del mouse di centro, regolare la soglia per includere tutte le attività fluorescente mostrata nella mappa SD.</li>
		<li>Premere C per chiudere gli strumenti di densità, mantenendo le impostazioni di soglia.</li>
		<li>Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM particelle e quindi Trovare PTCLS. Nota: Questo identificherà singole cellule che esprimono attività fluorescente.</li>
		<li>Pulsante destro del mouse la mappa SD ancora una volta e selezionare Creare particelle ROIs. Nota: Questo a sovrapporre le celle selezionate il video originale di interesse.</li>
		<li>Tenendo premuto MAIUSC, fare clic destro su uno qualsiasi della particella ora identificato ROIs il video originale.</li>
		<li>Selezionare indicatore ROI e misura Int in ROI. Nota: Questo genererà trame attività fluorescente individuale per ogni ROI identificati nel video di interesse. Questi può essere salvati facendo clic destro su uno qualsiasi di questi e selezionando assortiti, seguiti da Dump ROI come testo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per dettagliate logica alla base di queste operazioni, vedere il file di codice sorgente9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui forniamo alcuni esempi di Ca2 + risposte in celle specifiche in tessuto neuromuscolare intatto facendo uso dei topi che esprimono GECI di misura. Per eseguire correttamente questi esperimenti, è imperativo di non ferire il nervo frenico durante la dissezione. Per realizzare l'immagine Ca2 + risposte in cellule di Schwann a potenza alto o basso (cioè, X 20 o 60 X), è necessario utilizzare BHC o µ-conotossina al blocco movimento. Per l'imaging di bassa potenza di Ca2 + risposte...

La giunzione neuromuscolare, come tutte le sinapsi, è composto da tre elementi: un terminale presinaptico derivato da un neurone, una cellula postsynaptic neurone/effettrici, e un perisinaptici glial cell1,2. Mentre gli aspetti fondamentali della trasmissione sinaptica in primo luogo sono stati dimostrati a questa sinapsi3, molti aspetti di questo processo rimangano sconosciuti, in parte a causa dell'espressione delle molecole stesse di distinti elementi cellulari di questa sinapsi. Ad esempio, ricevitori per sia l'acetilcolina (ACh) e del purina adenina nucleotide ATP che co-sono rilasciati dai neuroni di motore alle NMJ vertebrati, sono espresse da muscolo, cellule di Schwann e neuroni di motore, così che complica l'interpretazione di qualsiasi funzionale effetto esercitato da queste sostanze (ad es., rilascio del trasmettitore o risposta, generazione di forza muscolare)4. Inoltre, sebbene i componenti tripartiti della giunzione neuromuscolare sono semplici rispetto a, per esempio, i neuroni nel sistema nervoso centrale che spesso esibiscono più input sinaptico, se motoneuroni, cellule muscolari o cellule di Schwann variano in risposta a stimoli basato il loro intrinseca eterogeneità (ad es., derivazione embrionale, sottotipo di fibra, morfologia) è poco chiaro. Al fine di affrontare ciascuno di questi problemi, sarebbe vantaggioso per monitorare simultaneamente la risposta di molte cellule all'interno di un elemento sinaptica, così come traccia, allo stesso tempo, tale risposta in uno degli altri elementi separati. Le strategie convenzionali utilizzando coloranti chimici per misurare la segnalazione del calcio non possono raggiungere questi due obiettivi, perché applicati a vasca di tintura è occupata da più tipi di cella dopo l'applicazione del tessuto e tintura intracellulare caricata può essere utilizzata solo per visualizzare coorti di individui o piccoli delle cellule. Qui, utilizzando topi transgenici esprimenti GECIs progettato per misurare la segnalazione del calcio cellula-specifico, insieme a specific Imaging, imaging e software strumenti5, dimostriamo il primo di questi due obiettivi globali e discutere come l'aggiunta di nuovi strumenti transgenici aiuterebbe a raggiungere il secondo. Questa tecnica sarà utile per chiunque sia interessato a rilevamento dinamica del calcio o altri cellulari osservabile di eventi di segnalazione attraverso sensori ottici gene-codificato in più popolazioni di cellule allo stesso tempo.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre topi</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>Guida l'espressione delle cellule muscolari già a E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre topi</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>Guida l'espressione in tutti&nbsp; Cellule di Schwann a E13 ma non P209</td></tr><tr><td>Sox10-Cre topi</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>Guida l'espressione delle cellule di Schwann in età avanzata</td></tr><tr><td>Topi GCaMP3 condizionali</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Esprime GCaMP3 in modo cellulo-specifico</td></tr><tr><td>Topi GCaMP6f condizionale</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>Esprime GCaMP6f in modo</td></tr> <tr><td>cellulo-specificoBHC (3-(N-butiletanimidoil)-4-idrossi-2H-cromon-2-one)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Blocca la miosina del muscolo scheletrico ma non la neurotrasmissione6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Etichetta i cluster del recettore dell'acetilcolina a NMJ</td></tr><tr><td>&micro;-conotossina GIIIb</td><td>Peptidi Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Blocca Nav1.4 canale del sodio voltaggio-dipendente8</td></tr><tr><td>Gel dielettrico siliconico; alias Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel .9KG&nbsp;</td><td>Consente l'immobilizzazione del diaframma tramite perni minuziosi</td></tr><tr><td>Perni minuziosi (diametro 0,1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Immobilizza il diaframma su gel dielettrico in silicone</td></tr><tr><td>Microscopio verticale Eclipse FN1</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Consente la stadiazione e l'osservazione del campione</td></tr><tr><td>Piattaforma per microscopio fisso di base con traslatore manuale per microscopio XY&nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Consente il movimento del campione</td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Contiene elettrodi di registrazione e stimolazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplificatore a microelettrodi&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Consente la registrazione elettrofisiologica intracellulare con elettrodi affilati</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati a basso rumore con microelettrodo</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Consente l'acquisizione di dati elettrofisiologici</td></tr><tr><td>Sistema di analisi dei dati dei microelettrodi</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Esegue l'analisi dei dati elettrofisiologici</td></tr><tr><td>Stimolatore a onda quadra</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>Stimola il nervo ad eccitare il muscolo</td></tr><tr><td>Unità di isolamento dello stimolo</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td><td>Riduce gli artefatti di stimolazione</td></tr><tr><td>Filamenti borosilicati, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,5 mm&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Impala, e registra i potenziali muscolari evocati dai nervi</td></tr>, <tr><td>filamenti borosilicati, diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 1,17 mm.</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Allungato e utilizzato per elettrodo di aspirazione</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp;</td><td>Estrae e prepara gli elettrodi di registrazione</td></tr><tr><td>1200x1200 pixel, fotocamera cMOS retroilluminata&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Telecamera sensibile che consente immagini ad alta risoluzione e ad alta velocità</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Fornisce l'illuminazione dai LED per l'osservazione della fluorescenza</td></tr><tr><td>&nbsp; Obiettivi fluorescenti ad immersione in acqua corretti all'infinito, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Fornisce lunghe distanze di lavoro per la visualizzazione del campione</td></tr><tr><td>Illuminatore a fibre ottiche con lampada alogena</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Fornisce illuminazione per l'osservazione in campo chiaro</td></tr><tr><td>W-View Gemini Image Splitter&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Proietta 1 coppia di immagini a doppia lunghezza d'onda separate da un dicroico a una singola fotocamera</td></tr><tr><td>Filtri passa-banda a banda singola&nbsp; (512/25-25 e 630/92-25)&nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Consente l'imaging a doppia banda</td></tr><tr><td>560 nm Splitter dicroico a bordo singolo</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Specchio dicroico che separa i fasci di luce per consentire l'imaging a doppia lunghezza d'onda</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati di imaging</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Consente l'acquisizione dei dati</td></tr> di <tr><td>imaging Modulo di controllo della lunghezza d'onda</td><td>Modulo</td><td>MQS41220</td><td>Nikon per i dati di imaging acqusiition</td></tr><tr><td>Modulo hardware splitter di emissione&nbsp;</td><td>Modulo MQS41410 Nikon</td><td>per l'acquisizione dei dati di imaging</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di analisi dei dati di imaging</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fiji</td><td>Consente l'analisi dell'intensità della fluorescenza e di altri dati di imaging</td></tr></tbody></table>

ex vivo formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del mouse cellula-specifico calcio

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

L'attività elettrica delle cellule nei tessuti può essere monitorata da tecniche elettrofisiologiche, ma questi sono solitamente limitati all'analisi delle singole celle. Poiché un aumento di calcio intracellulare (Ca2 +) nel citosol si verifica spesso a causa dell'attività elettrica, o in risposta ad una miriade di altri stimoli, questo processo può essere monitorato dall'imaging delle cellule caricati con fluorescente calcio sensibili coloranti.  Tuttavia, è difficile per questa risposta in un tipo di cella singola all'interno di intero tessuto di immagine perché questi coloranti sono presi da tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto. Al contrario, codificato geneticamente calcio indicatori (GECIs) possono essere espresso da un tipo di cella singola e reagiscono in risposta ad un aumento di Ca intracellulare2 +, permettendo così l'imaging del Ca2 + segnalazione in intere popolazioni di tipi di cellule singole. Qui, applichiamo l'uso di GECIs GCaMP3/6 alla giunzione neuromuscolare del mouse, un tripartito sinapsi tra i neuroni di motore, muscolo scheletrico e terminal/perisinaptici in cellule di Schwann. Dimostriamo l'utilità di questa tecnica nelle preparazioni di tessuto classico ex vivo . Utilizzando un separatore ottico, eseguiamo imaging di doppio-lunghezza d'onda di Ca2 + segnali dinamici e un'etichetta statica della giunzione neuromuscolare (NMJ) in un approccio che può essere facilmente adattato per monitorare due cellula-specifico GECI o tensione codificato geneticamente indicatori (GEVI) contemporaneamente. Infine, si discutono la routine utilizzate per acquisire mappe spaziali di intensità di fluorescenza. Insieme, queste tecniche ottiche, transgeniche e analitiche possono essere impiegate per studiare l'attività biologica delle sottopopolazioni distinte delle cellule alle NMJ in un'ampia varietà di contesti.

Diversi esempi di cambiamenti di intensità di fluorescenza, mediate da un aumento di Ca intracellulare2 + all'interno di tipi di cella definita della giunzione neuromuscolare, dimostrano l'utilità di questo approccio. Questi risultati sono presentati come mappe di intensità di fluorescenza spaziale, che forniscono la posizione delle cellule risponde, così come l'intensità delle loro risposte, consentendo in tal modo la valutazione di quante cellule rispondono e quanto ogni cell...

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuromuscolare, come il ruolo della segnalazione del calcio nei muscoli o nelle cellule di Schwann in risposta alla stimolazione nervosa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può immaginare l'attivazione di specifici tipi di cellule in risposta alla stimolazione nervosa. Per iniziare, ottenere topi transgenici e genotipi come descritto nel protocollo di testo.Dopo l'eutanasia, si seziona trasversalmente l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore e i polmoni con forbici per l'iridectomia. Sezionare il fegato, il cuore e i polmoni. Fare attenzione a mantenere una lunghezza del nervo phrenic sufficientemente lunga da essere attratta in un elettrodo di aspirazione.Rimuovere ulteriormente la gabbia toracica e la colonna vertebrale, ad eccezione della sottile cresta attorno al diaframma. Posizionare il diaframma e il campione di nervo phrenico in un tubo di microfugo con soluzione di Krebs-Ringer contenente un microgrammo per millilitro di bungarotossine alfa etichettate fluorescentmente. Lasciare incubare il campione nella soluzione per 10 minuti al buio.L'uso di perni di minuzia immobilizza il diaframma fissarlo su un piatto di sei centimetri rivestito con gel dielettrico in silicone e riempito con circa otto millilitri di soluzione Krebs-Ringer ossigenata. Posizionare il piatto sul palco del microscopio. Quindi, perfondi il diaframma con più soluzione Krebs-Ringer a otto millilitri al minuto per 30 minuti.A quattro volte l'ingrandimento, usando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo di aspirazione sul nervo phrenico sinistro. Applicare l'aspirazione estraendo la canna di una siringa da cinque millilitri collegata al tubo collegato all'elettrodo di aspirazione. Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione di un hertz esaminandolo visivamente con l'illuminazione Brightfield.In caso meno, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso supramaximale che può essere verificato mediante esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di disegnarlo di nuovo applicando l'aspirazione. Ora, spegnere la perfusione per aggiungere l'inibitore della miosina specifico del muscolo BHC o la mu-conotossina antagonista del canale del sodio gated di tensione.Preparare la pre-diluizione BHC pipettando quattro microlitri di BHC da 200 millimolari in DMSO in un millilitro di soluzione Krebs-Ringer. Rimuovere un millilitro della soluzione Krebs-Ringer dal piatto. Quindi aggiungere il BHC pre-diluito al piatto.Dopo 30 minuti, accendere la perfusione della fresca soluzione Krebs-Ringer per altri 20-30 minuti. Indossando guanti, preparare l'elettrodo di registrazione posizionando un vetro filamentoso borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,4 millimetri in un estrattore di micropipette. Stringere i quadranti per bloccarlo in posizione e chiudere la porta dell'estrattore.Quindi programmare l'estrattore come descritto nel protocollo di testo. Per i diaframmi embrionali, misurare la resistenza utilizzando i controlli software dell'amplificatore. Assicurarsi che la resistenza sia vicina a 60 megaohm e per i diaframmi più vecchi, da 10 a 20 megaohm.Ora, caricare l'elettrodo di registrazione con tre cloruri molari di potassio. A 10 volte l'ingrandimento, abbassare l'elettrodo nel muscolo usando un secondo micromanipolatore sul lato opposto dello stadio come elettrodo stimolante. Utilizzando il software di acquisizione dati elettrofisiologici attendere che il potenziale della membrana a riposo cambi da zero a meno 65 millivolt o inferiori.Stimolare in un unico hertz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che mostra un modesto superamento. Non confondere l'artefatto di stimolazione con un potenziale d'azione. A 20 volte l'ingrandimento individua la banda della piastra finale al centro del muscolo cercando giunzioni neuromuscolari alfa bungarotossine etichettate fluorescentmente sotto eccitazione a luce gialla verde.Passare all'eccitazione della luce blu per immaginire le risposte di calcio nelle cellule muscolari, motoneuroni o Schwann. In questo esempio GCaMP tre è espresso nelle cellule muscolari. Se lo si desidera, impostare lo splitter dell'immagine con filtri passa banda e un filtro dicroico a bordo singolo per l'imaging a doppia lunghezza d'onda.Eseguire esperimenti con la barra di luminosità sulla barra della tabella di ricerca impostata sul 110% del livello al quale l'indicatore di calcio codificato geneticamente che esprime il tessuto mostra saturazione a 20 volte l'ingrandimento senza binning in risposta al cloruro di potassio. Registra a 20 fotogrammi al secondo in modo da non perdere eventi veloci. Stimolare con uno o 45 secondi da 20 a 40 hertz di stimolazione nervosa fornendo un treno di impulsi utilizzando un elettrodo di aspirazione e raccogliere risposte dinamiche di calcio fluorescente in un sottotipo cellulare insieme al segnale di giunzione neuromuscolare alfa bungarotoxina fluorescente statico.Gli agonisti farmacologici possono anche essere aggiunti per applicazione del bagno o per perfusione e le risposte dinamiche del calcio fluorescente possono essere raccolte allo stesso modo. Al termine degli esperimenti di imaging o elettrofisiologici perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, perfondere l'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua da due a tre volte attraverso l'elettrodo di aspirazione per garantire che i sali non si accumulino. Una mappa spaziale delle risposte del calcio cellulare di Schwann alla stimolazione nervosa phrenica di un diaframma del topo Wnt one GCaMP al settimo giorno postnatale mostra una restrizione alle cellule terminali parasynattiche di Schwann alla giunzione neuromuscolare.Lo stesso diaframma è stato immaginato dopo l'etichettatura con alfa bungarotoxina etichettata fluorescentmente, che si lega per consentire i recettori dell'acetilcolina della giunzione neuromuscolare. Lo stesso diaframma è stato anche immaginato sotto l'illuminazione brightfield per guidare un elettrodo di registrazione verso la regione post-sinaptica del muscolo dalla giunzione neuromuscolare. Qui è mostrata la demarcazione spaziale di cellule codificate a colori o regioni di interesse prese per l'analisi dei singoli transitori di calcio.La mappa spaziale delle risposte di calcio delle cellule muscolari di un mth 5 GCaMP tre diaframma del topo a P quattro alla stimolazione nervosa phrenic in presenza dell'inibitore della miosina BHC mostra una risposta in tutta la regione di tutte le cellule muscolari del diaframma. Al contrario, la stimolazione dello stesso diaframma in presenza di mu-conotossina causa una risposta al calcio limitata spazialmente nella regione mediale di tutte le cellule muscolari del diaframma che corrisponde all'ammasso di cellule finali arricchite del gruppo del recettore dell'acetilcolina. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come l'immunoirochimica o l'immunoblotting al fine di rispondere a domande aggiuntive come, qual è il profilo molecolare delle cellule identificate dall'elettrofisiologia o dall'imaging del calcio?Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte della popolazione delle cellule di Schwann e delle cellule muscolari alla stimolazione nervosa nei normali topi neonatali. Può anche essere applicato allo studio di topi più anziani o allo studio di topi che esprimono proteine associate alla malattia neuromuscolare.

ex-vivo-imaging-cell-specific-calcium-signaling-at-tripartite-synapse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Fonte: Heredia, D. J., et. Al. Imaging ex vivo della segnalazione del calcio cellulo-specifica alla sinapsi tripartita del diaframma del topo. J. Vis. Exp. (2018) Questo video mostra l'imaging a fluorescenza della dinamica del calcio alle giunzioni neuromuscolari (NMJ) in un topo transgenico che esprime indicatori di calcio geneticamente codificati. Un NJM è identificato da recettori dell'acetilcolina marcati in fluorescenza nel diaframma con il nervo frenico. Uno splitter di immagini viene...

Imaging a fluorescenza della dinamica del calcio nelle giunzioni neuromuscolari nel diaframma di un topo transgenico

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli radicali dorsali intatti. J. Vis. Exp. (2023). Il video mostra una tecnica di imaging del calcio in vivo per monitorare l'attività neuronale nei gangli della radice dorsale (DRG) di un topo transgenico. I neuroni DRG esprimono un indicatore di calcio che aumenta l'intensità della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Gli stimoli meccanici o termici applicati a una...

Imaging del calcio in vivo di insiemi neuronali nei gangli della radice dorsale intatti di un topo

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Il presente protocollo delinea l'imaging del calcio in vivo per misurare le risposte di insiemi di neuroni DRG lombari-6 a stimoli somatici e viscerali. Confronti approfonditi possono essere effettuati tra i neuroni che rispondono a diversi stimoli. Questo protocollo è prezioso per studiare i meccanismi del dolore viscerale e della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

Scopri l'imaging del calcio nelle cellule muscolari e di Schwann alla giunzione neuromuscolare del topo. Questo metodo permette di visualizzare in tempo reale la segnalazione cellulare durante la stimolazione nervosa.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Esplora altri video