Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della sintesi peptidica come sintetizzare peptidi ricchi di disolfuro e determinare il loro corrispondente modello di ponte disolfuro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la sintesi selettiva di diversi isomeri peptidici bondend disolfuro e la loro successiva caratterizzazione chimica e strutturale. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché ogni peptide ricco disolfuro si comporta in modo diverso.

La sintesi e l'analisi possono essere parzialmente ottimizzate per i singoli peptidi o proteine. Trasferire i reagenti elencati nel protocollo di testo ai recipienti corrispondenti e metterli nelle racchette appropriate del sintetizzatore peptidico in fase solida. Quindi, aggiungere 100 milligrammi di resina secca alle colonne di reazione e metterli nella racchetta del sintetizzatore.

Avviare la sintesi peptidica in fase solida come descritto nel protocollo di testo. Al termine della sintesi, la resina è stata lofilizzata durante la notte. Ora scindere il peptide dalla resina ed eseguire una protezione profonda delle catene laterali.

Per fare ciò unire la resina essiccata in un tubo da 12 millilitri e raffreddarla a zero gradi Celsius sul ghiaccio. In primo luogo, aggiungere 150 microlitri di una miscela di spazzini, quindi aggiungere un millilitro di acido trifluoroacetico al 95% per 100 milligrammi di resina. Lasciare la miscela tremare delicatamente per tre ore a temperatura ambiente.

Ora, filtra la miscela attraverso una fritta di vetro. Raccogliere il filtrato in tubi, riempito singolarmente con etere dietile ghiacciato in un millilitro di miscela di scissione per otto-10 millilitri di etere dietile. Il peptide precipita come un solido bianco.

Dopo aver risciacquato e centrifugato i tubi come descritto nel protocollo di testo, congelare i peptidi. Per purificare il precursore lineare con cromatografia semi preparativa aggiungere circa 70 milligrammi del peptide grezzo a un tubo da 15 millilitri. Quindi sciogliere il peptide grezzo in 0,1%TFA e acetonitrile uno-a-uno in acqua.

Separare la miscela peptidica utilizzando un gradiente da zero al 50%Eluente B per 120 minuti a una portata di 10 millilitri al minuto. Raccogliere le frazioni nei singoli tubi così come appaiono e preparare frazioni selezionate per la spettrometria di massa e l'analisi HPLC come descritto nel protocollo di testo. Congelare le frazioni e combinare le frazioni peer.

Inizia la formazione selettiva di legami disolfuro eseguendo la prima ossidazione. Per fare ciò, sciogliere 15 milligrammi del peptide lineare liofilizzato in 105 millilitri di una miscela di acqua isopropanolo. Lasciare la miscela mescolando sull'aria in condizioni di base per 12-48 ore.

La procedura di ossidazione graduale è molto critica. I controlli di reazione sono presi in tutte e tre le fasi di ossidazione per garantire una formazione ricca di disolfuro individuale. La terza ossidazione è la più cruciale perché il rimescolamento del disolfuro può verificarsi quando viene superato il tempo di reazione ottimale.

Ora esegui la seconda ossidazione. Sciogliere 15 milligrammi del peptide liofilizzato in 105 millilitri di un'acqua isopropanolo, una miscela di acido cloridrico molare. Aggiungere alla soluzione 158 microlitri di una soluzione di iodio molare 0,1 in metanolo.

Mescolare la reazione a temperatura ambiente fino al completamento dell'ossidazione. Quindi interrompere la reazione aggiungendo 79 microlitri di un acido ascorbico molare nell'acqua. Infine eseguire la terza ossidazione.

Sciogliere 15 milligrammi del peptide liofilizzato in 5,5 millilitri di TFA contenenti una miscela di spazzini. Precipitare il peptide in tubi contenenti etere dietile freddo ad un millilitro di soluzione di reazione per otto-dieci millilitri di etere dietile. Per eseguire la purificazione peptidica a 15 milligrammi del prodotto grezzo liofilizzato in un tubo da 15 millilitri.

Sciogliere il prodotto grezzo nel volume del ciclo campione HPLC utilizzando una miscela di 0,1%TFA e uno a uno Acetonitrile in acqua. Dopo aver vortice fino alla completa dissoluzione, centrifugare la soluzione da un minuto a 3400 volte G.Redigere la miscela da 3,6 millilitri in una siringa da 5 millilitri e iniettare il campione senza bolle d'aria nel circuito di iniezione. Avviare l'iniezione nel sistema HPLC.

Purificare la miscela peptidica utilizzando un gradiente da zero al 50%Eluente B per 120 minuti a una portata di 10 millilitri al minuto. Raccogliere le frazioni nei singoli tubi così come appaiono. Al termine dell'esecuzione, preparare le frazioni selezionate per l'analisi MS e HPLC come descritto nel testo.

Congelare tutte le frazioni e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Per eseguire HPLC analitici, trasferire campioni delle frazioni peptidiche o dei controlli di reazione in un flaconcino HPLC e scioglierlo nella miscela di 0,1%TFA in acetonitrile uno a uno in acqua. Posizionare il flaconcino HPLC nel campionatore automatico dell'HPLC in fase inversa analitica impostato per iniettare 250 microlitri di ciascun campione.

Utilizzare un sistema di eluizione sfumato dello 0,1%TFA in acqua come Eluente A nello 0,1%TFA in Acetonitrile come Eluent B.Analizzare il peptide utilizzando un gradiente dal 10% al 40%Eluent B per 30 minuti con una portata di 1,0 millilitro al minuto. Per eseguire l'analisi degli amminoacidi, trasferire 100 microgrammi del peptide puro in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri e sciogliere la polvere in 200 microlitri di sei HCL molare. Dopo aver trasferito la soluzione in un'ampola di vetro, chiudere l'ampola riscaldando il collo con una fiamma del bruciatore bunsen.

Quindi posizionare un tubo di vetro che tiene l'ampola in un blocco riscaldante per 24 ore a 110 gradi Celsius per l'idrolisi. Dopo 24 ore, aprire l'ampola e trasferire la soluzione in un tubo di micro-centrifuga a due millilitri. Centrifugare la soluzione per sei ore a sessanta gradi Celsius e 210 volte G in un concentratore a vuoto rotazionale.

Quindi sciogliere il prodotto idrolizzato in 192 microlitri del tampone di diluizione campionato e trasferire la soluzione in un filtro micro centrifugo. Dopo aver centrifugato il campione per un minuto a 2300 volte G, trasferire 100 microlitri del filtrato in un tubo campione di analisi degli amminoacidi. Posizionare il tubo nell'analizzatore di amminoacidi e avviare l'analisi.

Durante questo precedente protocollo di riduzione, è fondamentale adottare diversi controlli di reazione per ottenere due o quattro volte le specie metilate kappa mido indispensabili per la successiva analisi del disolfuro attraverso la spettrometria di massa. Sciogliere prima 600 microgrammi del peptide puro in 1,2 millilitri di tampone di citrato molare 0,05 contenente TCEP. Incubare la miscela a temperatura ambiente prendendo diversi campioni di controllo della reazione di 100 microliter che vanno da zero a 30 minuti.

Mescolare i campioni in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri con 300 microlitri di tampone di alchilazione per interrompere la reazione ed eseguire la metilazione carbonile dei gruppi tioli liberi. Interrompere la reazione dopo cinque minuti aggiungendo 100 microlitri di 10%TFA e acqua e conservare i campioni su ghiaccio secco. Ora esegui HPLC sugli esempi come descritto nel protocollo di testo.

Trasferire una piccola quantità di ogni frazione raccolta in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri per l'analisi MS/MS delle forme ossidate. Sciogliere il peptide rimanente nello 0,1%TFA in acqua e aggiungere un volume appropriato su una soluzione TCEP da 100 millimolare per ottenere una concentrazione finale di TCEP di 10 millimolare. A questo punto, l'alchilazione selettiva della cisteina può essere controllata tramite sequenziamento peptidico.

Con i due peptidi al centro, è possibile determinare il modello del ponte disolfuro. L'analisi NMR dei diversi isomeri viene effettuata per rivelare le singole strutture peptidiche. Vengono mostrate le 20 strutture con le energie più basse e la connettività disolfuro dei diversi isomeri.

In particolare, è necessaria una combinazione di frammentazione HPLC MS/MS in fase invertita e analisi NMR per identificare in modo inequivocabile la connettività del disolfuro. Il confronto del valore di deviazione quadratica media della radice ha chiarito che un peptide rigido porta principalmente a una struttura NMR meglio risolta. Questo video dovrebbe darti un esempio su come sintetizzare selettivamente peptidi con un modello di legame disolfuro desiderato.

Mostra anche la possibilità di verificare la corretta connettività del disolfuro tramite la spettrometria di massa tenera e di ottenere una struttura tridimensionale tramite spettroscopia NMR. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della sintesi peptidica per esplorare l'importanza dei modelli di legame disolfuro per la struttura tridimensionale e di conseguenza l'attività di tali isomeri peptidici. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'attività ASAS possono essere eseguiti al fine di ottenere informazioni sulle relazioni di attività della struttura di diversi isomeri peptidici al bersaglio biologico specifico.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla sintesi e l'analisi delle conotossine, può anche essere applicato ad altri peptidi e proteine del ponte disolfuro come i fenzen, le tossine animali ricche di disolfuro e altre molecole contenenti cisteina multipla.