Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu
28 settembre 2018
Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione e l'organizzazione dinamica dei complessi proteici fotosintetici nella membrana tilacoide delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi delle interazioni funzionali tra complessi proteici nativi e chiarisce la plasticità dell'organizzazione complessa proteica in diverse condizioni ambientali. Impostare la seghettatrice in gel di otto centimetri per piastre di 10 centimetri secondo le istruzioni del produttore utilizzando distanziale da 0,75 millimetri.
Posizionare un miscelatore sfumato su una piastra di agitazione e collegarlo alla pompa peristaltica mediante tubi. Attaccare un ago della siringa all'altra estremità del tubo e posizionare l'ago tra il vetro e la piastra di alluminio. Posizionare un agitatore magnetico nella camera pesante.
Preparare soluzioni di acrilammide al 3,5% e al 12,5% in tubi di centrifuga conica da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo da utilizzare per il gradiente del gel di separazione. Per evitare una polimerizzazione inteme mantenere i tubi di centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni. Aggiungere 5%APS e TEMED subito prima di pippetting le soluzioni al mixer sfumato.
Pipettare le soluzioni al 12,5% alla camera pesante. Rimuovere le bolle d'aria dal canale che collega la camera leggera e pesante aprendo la valvola che collega le due camere consentendo alla soluzione di entrare nella camera luminosa. Chiudere la valvola e pipettare le tracce di soluzione alla camera pesante.
Infine, pipettare la soluzione al 3,5% alla camera luminosa. Accendere l'agitatore magnetico. Aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica.
Consentire alle soluzioni in gel di fluire tra il vetro e la piastra di alluminio a una portata di circa 0,5 millilitri al minuto. L'ago deve essere sempre sopra il liquido. Quando le camere pesanti e leggere si sono svuotate riempirle di acqua ultrapura.
E lasciare che l'acqua sovrapponga delicatamente la superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa una o due ore a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di acrilammide al 3% per il gel impilabile a temperatura ambiente.
Pipettare il gel impilamento sopra il gel di separazione polimerizzato e posizionare un pettine di gel campione tra il vetro e la piastra di alluminio evitando bolle d'aria. Dopo aver permesso al gel di polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il pettine sotto acqua ultrapura. A questo punto il gel può essere conservato a quattro gradi Celsius positivi in condizioni umidi per alcuni giorni.
Diluire i thylakoidi isolati con tampone ghiacciato 25BTH20G a una concentrazione finale di clorofilla di un milligrammo per millilitro. Preparare due tubi per ogni campione di tilacoide per eseguire la solubilizzazione sia beta-DM che digitonina. Ora aggiungi un volume uguale di tampone detergente.
Mescolare delicatamente il detersivo e il campione di thylakoid con una pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. Solubilizzare i thylakoids per due minuti sul ghiaccio per la solubilizzazione in beta-DM. Oppure 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione delicata continua su un rocker o uno shaker per la solubilizzazione della digitonina.
Dopo l'incubazione, rimuovere il materiale insolubilizzato mediante centrifugazione a 18.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius positivi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 1/10 di volume di tampone blu brillante Coomassie al campione. Impostare il gel in un sistema di elettroforesi verticale.
Riempire la camera tampone superiore con tampone catodico blu e versare il tampone anodo nella camera tampone inferiore. Caricare i campioni di tilacoide nei pozzi. Avviare l'elettroforesi e aumentare gradualmente la tensione elencata nel protocollo di testo.
Eseguire il gel a quattro gradi Celsius positivi utilizzando una stanza fredda o regolando la temperatura del gel con un sistema di raffreddamento. Cambiare il buffer del catodo blu in un tampone catodo chiaro quando il fronte del campione è migrato circa 1/3 del gel. Dopo l'esecuzione elettroforetica eseguire la scansione del gel con uno scanner fotografico per l'archiviazione delle immagini.
Per eseguire 2-SDS PAGE assemblare il sistema di elettroforesi verticale utilizzando distanziali di un millimetro. Preparare un gel SDS standard con un pettine 2D come descritto nel protocollo di testo. Tagliare la corsia dal gel BN e posizionarla in un tubo da cinque millilitri.
Quindi aggiungere due millilitri di tampone Laemmli e incubare la striscia per 45 minuti con tremori delicati a temperatura ambiente. Posizionare la corsia con l'aiuto di un distanziale sopra il gel evitando bolle d'aria. Pipettare cinque microlitri di marcatore di peso molecolare su uno stretto pezzo di carta da filtro e posizionare la carta nel pozzo standard.
Per sigillare la striscia di gel BN e la carta marcatore versare uno 0,5% di agarosio nel tampone di corsa sopra la striscia di gel e consentirgli di solidificarsi. Eseguire l'elettroforesi secondo i protocolli standard. Dopo la corsa elettroforetica visualizzare le proteine con colorazione SUPRO Ruby o colorazione argento.
Qui sono riportati i risultati rappresentativi dei modelli complessi di proteine tilacoidi di campioni beta-DM e solubilizzati con digitonina. I piccoli complessi migrano più velocemente durante la corsa elettroforetica e si trovano quindi nella parte inferiore del gel. Mentre i grandi complessi si trovano nella parte superiore del gel.
La digitonina generalmente conserva i complessi proteici in gruppi più grandi, mentre il beta DM interferisce con le interazioni proteina-proteina labile tra i complessi. Qui viene presentata la composizione subunità dei complessi proteici dei tilakoidi beta-DM e solubilizzati in digitonina. Le sottounità di ogni complesso si trovano dalla linea verticale sotto il complesso allineato.
In linea di principio, ogni punto nel gel 2D rappresenta una singola proteina. Ma in pratica, diverse proteine della stessa massa molecolare possono essere presenti in un singolo punto. L'identificazione delle macchie si basa sull'analisi della spettrometria di massa.
Dopo aver applicato questa procedura si può continuare con altri metodi come la microscopia elettronica e l'analisi di singole particelle dei complessi proteici eluitati dal gel nativo blu al fine di ottenere intuizioni strutturali sui complessi proteici. Per identificare subunità proteiche sconosciute le singole macchie proteiche da SDS PAGE bidimensionali possono essere analizzate con specifiche di massa. Non dimenticare che lavorare con acrilammide e digitonina può essere estremamente dannoso e precauzioni come indossare guanti protettivi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per analizzare l'organizzazione e la composizione dei complessi proteici dei tilacoidi vegetali utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni native con colorante blu (BN-PAGE) e la 2D-SDS-PAGE. Benché ottimizzato per Arabidopsis thaliana, il metodo può essere adattato ad altre specie vegetali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Fotosintesi
- Analisi dei complessi proteici
Sfondo
- Comprendere la composizione dei complessi proteici fotosintetici è fondamentale per la biologia vegetale.
- Le membrane tilacoidali svolgono un ruolo chiave nella fotosintesi.
- L'organizzazione dei complessi proteici può variare in diverse condizioni ambientali.
- La BN-PAGE consente l'analisi di complessi proteici nativi.
Scopo dello studio
- Chiarire l'organizzazione e la composizione dei complessi proteici tilacoidi.
- Studiare le interazioni funzionali tra i complessi proteici.
- Valutare la plasticità dell'organizzazione dei complessi proteici.
Metodi Utilizzati
- Elettroforesi su gel di poliacrilamide nativa blu (BN-PAGE)
- Elettroforesi SDS-PAGE bidimensionale (2D-SDS-PAGE)
- Configurazione del mescolatore di gradienti per la preparazione del gel
- Utilizzo di pompa peristaltica e agitatore magnetico per la realizzazione del gel
Risultati principali
- Il protocollo rivela con successo la composizione dei complessi proteici tilacoidali.
- È possibile analizzare le interazioni funzionali tra complessi proteici nativi.
- È possibile valutare l'organizzazione dinamica dei complessi proteici in condizioni variabili.
- È confermata l'adattabilità del metodo a diverse specie vegetali.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni sull'organizzazione dei complessi proteici fotosintetici.
- Migliora la comprensione dell'adattabilità delle proteine vegetali ai cambiamenti ambientali.
- Il protocollo può rappresentare uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia vegetale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la composizione e l'organizzazione dinamica dei complessi proteici fotosintetici fornisce informazioni meccanicistiche sui percorsi di conversione dell'energia rilevanti per lo sviluppo di prodotti di origine biologica. L'elettroforesi nativa in gel in presenza di colorante blu (Blue native PAGE) consente l'analisi delle interazioni funzionali di assemblaggi nativi multiproteici, supportando la validazione degli obiettivi nei sistemi fotosintetici. Questo metodo aiuta a ridurre i rischi associati a ipotesi in fase iniziale chiarificando la stabilità e le interazioni dei complessi in condizioni ambientali variabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche risolvendo la composizione dei complessi proteici nativi e l'organizzazione delle subunità nelle membrane tilacoidali.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione diretta della plasticità e stabilità dei complessi in condizioni controllate di solubilizzazione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo interazioni proteina-proteina stabili da quelle labili, utilizzando detergenti a base di digitonina o beta-DM.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del Saggio: Prepara complessi tilacoidi solubilizzati per l'analisi successiva mediante separazione standardizzata tramite BN-PAGE con profili di migrazione riproducibili.
- Output Quantitativo: Genera profili di complessi risolvibili che permettono il confronto tra stati di assemblaggio in diverse condizioni sperimentali.
- Riutilizzo della Piattaforma: Consente un'analisi successiva mediante 2D-SDS-PAGE per l'identificazione delle subunità, ampliando l'utilità oltre il profilo iniziale dei complessi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega l'organizzazione complessa a livello di scoperta all'output fotosintetico funzionale in condizioni di stress ambientale variabile.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce come le perturbazioni ambientali influenzino l'assemblaggio dei supercomplessi, fornendo informazioni per modelli predittivi sulla robustezza del percorso.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette il monitoraggio della dissociazione o del riasssemblaggio dei complessi come possibili indicatori dell'efficienza fotosintetica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta in cui è richiesta l'integrità del complesso nativo prima di un'analisi riduzionista, consentendo il passaggio dall'isolamento degli organelli all'indagine funzionale e al seguito strutturale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'integrità della catena di trasporto degli elettroni fotosintetica risolvendo i complessi PSII, PSI, Cyt b6f e ATPasi in forma nativa.
- Screening: Fornisce profili di complessi pronti per il saggio con risoluzione quantitativa delle bande, per l'analisi comparativa degli effetti della solubilizzazione con detergenti.
- Analisi: Genera letture basate sulla migrazione che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare stabilità e abbondanza dei complessi in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l'organizzazione dei complessi alla funzione fotosintetica, fornendo un collegamento con gli esiti fenotipici in condizioni di stress.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo dei complessi di proteine di membrana nei sistemi vegetali, adattabile ad altre specie con modifiche al protocollo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'attendibilità predittiva nella validazione degli obiettivi preservando le interazioni native e chiarificando le dinamiche complesse.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso la preparazione di gel con gradiente e una separazione elettroforetica riproducibile a temperatura controllata.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'ingegnerizzazione dei percorsi fotosintetici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi in base a profili complessi di stabilità e interazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella solubilizzazione delle proteine di membrana e nelle tecniche elettroforetiche native.
- È dipendente da un mescolatore di gradienti, una pompa peristaltica e sistemi elettroforetici verticali con controllo della temperatura.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di solubilizzazione con detergenti (beta-DM vs digitonina) per garantire la conservazione riproducibile dei complessi.
- Comprende considerazioni di adattamento per diverse specie vegetali a causa delle variazioni nella composizione delle membrane tilacoidali.
- Incluse limitazioni pratiche, come la destabilizzazione dei complessi labili da parte del beta-DM e la necessità di compatibilità con camere fredde o sistemi di raffreddamento durante l'elettroforesi.
