La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle risposte immunitarie ai patogeni presenti nell'aria sulla dinamica delle interazioni delle cellule immunitarie durante le infezioni respiratorie. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di ottenere immagini 4D luminose e stabili dell'epitelio tracheale durante la semplice chirurgia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra neutrofili e cellule litiche durante l'infezione influenzale, può anche essere applicato allo studio di diverse cellule immunitarie o di agenti patogeni presenti nell'aria.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a mantenere un intervento chirurgico stabile e minimamente infiammato. Inoltre, l'analisi delle immagini può essere complicata a causa della presenza di difetti cardiaci. Per l'infezione influenzale intranasale, posizionare un topo CD11c-YFP anestetizzato di sei-otto settimane in posizione supina e confermare la sedazione profonda per mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.

Posizionando la pipetta vicino alla narice sinistra, erogare piccole goccioline nella cavità nasale a circa 20 secondi di distanza, fino a quando il topo non ha inalato l'intero volume di 15 microlitri di inoculo PR8. Dopo due-cinque minuti, erogare 15 microlitri di virus nella narice destra allo stesso modo. Quando tutto l'inoculo è stato somministrato, verificare che il topo respiri normalmente e porre l'animale nella sua gabbia in decubito laterale con monitoraggio fino al completo recupero.

Tre giorni dopo l'infezione, rimuovere sia i femori che le tibie da un topo transgenico che esprime CFP e pulire delicatamente le ossa con una pinza. Tagliare l'epifisi ossea e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26 per lavare il midollo osseo da ciascun osso con PBS freddo sterile in una provetta da 50 millilitri su ghiaccio. Quando tutto il midollo osseo è stato prelevato, aspirare più volte il midollo attraverso la punta dell'ago e filtrare la sospensione cellulare dissociata attraverso un colino da 40 micrometri.

Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere il pellet in due millilitri di PBS freddo. Successivamente, sovrapporre con cura due millilitri di ciascuno dei tre gradienti di Percoll in un tubo da 15 millilitri dal più al meno concentrato. Quindi aggiungere con cautela due millilitri di sospensione di cellule del midollo osseo sullo strato superiore del gradiente per la separazione centrifuga del gradiente di densità.

Al termine della centrifugazione, rimuovere con cautela la banda dall'interfaccia del gradiente del 64 e 72% e lavare i neutrofili in PBS freddo. Quindi risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS fresco su ghiaccio per il conteggio e risospendere le cellule a una concentrazione di PBS da cinque volte 10 a 10 per 100 microlitri di PBS per iniezione endovenosa negli animali riceventi CD11c-YFP inoculati. 12 ore dopo il trasferimento adottivo, posizionare l'animale ricevente anestetizzato su una tavola chirurgica personalizzata su una superficie riscaldata a 37 gradi Celsius e rimuovere i peli dal collo del topo mediante rasatura e crema depilatoria.

Posizionare il mouse sopra il mouse di plastica posizionale con la testa all'esterno della posizione ad un angolo che faciliti l'intubazione della trachea e fissare gli arti anteriori, le zampe e la coda con nastro chirurgico. Applicare un unguento sugli occhi e disinfettare la pelle esposta. Successivamente, praticare un'incisione di un centimetro lungo l'asse mediale del collo tra la parte superiore del torace e la linea che passa attraverso il punto inferiore della mandibola e spostare lateralmente le chiazze cutanee e le ghiandole salivari per visualizzare la trachea.

Usa una pinza per sezionare con cura la trachea, intuba il topo con un catetere e avvia immediatamente la ventilazione artificiale. Utilizzare un gancio chirurgico collegato a un'asta sulla tavola chirurgica per fissare l'altezza e l'orientamento del catetere ed esporre la trachea fino al mento. Circondare la trachea con vaselina e idratare la trachea con alcune gocce di PBS caldo.

Quindi incollare un vetrino coprioggetti su un supporto di metallo e avvitare il supporto al traslatore XYZ per consentire il posizionamento del vetrino coprioggetti sopra la preparazione chirurgica. È molto importante esporre ed estendere correttamente la trachea e premerla leggermente con il vetrino coprioggetti, per mantenere il tessuto stabile abbastanza a lungo per l'imaging. Per l'imaging time-lapse in vivo, posizionare la tavola chirurgica all'interno della camera di incubazione a 37 gradi Celsius del microscopio a due fotoni e aggiungere una goccia d'acqua al vetrino coprioggetti.

Dopo aver centrato la configurazione e messo a fuoco il tessuto tracheale, impostare la frequenza di scansione su 800 hertz con 520 x 520 pixel, un campo visivo di 440 x 440 micrometri e una media lineare di uno. Impostare i laser in titanio zaffiro sulla lunghezza d'onda e sulla percentuale di potenza appropriate in base ai fluorofori di eccitazione e impostare la modalità di acquisizione 3D e time-lapse con eccitazione simultanea. Quindi definisci un intervallo di 50 micrometri lungo l'asse z con una dimensione del passo di tre micrometri e registra le immagini ogni 30 secondi per 30 minuti.

Seguendo questa configurazione sperimentale, le immagini 4D stabili possono essere acquisite in situ all'interno della trachea infetta per un periodo di tracciamento di 30 minuti. L'analisi delle immagini 4D rivela differenze significative tra il movimento delle cellule dendritiche e quello dei neutrofili reclutati, con una velocità significativamente più elevata dimostrata da quest'ultimo. La complessa morfologia delle cellule dendritiche causa frequenti errori nell'inseguimento cellulare, che a sua volta produce tracce con una durata ridotta e una maggiore varianza nel comportamento direzionale misurato.

Pertanto, è stata creata una metrica robusta per misurare la direzionalità considerando la durata della traccia, rivelando una differenza significativa nella direzionalità dei neutrofili rispetto alle cellule dendritiche. Inoltre, il calcolo della distanza tra i neutrofili e le cellule dendritiche consente la rilevazione e l'analisi dei loro contatti nel tempo, con alcuni neutrofili in questo esperimento rappresentativo che formano più brevi contatti con le cellule dendritiche e altri che non formano alcun contatto con le cellule dendritiche durante il periodo di imaging. Inoltre, lo studio dell'andamento medio della distanza tra neutrofili e cellule dendritiche nel tempo facilita lo studio del posizionamento complessivo delle cellule, mentre lo studio dell'andamento in specifiche cellule consente la caratterizzazione del comportamento di ogni singola cellula.

Conoscendo questa procedura, altri metodi come la citometria a flusso della trachea possono essere eseguiti per valutare la quantificazione e la caratterizzazione del reclutamento di diverse cellule immunitarie nella trachea infetta. Non dimenticare che lavorare con qualsiasi ceppo di virus influenzale, anche se adattato al topo, può essere pericoloso e che, pertanto, ogni procedura dovrebbe essere eseguita in condizioni di livello di biosicurezza due.