Name: Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri l'analisi dell'invasione cellulare tumorale in sferoidi 3D utilizzando l'array di micro-camera idrogel. Questo metodo consente il monitoraggio continuo e lo screening di farmaci anti-metastatici con elevata risoluzione.

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Questo lavoro è supportato dal lascito di Moshe Shimon e Judith Weisbrodt.

1. HMCA piastra goffratura
Nota: Il processo completo per la progettazione e la fabbricazione di polidimetilsilossano (PDMS) timbro e piastra imaging HMCA utilizzato in questo protocollo è descritto in dettaglio nel nostro precedente articoli15,16. Il timbro PDMS (forma negativa) viene utilizzato per imprimere il HMCA (forma positiva) che consiste di circa 450 MCs per pozzetto (Figura 1A). Come dimostrato in Figura 1B, ciascuno di MCs ha la forma di un tronco di piramide capovolto forma quadrata (altezza: 190 µm, piccola area base: 90 µm x 90 µm e grande superficie di base: 370 µm x 370 µm). La piastra HMCA viene utilizzata per la preparazione e la coltura di sferoidi 3D del tumore e da allora in poi, per analisi di invasione. In alternativa, un timbro commerciale potrebbe essere utilizzato per la produzione di HMCA.
<ol><li>Preparare una soluzione di 6% di agarosio bassa fusione (LMA). Inserire la LMA polvere e soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) (0,6 g di LMA per 10 mL di PBS) in una bottiglia di vetro con un agitatore magnetico. Collocare il flacone su una piastra riscaldante e agitare la soluzione durante il riscaldamento a 80 ° C per alcune ore finché non si ottiene una soluzione uniforme. Mantenere la soluzione a 70 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Pre-riscaldare il timbro PDMS a 70 ° C in forno. Tenere in caldo fino all'utilizzo. In alternativa, utilizzare un timbro commerciale e seguire le istruzioni.</li>
	<li>Posizionare le piastre commerciale 6-pozzetti con fondo di vetro su un bagno secco pre-riscaldato a 75 ° C. Attendere alcuni minuti fino a quando la piastra è totalmente calda.</li>
	<li>Versare una goccia (400 µ l) di LMA pre-riscaldato sul fondo del bicchiere di ciascuno dei pozzetti della piastra. Posizionare delicatamente il timbro PDMS pre-riscaldato sopra la goccia di agarosio. Incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 – 10 min per pre-gelificazione e pre-raffreddamento. Incubare a 4 ° C per 20 min raggiungere completo dell'agarosi gelificazione. Quindi, staccare delicatamente il PDMS, lasciando il gel di agarosio modellato con MCs. Nota: Questo passaggio avviene simultaneamente in tutti i pozzetti.</li>
	<li>Posizionare la piastra in rilievo in un sistema dotato di raggi ultravioletti (UV) lampada di polimerizzazione e incubare per 3 min. Nota: Ora la piastra HMCA è UV sterilizzato.</li>
	<li>Riempire i macro-pozzetti con PBS sterile per garantire che essi sono mantenuti umidi, quindi coprire la piastra, avvolgerlo con parafilm e conservarlo a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Prima dell'uso, svuotare residui dalla piastra HMCA di PBS. Posizionarlo nella cappa biologica.</li>
</ol>2. le cellule e la formazione della sferoide di carico
<ol><li>Raccogliere le cellule come segue: rimuovere tutte le medie da un monostrato di cellule di 10cm cultura piastra, lavare due volte con 10 mL di PBS per smaltire i residui di siero, aggiungere 5 mL di tripsina (pre-riscaldata a 37 ° C) e incubare per 3 min in incubatore a 37 ° C. Quindi, agitare la piastra delicatamente per garantire il distacco dello strato monomolecolare, aggiungere 10 mL di terreno completo (pre-riscaldato a 37 ° C) e pipetta su e giù finché non si ottiene la sospensione cellulare omogenea. Centrifugare e lavare la sospensione cellulare con 15 mL di terreno nuovo, poi la sospensione a concentrazioni appropriate in mezzo fresco completo.</li>
	<li>Caricare delicatamente la sospensione cellulare (50 µ l, 150 – 360 x 103 cellule/mL in mezzo, ~ 16 – 40 cellule per MC) sopra il HMCA e permettono alle cellule di depositarsi per gravità per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere delicatamente le aliquote di 6 – 8 di mezzo fresco a 500 µ l (totale 3-4 mL) al bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo fuori dalla matrice anello e idrogel.</li>
	<li>Incubare le cellule HeLa per 72 h e cellule MCF7 per 48 h a 37 ° C e 5% di CO2, in atmosfera umidificata per la formazione di sferoidi.</li>
</ol>3. sostenibilità rilevamento di ioduro di propidio (PI) colorazione
<ol><li>Preparare una soluzione stock di PI (500 µ g di PI per 1 mL di PBS). Tenerlo a 4 ° C per circa 6 mesi. Appena preparare una diluizione di 1:2,000 (0,25 µ g/mL), con l'aggiunta di 6 µ l di brodo per 12 mL di terreno completo senza rosso fenolo, per la piastra HMCA 6 pozzetti (2 mL per pozzetto).</li>
	<li>Trasferire la piastra HMCA con sferoidi di 48-72 h, dall'incubatrice alla cappa biologica. Pendente la fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo accanto la matrice di idrogel per rimuovere tutte le medie dalla HMCA, lasciando il serbatoio di matrice riempito con il mezzo.</li>
	<li>Delicatamente aggiungere 2 mL di diluizione PI da passo 3.1 in ciascun pozzetto, piegandosi alla fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo. Incubare la piastra HMCA per 1h a 37 ° C e 5% CO2, in atmosfera umidificata. Procedere al passaggio 7. Nota: Altri coloranti possono essere utilizzati qui pure, per esempio, Hoechst per la colorazione del nucleo, estere metilico di tetrametilrodamina (TMRM) per il potenziale di membrana mitocondriale macchiando, diacetato di fluoresceina (FDA) per la rilevazione di cellule vive, Annexin V per apoptosi rilevamento e altri.</li>
</ol>4. preparazione della miscela collagene
<ol><li>Preparare l'acqua distillata doppia sterile (DDW) autoclave e uno stock di 100 mL di soluzione di filtro-sterilizzato di 1 M NaOH. Mantenere i materiali a RT e le punte utilizzate per la preparazione della miscela del collagene congelati a-20 ° C, fino all'utilizzo.</li>
	<li>10 – 20 min prima dell'uso, inserire tutti i intergrades tra cui: DDW sterile, 1 M NaOH soluzione sterile, sterile 10 x PBS, tipo I collagene da coda di topo (conservato a 4 ° C per 3 – mesi) e un tubo sterile nel secchio di ghiaccio fino a quando completamente raffreddato. Posizionare il secchio di ghiaccio all'interno della cappa biologica.</li>
	<li>Prepararsi 1.800 µ l della miscela di collagene a una concentrazione finale di 3 mg/mL, piastra a 6 pozzetti HMCA invasione assay (300 µ l per pozzetto) come segue. Aggiungere il intergrades nel tubo raffreddato nel seguente ordine: 515 µ l di DDW, 24,8 µ l di 1 M NaOH e 180 µ l di PBS 10X. Mescolare bene vortice e porre nuovamente dentro il ghiaccio. Infine, µ l 1080 di collagene alla miscela, vortice nuovamente e rimise sul ghiaccio.</li>
</ol>5. ettari e preparazione della miscela di collagene
<ol><li>Sciogliere 10 mg di HA in 2 mL di DDW sterile. Incubare la miscela a temperatura ambiente per qualche minuto e vortice delicatamente fino a che la polvere sia completamente disciolta. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C fino a due anni.</li>
	<li>Proprio prima dell'utilizzo, collocare la soluzione stock HA nel secchio di ghiaccio all'interno della cappa biologica.</li>
	<li>Preparare un 3mg/mL di miscela di collagene come descritto nel passaggio 4. Riaggiungere 36 µ g (7,2 µ l) di HA 1.800 μL di miscela di collagene, pronto per una concentrazione finale di 20 µ g/mL. Poi, vortice ancora brevemente e mettere in ghiaccio.</li>
</ol>6. ECM miscela aggiunta
<ol><li>Trasferire la piastra HMCA, con sferoidi di 48-72 h, dall'incubatrice in cappa biologica e posizionarlo sul ghiaccio. Incubare per 10 minuti fino a quando la piastra viene raffreddata. Pre-riscaldare una soluzione di 1% LMA a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Rimuovere tutte le medie da intorno HMCA, piegandosi alla fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo accanto la matrice di idrogel. Quindi, con molta attenzione, rimuovere tutte le medie dal serbatoio di matrice con un bel suggerimento/gel carico di punta, piegandosi alla fine punta sul bordo matrice, delicatamente e lentamente succhiare tutto il mezzo fuori. Nota: Dopo aver rimosso tutte le medie da intorno la matrice di idrogel, il serbatoio di matrice è ancora pieno di mezzo. Questo mezzo deve essere rimosso molto delicatamente per evitare la distruzione di idrogel MC e dislocazione di sferoidi.</li>
	<li>Prendete 150 µ l di miscela di collagene o miscela HA e collagene (ECM miscela) con la punta fine pre-congelata e aggiungere nel serbatoio matrice collegando la punta verso il bordo della matrice. Rilasciare la miscela lentamente per evitare la dislocazione della sferoide. Ripetere questo passaggio con un'altra aliquota di 150 µ l, per un totale 300 µ l per pozzetto. Seguire la stessa procedura per ciascun pozzetto fino a tutti i pozzetti sono pieni. Quindi posizionare la piastra in incubatrice per 1 h per la gelificazione completo del ECM.</li>
	<li>Dopo la gelificazione completo di ECM è stato raggiunto, dispensare 400 µ l di pre-riscaldato 1% LMA sulla superficie del gel di ECM. Coprire la piastra con il suo coperchio, incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 – 7 minuti e poi per 2 min a 4 ° C, per gelificazione dell'agarosi. Infine, delicatamente aggiungere 2 mL di terreno completo si appoggia l'estremità sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo. Nota: Lo strato di agarosio impedisce il distacco della matrice del collagene-gel dal HMCA.</li>
</ol>7. invasione Assay acquisizione e analisi
<ol><li>Carico la piastra HMCA su un motorizzato invertito il tavolino del microscopio dotato di un incubatore, pre-regolato a 37 ° C, 5% CO2 e atmosfera umidificata.</li>
	<li>Pre-determinare le posizioni per acquisizione di immagini in ogni bene in modo da coprire l'area dell'intera matrice e utilizzano 10 X o 4 X obiettivi (questo passaggio è necessario per il software di acquisizione di immagine utilizzato qui, vedere la Tabella dei materiali sotto per dettagli). In alternativa, utilizzare qualsiasi software di acquisizione immagini per facilitare la scansione automatica di tutta l'area necessaria, scegliendo il "Stich" opzione.</li>
	<li>Acquisire immagini luminose del campo (BF) ogni 2 – 4 h per un periodo complessivo di 24-72 h per seguire l'invasione delle cellule dal corpo sferoide in ECM circostanti.</li>
	<li>Acquisire immagini fluorescenti per il rilevamento di PI utilizzando un cubo fluorescente dedicato (eccitazione filtro 530 – 550 nm, specchio dicroico 565 nm lungo pass ed emissione filtro 600-660 nm).</li>
	<li>Esportare immagini time-lapse di BF/fluorescente dal software di acquisizione immagini e salvarle in formato tagged image file (TIFF), a una cartella dedicata, utilizzando la scheda "Database" nella barra degli strumenti, quindi il tasto "Esporta record file" . Nota: Abbiamo sviluppato un codice di analisi in-House speciale nel software MATLAB che include un'interfaccia utente grafica progettata (GUI) in quale invasione analisi potrebbero essere eseguito più velocemente e facilmente. In questo codice di analisi, la segmentazione delle sferoidi e zona di invasione è fatto semi-automaticamente utilizzando il filtro di Sobel seguita dagli operatori morfologici erosione e dilatazione. Dopo la segmentazione automatica delle aree, sono state apportate correzioni manuali dove necessario per una migliore precisione. Dopo il completamento di segmentazione, un set di parametri sono stati automaticamente calcolato dal software ed esportati in un file excel per ulteriori manipolazioni. L'elenco dei parametri sono: area sezionale base sferoide a tempo = 0, zona di invasione delle cellule collegate al corpo sferoide = zona di invasione principale, zona delle cellule separate dalla zona di invasione principale, numero di cellule separata dalla zona di invasione principale, distanza media di invasione dal centro di massa della sferoide base alla circonferenza della zona di invasione principale e cellule separate e parametro distance invasione collettiva = d (d = √ ((X2 -1)2 + (Y2 – Y1)2) sul Le coordinate X e Y della sferoide centro di massa, prima (X1, Y1) e dopo (X2, Y2) processo di invasione collettiva). In alternativa, analisi dell'immagine potrebbe essere fatto con qualsiasi altro software specializzato.</li>
	<li>Aprire l'interfaccia grafica e premere il pulsante "Load BF" . Dopo avere aperto l'immagine, regolare i parametri di segmentazione (dimensione minima: > 1 e raggio chiudere: > 1) per ottenere una precisa segmentazione della sferoide e la sua area di invasione, premere quindi il tasto "Regione di segmentazione di interesse (ROI)" per l'esecuzione e verrà visualizzato un bordo intorno a ogni sferoide. Se la segmentazione automatica non è corretta, premere il pulsante "Elimina" o "Aggiungi" e apportare le correzioni richieste manualmente. Ripetere la stessa procedura per le immagini successive.</li>
	<li>Premere il pulsante "Tracking" per numerare le sferoidi e il software assegnerà lo stesso numero per ogni sferoide in ciascuna delle immagini di lasso di tempo. Quindi, premere il pulsante "Misura" , che genererà un foglio di calcolo con tutti i parametri. Salvare questo foglio di calcolo come un file di excel per ulteriore elaborazione di risultati e statistiche in excel software.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

È ben documentato che gli organismi viventi, caratterizzati dalla loro organizzazione pluricellulare 3D complessi sono abbastanza distinti dalle cellule comunemente usato monostrato 2D coltivata, sottolineando la necessità cruciale di utilizzare modelli cellulari che meglio imitano le funzioni e processi dell'organismo vivente per droga di screening. Recentemente, sferoidi multicellulari, colture organotipiche, organoids e organi-on-a-chip sono stati introdotti8 per l'uso nella scoperta della drog...

Morte per cancro è attribuita principalmente alla diffusione delle cellule metastatiche in luoghi distanti. Molti sforzi nel trattamento del cancro concentrano sul targeting o prevenire la formazione di colonie metastatiche e la progressione della malattia metastatica sistemica1. Migrazione delle cellule di cancro è un passo cruciale nel processo di metastasi del tumore, così, la ricerca della cascata di invasione del tumore è molto importante e un prerequisito per trovare terapie anti-metastatica.
L'uso di modelli animali come strumenti per lo studio della malattia metastatica è stato trovato per essere molto costoso e non sempre rappresentativo del tumore in esseri umani. Inoltre, la topologia del microambiente extracellulare, la meccanica e la composizione possono influenzare fortemente cancro cella comportamento2. Dato che in vivo modelli intrinsecamente mancano la capacità di separare e controllare tali parametri specifici che contribuiscono alla invasione tumorale e metastasi, c'è un'esigenza biomimetici controllabile in vitro modelli.
Per riprodurrsi per metastasi agli organi distanti, le cellule tumorali devono esibire tratti fenotipici migratori e invasivi che possono essere mirati per la terapia. Tuttavia, poiché la maggior parte dei modelli in vitro del cancro non imitare le effettive caratteristiche di tumori solidi3, è molto difficile da rilevare fenotipi fisiologicamente rilevanti. Inoltre, l'eterogeneità fenotipica che esiste all'interno del tumore, impone la necessità per l'analisi di migrazione di tumore a elemento singolo risoluzione al fine di scoprire terapie fenotipo-diretto, per esempio, prendendo di mira la cella d'inizio metastasi popolazione all'interno di tumori eterogenei4.
Lo studio della motilità cellulare e migrazione collettiva avviene principalmente in colture monostrato di cellule epiteliali su superfici piane omogenee. Questi modelli di cellulari convenzionali per migrazione delle cellule di cancro sono basati sull'analisi della popolazione delle singole cellule che invadono attraverso le membrane ed ECM componenti5, ma in tali sistemi, le differenze intrinseche tra le singole celle non possono essere ha studiato. Sferoidi 3D generazione tramite impalcature o in micro-strutture senza impalcatura è considerato come superior significa studiare il tumore delle cellule di cancro e crescita invasione6,7,8. Tuttavia, più sistemi 3D non sono adatti ad elevato throughput formati e interazione inter-sferoide solitamente non può essere realizzato poiché isolati sferoidi individuali vengono generati in ogni micro-pozzo9. Gli studi recenti che coinvolgono la migrazione di cancro si basano su microfluidic dispositivi3,10,11,12, tuttavia, questi sofisticati microfluidici strumenti sono difficili da produrre e non può essere utilizzato per high throughput screening (HTS) di farmaci anti-dilaganti.
Due fenotipi principali, migrazione cellulare collettiva e individuale, che svolgono un ruolo in cellule del tumore, superando la barriera di ECM e invadendo il tessuto vicino, sono stati dimostrati13,14, ogni visualizzazione distinte morfologica caratteristiche, meccanismi biochimici, molecolari e genetici. Inoltre, due forme di migrazione delle cellule del tumore, fibroblasto-come e ameboidi, sono osservate in ogni fenotipo. Dato che entrambi, fenotipi di invasione e le modalità di migrazione, principalmente sono definiti da proprietà morfologiche, c'è una necessità per cellulari modelli che attiva la rilevazione basata su formazione immagine e l'esame di tutte le forme di invasione del tumore e la migrazione di cellule.
L'obiettivo generale del metodo corrente è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D in vitro basati su cellule per l'analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Qui, presentiamo la piastra di imaging 6 pozzetti HMCA-based per la ricerca di invasione del tumore e la terapia anti-metastatica. La tecnologia consente la formazione di un gran numero di sferoidi tumore 3D uniforme (450 per pozzetto) in una struttura di micro-chambers (MC) di idrogel. Vari componenti della ECM vengono aggiunti alla matrice sferoide per abilitare l'invasione delle cellule nell'ambiente circostante. Processo di invasione è costantemente monitorato tramite l'osservazione a breve e a lungo termine delle stesse cellule individuali degli sferoidi che invade e facilita la caratterizzazione morfologica, colorazione fluorescente e il recupero di specifici sferoidi in qualsiasi punto. Poiché numerose sferoidi condividono spazi e medio, è possibile interagire tramite molecole solubili tra sferoidi individuali e il loro impatto su un altro. Analisi semi-automatica dell'immagine viene eseguita utilizzando il codice MATLAB in-House che consente la raccolta più veloce ed efficiente di grandi quantità di dati. La piattaforma facilita la misurazione accurata, simultanea di numerose cellule di sferoidi/invadendo in maniera efficiente, consentendo di screening su vasta scala medio di farmaci anti-invasione.

<table><tbody><tr><td>Piastre di fondo in vetro a 6 micropozzetti con vetro di copertura da 14 mm a micropozzetto #1,5</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1,5-N</td><td>Piastre di fondo in vetro commerciale utilizzate per la goffratura</td></tr><tr><td>HMCA UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Una soluzione di agarosio al 6% viene riscaldata fino a 80 ... C prima dell'uso, una soluzione di agarosio all'1% viene riscaldata a 37 gradi C</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina EDTA B</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1A</td><td>Riscaldato a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM medio, alto glucosio</td><td>Industrie biologiche</td><td>01-055-1A</td><td>riscaldato a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero speciale per vitelli appena nati (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>DPBS inattivato a caldo</td></tr><tr><td>(10x), senza calcio, senza magnesio</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Tenuto in ghiaccio prima dell'uso</td></tr><tr><td>NaOH, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Utilizzato per la preparazione della soluzione 1 M di NaOH</td></tr><tr><td>Cultrex di tipo I collagene da coda di ratto, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Tenuto in ghiaccio prima dell'uso</td></tr><tr><td>Acido ialuronico sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Tenuto in ghiaccio prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fisetina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Aggiunto al terreno di coltura, inibitore dell'invasione</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Aggiunto al terreno di coltura, donatore di ossido nitrico</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Utilizzato a concentrazione molto bassa senza necessità di lavaggio</td></tr><tr><td>Sistema completo di lampada di inondazione UV Dymax 5000-EC con schermo luminoso e Alimentatore EC Dymax 400 Watt</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Utilizzato per la sterilizzazione di lastre HMCA mediante microscopio</td></tr><tr><td>IX81 invertito</td> UV <td>Olympus</td><td></td><td>Utilizzato per l'acquisizione automatica di immagini</td></tr><tr><td>Incubatore per microscopio</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Essenziale per esperimenti time lapse con acquisizione di immagini, pre regolato a 37 &deg; C, 5% CO2 e mantenimento di un'atmosfera umidificata</td></tr><tr><td>Stadio motorizzato sub-micron tipo SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Utilizzato per predeterminare le aree di acquisizione delle immagini, per l'acquisizione automatica delle immagini</td></tr><tr><td>Telecamera raffreddata a 14 bit, ORCA II C4742-98</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Altamente sensibile, utilizzato per l'imaging</td></tr><tr><td>Cubo filtrante fluorescente per il rilevamento PI</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Specifiche del cubo del filtro: filtro di eccitazione 530-550 nm, specchio dicroico 565 nm a passaggio lungo e filtro di emissione 600-660 nm</td></tr><tr><td>Il software operativo Olympus Cell^P</td><td>Software Olympus</td><td></td><td>utilizzato per controllare il microscopio, il tavolino motorizzato, la fotocamera e l'acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Software di analisi Matlab R2014B</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Utilizzato per sviluppare internamente l'interfaccia utente grafica per l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Software</td> <td>ExcelMicrosoft</td><td></td><td>Utilizzato per la gestione dei dati, il calcolo, la creazione di grafici e le statistiche</td></tr></tbody></table>

analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando hydrogel micro-camera matrice (hmca) di screening di stupefacenti-piastre di base

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Metastasi del cancro è conosciuta per causare il 90% della mortalità del cancro. La metastasi è un processo a più stadi che inizia con la penetrazione/invasione delle cellule del tumore nei tessuti vicini. Così, l'invasione è un passo cruciale nella metastasi, rendendo l'invasione processo ricerca e sviluppo di farmaci anti-metastatici, altamente significativo. Per rispondere a questa domanda, c'è una necessità di sviluppare modelli 3D in vitro che imitano l'architettura dei tumori solidi e loro microambiente maggiormente allo stato di in vivo su una mano, ma allo stesso tempo essere riproducibile, robusto e adatto per ad alto rendimento e alta misura del contenuto. Attualmente, la maggior parte delle analisi di invasione appoggiano microfluidici sofisticate tecnologie che sono sufficienti per la ricerca, ma non per lo screening di stupefacenti ad alto volume. Altre analisi utilizzando dispositivi basati su piastra con sferoidi isolati individuali in ciascun pozzetto sono materiale che consumano e hanno le dimensioni campione basso condizione. L'obiettivo del protocollo attuale è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D basati su cellule per l'analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Abbiamo sviluppato un modello 3D per analisi di invasione basato sul HMCA piatto imaging per la ricerca di invasione del tumore e di scoperta della droga anti-metastatica. Questo dispositivo consente la produzione di numerose sferoidi uniforme per pozzetto (dimensione del campione di alta condizione) circondato da componenti della MEC, mentre continuamente e contemporaneamente osservare e misurare le sferoidi a elemento singolo risoluzione per mezzo screening di resa di farmaci anti-metastatiche. Questa piattaforma è presentata qui dalla produzione di sferoidi HeLa e MCF7 per esemplificando la cella singola e collettiva invasione. Mettiamo a confronto l'influenza dell'ECM componente acido ialuronico (HA) sulla capacità invasiva del collagene circostante HeLa sferoidi. Infine, vi non presentiamo Fisetin (inibitore di invasione) a HeLa sferoidi e ossido nitrico () (attivatore di invasione) di MCF7 sferoidi. I risultati sono analizzati dal software interno che consente l'analisi semi-automatica, semplice e veloce che facilita l'esame multi-parametro.

L'unico HMCA piastra di imaging viene utilizzato per l'analisi di invasione di sferoidi 3D del tumore. Il test intero, inizia con la formazione della sferoide e termina con il processo di invasione e ulteriori manipolazioni, viene fatto all'interno della placca stessa. Per la formazione della sferoide, cellule HeLa sono caricate nel bacino di matrice e stabilirsi in idrogel MCs per gravità. L'idrogel MCs, che hanno caratteristiche di non-aderente/basso attaccamento, facilitare l'interazio...

Un piatto di imaging basata su HMCA è presentato per prestazioni di test di invasione. Questa piastra facilita la formazione di sferoidi tridimensionali (3D) del tumore e la misurazione dell'invasione della cellula tumorale nella matrice extracellulare (ECM). La quantificazione di dosaggio di invasione avviene mediante analisi semi-automatica.

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

L'obiettivo di questo semplice sistema biomimetico biomimetico a base cellulare 3D è quello di facilitare l'analisi della capacità di invasione in una grande popolazione di sferoidi tumorali per lo screening anti-metastatico dei farmaci. Il vantaggio principale del nostro array di micro-camere idrogel è che consente la produzione di un gran numero di sferoidi uniformi che popolano lo stesso piano focale per pozzo. La posizione dello sferoide viene mantenuta grazie alla struttura dell'array di microcamera dell'idrogel anche dopo l'aggiunta della matrice extracellulare, facilitando l'accurato monitoraggio continuo degli sferoidi e del processo di invasione.Inoltre, la caratterizzazione morfologica e la colorazione fluorescente di numerosi sferoidi e cellule invasori possono essere eseguite in situ e analizzate con una risoluzione a singolo elemento in modo efficiente in termini di tempo. A dimostrare la procedura di produzione di lastre di imaging a sei pozzi hydrogel micro-chamber array sarà Maria Sobolev del nostro laboratorio. Per preparare le piastre di array a microcamera dell'idrogel, preriscaldare prima sei polidimetilsilossano, o PDMS, timbra a 70 gradi Celsius e posizionare una piastra inferiore in vetro a sei pozzi su un bagno asciutto preriscaldato a 75 gradi Celsius per diversi minuti.Quando la piastra è calda, versare una goccia di 400 microliter di agarosio preriscaldato a bassa fusione sul fondo di ogni pozzo della piastra a sei pozzetto e posizionare delicatamente un timbro su ogni goccia. Lasciare raffreddare la configurazione per cinque-10 minuti a temperatura ambiente, seguita da 20 minuti a quattro gradi Celsius per la gelazione completa dell'agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, staccare delicatamente il PDMS da ogni pozzo, lasciando i gel di agarosio modellati con micro-camere.Dopo aver permesso alla lampada UV di raggiungere la sua massima intensità, posizionare la piastra goffrata nel sistema di polimerizzazione della luce per tre minuti e riempire i macro-pozzi sterilizzati uv con PBS sterile. Quindi, coprire la piastra e avvolgerla con Parafilm per una conservazione di quattro gradi Celsius fino all'uso. Per caricare le celle, rimuovere il PBS da ogni pozzo e caricare delicatamente 50 microlitri delle cellule di interesse sopra ogni array di idrogel.Dopo aver permesso alle cellule di depositarsi per gravità per 15 minuti, aggiungere con cura da sei a otto aliquote di 500 microlitri di mezzo fresco al bordo del fondo di plastica macro-pozzo all'esterno dell'anello e dell'array di idrogel. Incubare le cellule per il periodo di tempo appropriato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità per la formazione di sferoidi. Quindi, trasferire gli sferoidi in una cappa di biosicurezza sul ghiaccio per 10 minuti.Quando la piastra si è raffreddata, appoggiare una punta di pipetta sul bordo del fondo di plastica macro-pozzo accanto all'array di idrogel e rimuovere tutto il mezzo da tutto l'array. Quindi, rimuovere il mezzo dal serbatoio dell'array, appoggiare con molta attenzione una punta della pipetta a caricamento in gel sul bordo del serbatoio dell'array, facendo attenzione a non disturbare le micro-camere e gli sferoidi. Successivamente, utilizzare una punta di pipetta fine pre-congelata per aggiungere due aliquote di 150 microlitri della miscela di collagene di interesse sul bordo dell'array una alla volta, rilasciando lentamente la miscela per evitare la lussazione dello sferoide.Dopo che il secondo ciclo di collagene è stato aggiunto ad ogni pozzo, riportare gli sferoidi nell'incubatrice per un'ora per la gelazione completa della matrice extracellulare. Quando la matrice si è solidificata, aggiungere 400 microlitri di agarosio pre-riscaldato a bassa fusione dell'1% sopra il gel e incubare la piastra, coperta a temperatura ambiente, per cinque-sette minuti, prima di raffreddare per due minuti a quattro gradi Celsius per la gelazione dell'agarosio. Quindi, appoggiando la pipetta sul bordo del fondo in plastica macro-pozzo, aggiungere delicatamente due millilitri di mezzo completo ad ogni pozzo.Per eseguire un test di invasione, caricare la piastra array a microcamera dell'idrogel su uno stadio di microscopio invertito motorizzato dotato di un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con un'atmosfera umidificata e utilizzare un obiettivo quattro o 10x per pre-determinare le posizioni per l'acquisizione dell'immagine in ogni pozzo in modo da valutare l'intera area dell'array. Quindi, acquisisci immagini a campo luminoso ogni due o quattro ore per un totale di 24-72 ore per monitorare l'invasione cellulare dal corpo dello sferoide nella matrice extracellulare circostante. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, esportare le immagini time-lapse dal software di acquisizione delle immagini per il salvataggio in un formato di file di immagine con tag in una cartella dedicata.Aprire quindi l'interfaccia utente grafica e fare clic su Carica campo luminoso. Regolate i parametri di segmentazione dell'immagine per ottenere una segmentazione precisa degli sferoidi e delle loro aree di invasione, quindi fate clic su Segmentazione regione di interesse (Region Of Interest Segmentation) per creare un bordo attorno a ogni sferoide. Se la segmentazione automatica non è corretta, premere CANC o Aggiungi e apportare manualmente le correzioni appropriate.Fate clic su Tracciamento (Tracking) per numerare gli sferoidi in ciascuna delle immagini time-lapse. Quindi, fare clic su Misurazione per generare un foglio di calcolo con tutti i parametri e salvare il foglio di calcolo in un formato appropriato per l'elaborazione dei dati e l'analisi statistica. Per esaminare l'influenza dell'acido ialuronico sul processo spontaneo di invasione sferoide HeLa, in questo esperimento, gli sferoidi maturi due giorni sono stati coperti con soluzione di miscela di collagene e acido ialuronico e confrontati con sferoidi maturi due giorni coperti solo con soluzione di collagene.Dopo 50 ore di incubazione, gli sferoidi incorporati nel collagene e nell'acido ialuronico hanno dimostrato una minore dispersione cellulare nella matrice extracellulare circostante rispetto agli sferoidi incorporati nel solo collagene. Infatti, l'analisi della cinetica dell'area di invasione nel tempo per 99 sferoidi a risoluzione a sferoide singolo indica chiaramente che l'aggiunta di acido ialuronico al collagene inibisce la dispersione cellulare fuori dalla sferoide, con conseguente aree di invasione più piccole. Il trattamento della coltura di sferoidi HeLa con un flavonoide bioattivo con proprietà cito-emigratiche per 24 ore si traduce in una dispersione cellulare inibita intorno agli sferoidi rispetto agli sferoidi HeLa non trattati.Infatti, l'analisi delle aree di invasione di 488 sferoidi alla fine dell'esperimento ha rivelato una significativa inibizione dopo il trattamento con appena 10 micromolari del farmaco. A causa della bassa caratteristica di attacco dell'idrogel, questa tecnologia a base di microcamera facilita la formazione di sferoide anche in casi di pochissime cellule. Questo è particolarmente utile nei preziosi campioni di cellule primarie a staminali tumorali o derivati dal paziente.La piastra di imaging a microcamera idrogel consente l'analisi dell'esatta posizione spaziale degli sferoidi durante gli esperimenti a lungo termine per la valutazione del processo di invasione a livello di singolo elemento e fornisce un alto grado di robustezza statistica e precisione. Le applicazioni future di questa metodologia includono la coltivazione multi-cellula affiancata di cellule tumorali e stromali in diverse regioni all'interno del macro-pozzo e il recupero di singoli sferoidi per l'analisi molecolare a valle.

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Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base (Video) | JoVE Journal

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

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