Name: Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare lassorbimento intestinale di sostanze bioattive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Scopri l'intubazione orale di zebrafish adulti per studiare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive e la risposta immunitaria locale. Questo metodo semplice e veloce offre bassa mortalità e applicazioni in vaccinologia mucosa.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, AGAUR fondi al NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Commissione europea. RT ha conseguito una borsa di studio pre-dottorato AGAUR (Spagna), JJ è stata sostenuta da una borsa di dottorato del Consiglio di borsa di studio della Cina (Cina) e NR è supportato dal programma Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Ringraziamo il dottor Torrealba per consulenza di esperti nella produzione di proteine, N. Barba dal "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa da "Servei de Citometria" della Universitat Autònoma de Barcelona per assistenza tecnica disponibile.

Tutti i procedimenti sperimentali zebrafish (Danio rerio) sono stati autorizzati dal comitato etico della Universitat Autònoma de Barcelona (numero di chetta 1582) in accordo con gli International Guiding Principles for Research Involving Animals ( EU 2010/63). Tutti gli esperimenti con il danio zebrato dal vivo sono stati eseguiti 26 – 28 ° c.
1. preparare l'attrezzatura per intubazione orale
<ol><li>Posto circa 1 cm di tubo in silicone bene sui ferri 31 G Luer lock per coprire la punta dell'ago.</li>
	<li>Taglio una pipetta di filtro sterile 10 µ l punta (circa 2 cm), prendere l'estremità più sottile e posto sopra il tubo di silicone come una guaina. Assicurarsi che la pipetta si estende oltre la punta dell'ago per evitare di ferire l'animale.</li>
	<li>Inserire l'ago di una siringa di 100 µ l Luer lock. Nota: Sciacquare sempre con etanolo e quindi tampone fosfato salino (PBS, Vedi materiali) accuratamente fra i trattamenti.</li>
</ol>2. soluzioni richieste
<ol><li>Preparare 150 mg/L (per l'anestesia) o 300 mg/L (per eutanasia) di soluzione di methanesulfonate (MS-222) 3-aminobenzoate etilico con acqua dall'acquario dove sono mantenuti zebrafish. Riempire un serbatoio piccolo con 1 L di soluzione anestetica e mantenerlo aerato.</li>
	<li>Riempire un altro piccolo serbatoio con 1 L di acqua dell'acquario senza MS-222 per il recupero del pesce e mantenerlo aerato.</li>
	<li>Portare a 50 mL di 1X PBS da un 10 x soluzione sterile.</li>
	<li>Per isolamento delle cellule intestinali/analisi cytometry, preparare abbastanza fresco collagenasi di 0,15% soluzione di tipo IV per 1 mL / pesce da una soluzione di riserva o da polvere in mezzo di eagle modificate di Dulbecco (DMEM) con 1% v/v penicillina e streptomicina (Vedi materiali). Rendere le aliquote (1 per ogni pesce) da 1 mL in provette da centrifuga 2 mL. Conservare a 4 ° C fino a 30 min prima del passaggio di dissezione.</li>
	<li>Per la fissazione di microscopia confocale/campione, preparare 50 mL di soluzione fresca di paraformaldeide (PFA) 4% in PBS o scongelare una soluzione stock dal congelatore a-20 ° C in una cappa aspirante. Attenzione: PFA è tossico. Si prega di leggere il foglio di dati materiale di sicurezza prima di lavorare con esso. Guanti e occhiali di sicurezza devono essere indossati e lasciare sempre soluzioni all'interno di una cappa aspirante.</li>
</ol>3. preparare la sospensione delle nanoparticelle fluorescenti
<ol><li>Etichettare la proteina di nanoparticelle con estere NHS Atto-488 (Vedi Tabella materiali) o un colorante fluorescente appropriato secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Risospendere le nanoparticelle in 0.1 M tampone del bicarbonato di sodio alla concentrazione di 2 mg/mL.</li>
	<li>Sciogliere l'estere di Atto 488 NHS in privo di ammina dimetilsolfossido (DMSO) a 2 mg/mL. Mantenere un'aliquota di 10 µ l di verificare l'efficienza d'etichettatura (passo 3,7-3,8).</li>
	<li>Mescolare le nanoparticelle e l'estere NHS 488 Atto ad un rapporto molare di 1:2 (proteina: tintura) mediante agitazione al buio.</li>
	<li>Rotazione verso il basso le nanoparticelle con etichettate mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a temperatura ambiente, rimuovere il supernatante e tenerlo per verificare l'efficienza d'etichettatura (passo 3,7-3,8).</li>
	<li>Lavare le nanoparticelle con etichettate di risospensione in 1 mL di soluzione tampone del bicarbonato di sodio 0,1 M di Vortex e pipettaggio su e giù. Quindi eliminare il supernatante mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 3.6 per 5 volte.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 5 mL di soluzione tampone del bicarbonato di sodio 0,1 M in una provetta da centrifuga da 15 mL e rendere le aliquote della nanoparticella fluorescente in provette da 1,5 mL (30 aliquote). Rotazione verso il basso a 8.000 x g per 10 min a temperatura ambiente, scartare il surnatante e conservare a-80 ° C al riparo dalla luce.</li>
	<li>
Misurare l'efficienza d'etichettatura utilizzando uno spettrofotometro di microvolume.
	<ol>
<li>Prendere 1 µ l della soluzione originale Atto 488 mantenuta dal punto 3.3 e diluire ulteriormente in DMSO (ad es., 01:20 in base al rapporto di volume). Questo è il volume utilizzato per ottenere il rapporto molare della proteina di nanoparticelle e Atto 488 mix al punto 3.4.</li>
		<li>Prendere 1 µ l del surnatante salvato dalla reazione di etichettatura al punto 3.5. Misurare l'assorbimento (abs) a = 501 nm. La percentuale di etichettatura è: (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58366/58366eq1.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima dell'esperimento, preparare la sospensione di nanoparticelle alla concentrazione desiderata utilizzando la soluzione PBS 1X.</li>
</ol>4. Zebrafish amputate e intubazione orale
<ol><li>Veloce il pesce (&gt; 0,5 g) almeno 48 h prima dell'esperimento per svuotare l'intestino.</li>
	<li>Spostare il pesce (12 pesce) per i carri armati sperimentali (6 L) una notte prima dell'esperimento per consentire acclimatazione12.</li>
	<li>Vortex la soluzione di nanoparticelle bene (ad esempio, 2.500 giri/min e 30 s) e aspirare il volume desiderato della sospensione delle nanoparticelle (ad es., 20 – 50 µ l) nella siringa all'ago protetto.</li>
	<li>Mettere il pesce in aerato 150mg/L MS-222 soluzione (vedere la sezione 2) finché non si depositano sul fondo del serbatoio e non rispondono ad un pizzico di pinna caudale; Questo processo richiede meno di 5 minuti.</li>
	<li>Rapidamente il pesce anestetizzato con una rete di trasferimento per un vassoio di plastica bagnato, orientano l'animale orizzontalmente per affrontare l'ago e avviare immediatamente l'intubazione orale.</li>
	<li>Accuratamente il pesce con una mano di sostegno e aprire la bocca con l'altra mano utilizzando l'ago protetto. Inserire delicatamente l'ago giù l'esofago a circa 1 cm dall'apertura della bocca. Nota: L'operatore può sentire una leggera resistenza quando alla fine della punta della pipetta ha superato la branchia. Fare attenzione a non la voce di ago troppo che può perforare la branchia di angolo.</li>
	<li>Iniettare lentamente la sospensione di nanoparticelle per il pesce. Assicurarsi che la sospensione non scorre verso l'esterno attraverso le branchie o la bocca.</li>
	<li>Rimuovere l'ago delicatamente e mettere il pesce nel serbatoio di recupero (Vedi sezione 2). Recupero richiede solitamente entro 1 min.</li>
	<li>Controllare il pesce con attenzione per qualsiasi anomalia (ad es., sanguinamento alle branchie è un segno di perforazione).</li>
	<li>Una volta il pesce hanno recuperato, restituirli ai serbatoi sperimentali.</li>
</ol>5. Zebrafish intestino dissezione
<ol><li>Dopo un periodo di tempo specificato post intubazione (ad es., 5h e/o 24 h), mettere il pesce usando una rete in 300 mg/L MS-222 soluzione per eutanasia (Vedi sezione 2). Assicurarsi che l'opercolo smette di muoversi e non c'è nessun riflesso di pizzico di coda. Cinque minuti è normalmente sufficiente.</li>
	<li>Pick up l'animale eutanasizzato con un netto e posizionarlo su una carta da filtro. Nota: La carta da filtro è molto utile per rimuovere il tessuto adesivo lungo l'intestino.</li>
	<li>Utilizzando le forbici dissezione tagliente, fare un'incisione semicircolare dall'ano per opercolo ed aperta con pinzette bene. Tagli entramba l'estremità dell'intestino, prendere fuori tutti gli organi interni e metterli su carta da filtro. Attenzione: Intervenire rapidamente per ridurre la morte e il metabolismo cellulare. Nota: In alternativa, rimuovere il tessuto adesivo in PBS e su ghiaccio.</li>
	<li>Separare l'intestino dagli organi interni facendo attenzione a mantenere il suo orientamento (anteriore al segmento intestinale posteriore) e allungarla. Di solito, il segmento anteriore dell'intestino è maggiore di segmento posteriore. Prendere cura di ottenere tutti dell'intestino quando di dissezione. Nota: L'estremità posteriore è abbastanza fine e fragile a piccoli pesci e può rompersi, particolarmente in animali &lt; 0,7 g.</li>
	<li>Rotolare l'intestino su carta da filtro con le pinzette per staccare l'adesivo tessuto dall'intestino.</li>
	<li>Procedere per preparare l'intestino per varie analisi a valle (sezioni 6, 7 e 8).</li>
</ol>6. preparazione di cellule intestinali per citometria a
<ol><li>Preparare in anticipo le aliquote di soluzione della collagenosi 0,15% (vedere paragrafo 2.4). Nota: Le aliquote devono essere a temperatura ambiente prima di procedere.</li>
	<li>Opzionale: Proseguendo dal passaggio 5.5, fessura aperta l'intestino longitudinalmente e lavare con PBS 1X.</li>
	<li>Utilizzando pinzette, posizionare l'intestino la provetta da centrifuga 2 mL riempita con soluzione di collagenasi di 0,15%.</li>
	<li>Disporre le provette in un rotatore di laboratorio verticale per 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Posizionare l'intestino su un colino di cella di 100 µm sostenuto sopra un tubo di centrifuga da 50 mL. Spezzare l'intestino con un pistone della siringa 5ml, lavare 3 volte con PBS 1X, raccogliendo il flusso attraverso il campione nella provetta centrifugo 50ml.</li>
	<li>Centrifugare la provetta da centrifuga 50 mL a 400 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Pipettare attentamente la maggior parte del surnatante pur non perdendo le cellule, alcune delle quali possono essere associati al muco.</li>
	<li>Risospendere le cellule intestinali in fondo della provetta da centrifuga con 500 µ l di PBS 1X e tenere il ghiaccio fino all'analisi di citometria a</li>
	<li>Filtro campioni attraverso un filtro a celle 30 µm in 5 mL rotondo fondo tubi per cytometry.</li>
	<li>Impostare i parametri (ad esempio, il numero di cellule per l'analisi, la regione di interesse, la tensione e la compensazione, selezione di rivelatori) su un citometro apparecchiature (Vedi materiali).</li>
	<li>Analizzare immediatamente le cellule su un citometro, seguendo le istruzioni di uso13.</li>
</ol>7. preparazione dell'intestino Cryosections per microscopia confocale
<ol><li>Riempire lo stampo di plastica (Vedi Tabella materiali) a metà del volume con temperatura di taglio ottimale (t.o.c.) composto.</li>
	<li>Proseguendo dal passaggio 5.5 e immediatamente dopo la dissezione, posizionare delicatamente l'intestino nella muffa di plastica. Assicurarsi che l'intestino è completamente incorporato nel o.c.t. compound. Se necessario, aggiungere altro o.c.t. compound per la muffa di plastica. Nota: È consigliabile posizionare l'intestino con una forma di "Z" in o.c.t. compound per seguire facilmente il suo orientamento naturale.</li>
	<li>Posizionare la muffa di plastica su ghiaccio secco finché non va opaco (meno di un minuto).</li>
	<li>Memorizzare la muffa di plastica a-80 ° C per uso a lungo termine o processo immediatamente utilizzando la procedura seguente. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Affettare l'intestino congelato in 10 µm sezioni o spessore appropriato utilizzando un criostato a-20 ° C.</li>
	<li>Raccogliere la sezione dell'intestino con un pennello sottile su un vetrino.</li>
	<li>Immergere il vetrino in 4% PFA per 15 min a temperatura ambiente per correggere l'esempio. Attenzione: PFA è tossico. Si prega di leggere il foglio di dati materiale di sicurezza prima di lavorare con esso. Guanti e occhiali di sicurezza devono essere indossati e lasciare sempre soluzioni all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Lavare il vetrino 3 volte con 1x PBS, 10 min ciascuno.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio e porre un coprivetrino sopra il preparato. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Osservare il campione al microscopio confocale a ingrandimento idoneo.</li>
</ol>8. preparazione dell'intestino per qPCR tempo reale (RT-qPCR)
<ol><li>Proseguendo dal passaggio 5.5, mettere l'intestino in un vial criogeniche e congelare rapidamente l'intestino in azoto liquido e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Per l'omogeneizzazione, aggiungere 200 µ l del 2% (v/v) refrigerati 1-Thioglycerol/omogeneizzazione soluzione (Vedi Tabella materiali) o soluzione alternativa omogeneizzazione al campione dell'intestino.</li>
	<li>Lavorare velocemente, omogeneizzare il campione dell'intestino sul ghiaccio con un omogeneizzatore laboratorio ad alta velocità (impostato a 25-30.000 giri/min) fino a nessun tessuto visibile rimangono frammenti. 3 volte per 5 s è solitamente sufficiente.</li>
	<li>Isolare il RNA usando uno spot kit (Vedi Tabella materiali) secondo istruzioni14 del produttore o un metodo alternativo adatto. Se necessario, conservare il RNA a-80 ° C per uso a lungo termine. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Quantificare la concentrazione di RNA usando un spettrofotometro15 e valutare la qualità utilizzando un analizzatore di RNA16.</li>
	<li>Preparare 1 µ g o una quantità appropriata di cDNA usando un kit di sintesi di cDNA secondo le istruzioni del produttore. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per analisi qPCR, si prega di seguire le linee guida MIQE17.</li>
	<li>Progettazione di coppie di primer appropriato per il gene/s di interesse.</li>
	<li>Selezionare un gene di riferimento adeguati e analizzare l'espressione di ogni gene tramite una rilevazione di RT-qPCR kit impianto utilizzando delle imprese (Vedi materiali). Nota: ad esempio, aggiungere 5 µ l di supermix SYBR green, 0,5 µ m di primer, 2,5 µ l di cDNA diluito e 1,5 µ l di acqua in un volume finale di 10 µ l per ciascun pozzetto della piastra di qPCR.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che non interessi concorrenti presenti.

Questo protocollo è un miglioramento della tecnica precedentemente descritta per intubazione orale di Collymore et al. 4 il nostro protocollo viene descritto in dettaglio il metodo di intubazione orale e prevede la preparazione dell'intestino per analisi successive. Il nostro metodo migliora la velocità di manipolazione di pesce permettendo una persona di svolgere l'intero protocollo rapidamente, senza molta variazione tra gli operatori. Una differenza principale del nostro protocollo con...

L'obiettivo di questo articolo è di descrivere in profondità un metodo semplice per intubazione orale di zebrafish, insieme a utili procedure associate a valle. Intubazione orale utilizzando zebrafish è diventato un modello pratico nello studio delle dinamiche di malattia infettiva, orale vaccino/immunostimolante, droga/nanoparticella assorbimento e l'efficacia e l'immunità mucosa intestinale. Ad esempio, intubazione orale zebrafish è stato utilizzato nello studio di infezione da Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. anche usato con successo questo modello per fornire le nanoparticelle e M. marinum a tratto gastro-intestinale di zebrafish adulto2. Inoltre, Chen et al. usato intubazione orale zebrafish per mostrare che farmaci incapsulati da nanoparticelle, quando somministrata tramite il tratto gastro-intestinale, sono stati trasportati attraverso il sangue del cervello barriera3. Questi autori hanno effettuato intubazione sulla base del metodo di gauvage descritto da Collymore et al. 4 con alcune modifiche. Tuttavia, non forniscono un protocollo altamente dettagliato che descrive la procedura di intubazione orale. Qui, presentiamo un metodo per intubazione orale di zebrafish adulto sulla base di Collymore et al. 4 includiamo ulteriormente la preparazione dell'intestino per rilevanti dell'analisi a valle da cytometry, microscopia confocale e qPCR.
L'intestino e particolarmente relativo mucosa è la prima linea di difesa contro le infezioni e il sito primario di assorbimento dei nutrienti5. Quando le cellule epiteliali e cellule presentanti l'antigene all'interno della mucosa barriere percepiscono segnali di pericolo, viene attivata un'immediata risposta immunitaria innata. Successivamente, la risposta immunitaria adattativa altamente specifica è stabilita da T e B linfociti6,7. Sviluppo di vaccini orali è una area di interesse attuale in vaccinologia. Tali vaccini sarebbe uno strumento efficace per proteggere l'organismo in luoghi esposti a causa della risposta specifica delle cellule immunitarie nei tessuti linfoidi mucosa-collegato (malto)8,9. In acquacoltura, vaccini mucosali hanno evidenti vantaggi rispetto ai vaccini iniettabili. Sono pratici per la vaccinazione di massa, meno laborioso, sono meno stressanti per i pesci e può essere somministrati ai pesci giovani. Tuttavia, mucosa vaccini candidati devono raggiungere il secondo segmento di intestino senza essere denaturato nell'ambiente orale. Anche devono passare le barriere della mucosa per avere accesso alle cellule (APC) per indurre risposte locali e/o sistemica10presentanti l'antigene. Quindi, test di assorbimento della mucosa raggiunto dagli antigeni orali candidati e loro sistemi di consegna, così come la risposta immunitaria evocata, è essenziale nello sviluppo di vaccini orali.
In un contesto biomedico, sviluppando un modello per testare gli effetti biologici dei composti dopo intubazione orale è di crescente interesse. Molte delle caratteristiche anatomiche e fisiologiche dell'intestino sono conservate tra Spriggina lignaggi, con mammiferi e pesci ossei11. Questo modello di intubazione orale collegato alla analisi a valle può essere uno strumento per fornire intuizioni in biologia umana, così come un terreno di sperimentazione per biologics o altri composti in vivo.
Il protocollo di intubazione orale può essere eseguito da un operatore, ad esempio, amministrare con successo fino a 50 µ l della sospensione di nanoparticelle proteina a pesare 1 g, con un alto tasso di sopravvivenza di pesce. La procedura è semplice da impostare e veloce; 30 pesci possono essere intubati in 1h. Il protocollo per la preparazione dell'intestino è fondamentale per fornire campioni di cellule e tessuti di qualità per la successiva analisi. Esempi di risultati a valle sono dati che mostrano la utilità del protocollo nell'ottenere i dati relazionati all'assorbimento intestinale e nell'isolamento del RNA di qualità per qPCR. Il protocollo sarebbe di grande utilità per coloro che necessitano di un modello adatto per testare le dinamiche della profilassi orale o altri composti nell'intestino.

<table><tbody><tr><td>Tubo in silicone</td><td>Dow Corning</td><td>508-001</td><td>0,30 mm di diametro interno e 0,64 mm di diametro esterno</td></tr><tr><td>Ago Luer lock</td><td>Hamilton</td><td>7750-22</td><td>31 G, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Luer lock siringa</td><td>Hamilton</td><td>81020/01</td><td>100 &mu; L, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta filtrato</td><td>Nerbe Plus</td><td>07-613-8300</td><td>10 &mu; L</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>polvere</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro&nbsp;</td><td>Filter-Lab</td><td>RM14034252</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Aquila di Dulbecco modificata media</td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Filtri CellTrics&nbsp;</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326 (Wolflabs)</td><td>30 &micro; m filtri a maglie con serbatoio da 2 mL</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stampi in plastica per criosezioni</td><td>SAKURA</td><td>4557</td><td>Stampi monouso in vinile. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Thermo Scientific</td><td>10149870</td><td>Vetrino SuperFrost Plus</td></tr><tr><td>Coprivetri</td><td>Labbox&nbsp;</td><td>COVN-024-200</td><td>24&acuto; 24 mm</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Atto-488 NHS estere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41698</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td></td></tr><tr><td>1-Tiogliceriolo/Omogeneizzazione soluzione</td><td>Promega</td><td>all'interno del kit di tessuto Maxwell RSC simplyRNA con l'aggiunta di</td><td>20 &mu; l Soluzione di omogeneizzazione da 1-tioglicerolo a 1 mL (2%)</td></tr><tr><td>rotatore verticale da laboratorio&nbsp;</td><td>Suministros Grupo Esper</td><td>10000-01062</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>CM3050S KINEMATICA</td><td>Polytron PT1600E</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACS Canto</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubo a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Cappa aspirante</td><td>Kottermann</td><td>2-447 BST</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Spettrofotometro</td><td>ND-1000</td></tr><tr><td>Sistema di bioanalizzatore Agilent 2100</td><td>Agilent</td><td>G2939A</td><td>Bioanalizzatore di RNA</td></tr><tr><td>Maxwell Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 PCR in tempo reale&nbsp; Sistema di rilevamento</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>iTaq universale SYBR Green Supermix kit</td><td>Bio-rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Acqua&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Fiala criogenica&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td>Fiala CryoTube</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td>Fluoroshield con DAPI</td></tr></tbody></table>

intubazione orale di zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Maggior parte dei patogeni invadono gli organismi attraverso loro mucosa. Questo è particolarmente vero nei pesci come sono continuamente esposti a un ambiente microbico-ricco di acqua. Lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna orale di immunostimolanti o vaccini, che attivano il sistema immunitario contro le malattie infettive, è altamente auspicabile. Nell'elaborazione di strumenti profilattici, buoni modelli sperimentali sono necessari per testare le loro prestazioni. Qui, vi mostriamo un metodo per intubazione orale di zebrafish adulto e una serie di procedure per sezionare e preparare l'intestino cytometry, microscopia confocale e l'analisi quantitativa della polimerasi reazione a catena (qPCR). Con questo protocollo, precisamente possiamo erogare volumi fino a 50 µ l a pescare circa 1 g di peso semplicemente e rapidamente, senza danneggiare gli animali. Questo metodo ci permette di esplorare l'assorbimento diretto in vivo di composti fluorescente etichettati da mucosa intestinale e la capacità immunomodulatoria di tali farmaci biologici nel sito locale dopo intubazione. Combinando metodi a valle come flusso cytometry, istologia, qPCR e microscopia confocale del tessuto intestinale, possiamo capire come immunostimolanti o vaccini sono in grado di attraversare le barriere della mucosa intestinale, passano attraverso la lamina propria, e raggiungere il muscolo, esercitando un effetto sul sistema immunitario della mucosa intestinale. Il modello potrebbe essere utilizzato per testare i sistemi di consegna e profilassi orale candidato o l'effetto locale di qualsiasi composto bioactive oralmente amministrato.

Zebrafish (peso medio: 1,03 ± 0,16 g) di sesso misto con successo sono stati intubati con nanoparticelle di differenti della proteina ricombinante (corpi di inclusione batterici) utilizzando il nostro dispositivo di intubazione orale fatto in casa (Figura 1). Abbiamo correttamente eseguita l'intubazione orale e raggiunto un tasso di mortalità basso percentuale media (6,8%) (Tabella 1). Zebrafish erano sia intubati con 30 µ l o 50 µ l di sospe...

Il protocollo descrive intubating zebrafish adulto con un biologico; quindi di dissezione e preparando l'intestino per citometria, microscopia confocale e qPCR. Questo metodo consente la somministrazione di composti bioattivi per monitorare l'assorbimento intestinale e lo stimolo immune locale evocato. È rilevante per il test la dinamica intestinale di profilassi orale.

Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia della mucosa, come come i composti biologici di assorbimento della mucosa intestinale e come tali biologici modulano il sistema immunitario nel sito locale dopo l'intubazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice da configurare, velocemente, e mostra bassi tassi di mortalità. Questo metodo può fornire informazioni sulla vaccinologia della mucosa.Può anche essere applicato ad altri composti, come sostanze chimiche, sostanze tossiche o agenti patogeni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto nei passaggi di intubazione orale e dissezione intestinale, è necessario fare attenzione perché nell'intubazione si potrebbe ferire il pesce zebra e causare la morte. Nella dissezione, la fine dell'intestino è molto fine e fragile.Posizionare circa un centimetro di tubi in silicone fine su un ago Luer-lock calibro 31. Tagliare una punta sterile del filtro a 10 microliter, prendere l'estremità più fine e posizionarla sopra il tubo di silicone come una torcia. Per iniziare, attaccare l'apparato dell'ago a una siringa Luer-lock da 100 microliter.In primo luogo, spostare il pesce nei serbatoi sperimentali una notte prima dell'esperimento. Vortice bene la soluzione di nanoparticella preparata e redigere il volume desiderato della sospensione. Dopo aver anestetizzato in modo sicuro il pesce, utilizzare una rete per trasferire rapidamente il pesce su un vassoio di plastica bagnato.Orientare l'animale orizzontalmente per affrontare l'ago. Sostenere attentamente il pesce con una mano e aprire la bocca con l'ago protetto. Quindi, inserire delicatamente l'ago lungo l'esofago a circa un centimetro dall'apertura della bocca.È difficile capire fino a che punto dovrebbe andare l'ago, e questa è una questione di pratica. Sentirai l'ago mentre trova un arresto, e quindi manipolando l'ago, troverai l'angolo corretto per inserire un po 'di più il dispositivo. Iniettare lentamente la sospensione della nanoparticella nel pesce, assicurando che la sospensione non fluisca verso l'esterno attraverso le branchie o la bocca.Dopo questo, rimuovere delicatamente l'ago e posizionare il pesce in un serbatoio di recupero. Mentre il pesce si riprende, monitorare il pesce per eventuali anomalie. Una volta recuperato il pesce, restituirlo a uno dei serbatoi sperimentali.Dopo aver eutanasiato il pesce secondo il protocollo di testo, posizionare il pesce su un pezzo di carta da filtro. Usando forbici a dissezione affilate, fare un'incisione semicircolare dall'ano all'opercolo e aprire l'incisione con pinzette fini. Quindi, tagliare entrambe le estremità dell'intestino, estagliare tutti gli organi interni e posizionarli sulla carta da filtro.Successivamente, separare l'intestino dagli organi interni e allungarlo, facendo attenzione a ottenere tutto l'intestino. Infine, utilizzare le pinzette per arrotolare l'intestino sulla carta filtrante per staccare il tessuto adesivo. Utilizzando questo protocollo, i pesci zebra del sesso misto sono stati intubati con successo con diverse nanoparticelle proteiche ricombinanti.Utilizzando il dispositivo di intubazione orale fatto in casa, è stata raggiunta una bassa percentuale media di mortalità. Per valutare la consegna dei corpi di inclusione delle nanoparticelle fluorescenti realizzati con TNF alpha ricombinante, è stata eseguita un'analisi della citometria. La quantità totale di cellule fluorescenti era significativamente più alta nel gruppo intubato con nanoparticelle rispetto al gruppo di controllo sia cinque che 24 ore dopo l'intubazione.L'attrezzatura di intubazione è economica, precisa e riutilizzabile. L'intera procedura di intubazione può essere eseguita molto rapidamente da un operatore e, cosa importante, il metodo è coerente tra diversi operatori. La combinazione del nostro metodo di intubazione con l'analisi a valle potrebbe essere ideale per lo sviluppo di vaccini orali.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l'uso di acqua fredda come anestetico.

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Presentiamo un nuovo metodo di microsonda gastrica per i pesci zebra larvali che utilizza attrezzature standard per microiniezioni di embrioni e stereomicroscopia. Dimostriamo che la microsonda gastrica è una tecnica sicura ed efficiente, utile per somministrare quantità controllate di diversi materiali direttamente nella cavità intestinale delle larve di pesce zebra.

Microgavage di larve Zebrafish

Questo video descrive la tecnica di isolamento dell'intestino per valutare l'assorbimento intestinale di composti bioattivi. In questo campione, isoleremo l'intestino di un pesce zebra adulto per analizzare l'assorbimento di immunostimolanti.

Dissezione intestinale adulta di pesce zebra: una tecnica per analizzare l'assorbimento dei composti

Questo video dimostra una tecnica per intubare oralmente il pesce zebra adulto per somministrare composti sperimentali nell'esofago e monitorare il loro assorbimento intestinale. Questo metodo offre un modello prezioso per studiare la dinamica della profilassi orale o di altri composti all'interno dell'intestino.

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Il crescente utilizzo di zebrafish come modello animale richiede lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna di quantità note di composti e soluzioni. La procedura descritta di seguito gavage consente la somministrazione orale di volumi precisi di soluzione affidabile, sicuro ed efficiente per zebrafish adulto.

Gavaging Zebrafish adulti

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare il tempo di transito di fluorescente contrassegnato cibo attraverso l'intestino di zebrafish larvale in modo elevato throughput.

High-throughput misurazione del tempo di transito dell'intestino utilizzando Zebrafish larvale

Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.

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Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato ed efficace per l'iniezione endovenosa di cellule o agenti farmacologici in zebrafish adulto, con conseguente aumento dell'attecchimento cellulare e aumento dei tassi di sopravvivenza del zebrafish trattato.

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Questo protocollo presenta un metodo accessibile per creare un ambiente a tenuta di gas per somministrare anestetici volatili a larve di pesce zebra per esperimenti comportamentali.

Somministrazione di anestetici volatili a larve di pesce zebra per l'osservazione comportamentale

Questo studio presenta un metodo di alimentazione a base di gelatina che consente una somministrazione orale precisa, non invasiva e basata sulla massa corporea di farmaci negli adulti di pesce zebra. Il protocollo dimostra un'accettazione affidabile del feed e, come prova di principio, la consegna riuscita di MK-801, che ha portato agli effetti comportamentali attesi.

Un approccio semplice e preciso basato su mangimi per la somministrazione orale di farmaci nei pesci

Scopri l'intubazione orale di zebrafish adulti per studiare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive e la risposta immunitaria locale. Questo metodo semplice e veloce offre bassa mortalità e applicazioni in vaccinologia mucosa.

Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive

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