Name: Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Impara ad analizzare i complessi proteici dei tilacoidi vegetali mediante elettroforesi nativa blu (BN-PAGE) e SDS-PAGE bidimensionale. Questo metodo ottimizzato per Arabidopsis thaliana rivela l'organizzazione dinamica dei complessi fotosintetici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dall'Accademia di Finlandia (numeri di progetto 307335 e 303757) ed energia solare nell'accordo di sovvenzione di biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Il protocollo si basa sul riferimento3.

1. preparazione BN Gel1,2,3
<ol><li>Impostare la colata di gel con piastre di 8 x 10 cm (rettangolare in vetro e piastra dentellata allumina) secondo le istruzioni del produttore mediante distanziali di 0,75 mm.</li>
	<li>Posizionare un gradiente mixer su un piatto di mescolare e collegarlo con la pompa peristaltica di una tubazione. Collegare una siringa a altra estremità del tubo e inserire l'ago tra la piastra di vetro e alluminio. Agitatore magnetico posto il "pesante" (H)-camera.</li>
	<li>Preparare il 3,5% (v/v) e del 12,5% (v/v) soluzioni di acrilamide (AA) in provette coniche da 15 mL per la sfumatura di gel di separazione (Vedi ricette in tabella 1). Per evitare la polimerizzazione prematura, mantenere le provette da centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni. Attenzione: L'acrilammide è neurotossico e cancerogeno, indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
	<li>Aggiungere 5% APS e TEMED diritto prima di pipettaggio le soluzioni al mixer del gradiente. Dispensare la soluzione di 12,5% per la camera-H.<ol>
<li>Rimuovere le bolle d'aria dal canale di collegamento tra la "luce" (L) e la H-Camera aprendo la valvola che collega le due camere che permette soluzione entrare alla L-camera. Chiudere la valvola e dispensare che le tracce di soluzione torna alla camera di H.</li>
		<li>Infine, dispensare la soluzione di 3,5% per la camera da L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accendere l'agitatore magnetico (la velocità di stir non è critica, ma esso dovrebbe garantire la corretta miscelazione delle soluzioni pesanti e leggeri), aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica. Permettono le soluzioni di gel di fluire tra la piastra di vetro e alluminio, la portata dovrebbe essere di circa 0,5 mL/min. L'ago deve essere sopra il liquido tutto il tempo, può essere collegato alla parte superiore della lastra di vetro con un nastro.</li>
	<li>Quando le camere H e L sono svuotati, riempirli con acqua ultrapura e permettere all'acqua di delicatamente overlay sulla superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa 1-2 ore a TA.</li>
	<li>Preparare la soluzione di acrilammide 3% (vedi ricetta in tabella 1) per l'impilamento del gel a RT. Dispensare il gel d'impilamento in cima il gel polimerizzato separazione (prima del getto il gel d'impilamento, rimuovere l'acqua sovrapponendo la superficie del gel) e collocare un pettine di gel di campione tra il vetro e alluminio piastra evitando bolle d'aria.<ol>
<li>Lasciare per polimerizzare 30-60 min a RT. Remove il pettine delicatamente sotto l'acqua ultrapura. Memorizzare il gel a + 4 ˚ c. Punto di pausa. Il gel può essere conservato a + 4 ˚ c per pochi giorni. Il gel dovrebbe essere mantenuto in condizioni di umidità per evitare l'essiccamento dei pozzi e la superficie del gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thylakoid solubilizzazione1,2,3
Nota: Tutte le procedura deve essere eseguita sotto luce molto fioca. Mantenere i campioni e buffer sul ghiaccio.
<ol><li>Diluire tilacoidi isolato con gelida 25BTH20G buffer per una concentrazione di clorofilla finale di 1 mg/mL. Per analisi 2D-BN-SDS-PAGE circa 4-8 µ g di clorofilla / campione è adatto. Nota: I tilacoidi utilizzati negli esperimenti devono essere isolati dalle foglie fresche (per protocollo di isolamento tilacoide, Vedi3)</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di tampone detergente, cioè, 2% β-DM (w/v) o 2% della digitonina (w/v). Mescolare il detersivo per il campione di thylakoid delicatamente con la punta della pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. La concentrazione finale del detergente è 1% e quella dei tilacoidi 0,5 mg Chl/mL.<ol>
<li>Solubilizzare i tilacoidi per 2 min su ghiaccio (β-DM) o 10 minuti a RT con continua miscelazione delicata su un bilanciere/shaker (digitonina). Nota: Digitonina e β-DM sono generalmente utilizzati per la solubilizzazione dei complessi della proteina thylakoid. Se vengono utilizzati altri detergenti non ionici, la concentrazione di detersivo e il tempo di solubilizzazione deve essere ottimizzate prima. Solitamente l'intervallo di concentrazione detergente da 0,5% - 5% (v/v). Attenzione: Digitonina è tossica, indossare indumenti protettivi e guanti</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il materiale insolubilized mediante centrifugazione a 18.000 x g per 20 min, a + 4 ˚ c.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 1/10 (v/v) di buffer di CBB al campione. Nota: Quando viene esaminata la composizione dei complessi proteici della membrana tilacoide, determinare il rendimento e il dominio di thylakoid rappresentato della frazione solubilizzata è raccomandato. Per determinare il rendimento del materiale solubilizzato, prendere 5 µ l del surnatante ad un nuovo tubo (prima di aggiungere di CBB) e misurare il contenuto di Chl e Chl un / b rapporto5.</li>
</ol>3. BN-PAGE1,2,3
<ol><li>Impostare il gel per un sistema di elettroforesi verticale (ad es., Hoefer SE 250). Riempire l'alloggiamento superiore del buffer con il catodo blu tampone (Vedi tabella 1) e versare il buffer di anodo per la camera di buffer inferiore.</li>
	<li>Caricare un esempio di thylakoid (ad es., 5 µ g di clorofilla) nei pozzetti.</li>
	<li>Avviare l'elettroforesi e gradualmente aumentare la tensione: 75 V per 30 min, 100 V per 30 min, 125 V per 30 min, 150 V per 1 h e 175 V fino ai complessi sono stati separati completamente. Eseguire il gel a + 4 ° c, utilizzando una cella frigorifera o regolazione della temperatura di gel con un sistema di raffreddamento. Nota: Modificare il buffer di catodo blu a un buffer di catodo chiaro quando la parte anteriore del campione ha migrato circa un terzo del gel.</li>
	<li>Dopo la corsa elettroforetica, scansione il gel con uno scanner per l'archiviazione di immagini.</li>
</ol>4. 2D-SDS-PAGE
<ol><li>Assemblare il sistema di elettroforesi verticale (dimensioni dei gel 16 cm x 20 cm). Utilizzare distanziatori di 1 mm.</li>
	<li>Preparare gli standard del gel di SDS (12% di acrilammide, 6 M Urea, vedi ricetta nella tabella 2) con un 2D-pettine (singolo grande bene per la strip e un pozzetto standard per marcatore di peso molecolare).</li>
	<li>Tagliare la corsia da BN-gel e inserirlo in un tubo (5 mL). Aggiungere 2 mL di tampone di Laemmli (contenente 5% β-mercaptoetanolo) ed incubare la striscia per 45 minuti con agitazione delicata a TA.</li>
	<li>Posizionare la corsia, con l'aiuto di ad esempio, un distanziatore, sulla superficie del gel, evitando bolle d'aria.</li>
	<li>Pipettare 5 µ l di marcatore di peso molecolare su un pezzo di carta da filtro e posto la carta per lo standard ben stretto.</li>
	<li>Per sigillare la striscia BN-gel e la carta di marcatore, versare 0,5% di agarosio (in tampone di corsa) sopra la striscia di gel e lasciare solidificare.</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi secondo protocolli standard. Dopo l'esecuzione l'elettroforetica, visualizzare le proteine con ad es., macchia Sypro Ruby o macchiatura secondo6d'argento.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l'analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l'analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.
Per la...

Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b6f e dell'atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell'analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della proteina complessi1, ma più successivamente è stato personalizzato per la separazione dei complessi della proteina dalla membrana tilacoide rete3. Il metodo è adatto (i) per la purificazione dei complessi della proteina thylakoid individuali per l'analisi strutturale, (ii) per determinare interazioni natali tra complessi proteici e (iii) per l'analisi dell'organizzazione complessiva dei complessi proteici Dopo aver cambiato il stimoli ambientali.
Prima della separazione, complessi proteici sono isolati dalla membrana con detergenti non ionici attentamente selezionate, che sono generalmente lievi e preservare la struttura nativa dei complessi proteici. Detersivi contengono idrofobo e idrofilici siti e micelle stabile forma sopra una certa concentrazione, chiamato una concentrazione micellare critica (CMC). Aumento della concentrazione di detersivo sopra i risultati di CMC in rottura delle interazioni lipido-lipidico e la solubilizzazione dei complessi della proteina. La scelta di detersivo dipende sulla stabilità della proteina complessa di interesse e la capacità di solubilizzazione del detergente. Ordinariamente usati detergenti sono α/β-dodecil-maltoside e digitonina. La solubilizzazione dei complessi della proteina nel loro stato nativo, materiale insolubile viene rimosso mediante centrifugazione. Nelle piante superiori, la membrana tilacoide è altamente eterogeneo in struttura e alcuni detersivi (ad es., digitonina) solubilizzano selettivamente solo una specifica frazione della membrana3. Pertanto, per caratterizzare l'organizzazione complessa di proteine o le interazioni tra i complessi di proteine, è cruciale determinare sempre la capacità di solubilizzazione del detergente scelto attraverso la determinazione del contenuto di clorofilla e la clorofilla a/b rapporto del surnatante per valutare il rendimento e il dominio rappresentato thylakoid (sub), rispettivamente, della frazione solubilizzata. Il rapporto di clorofilla a/b in tilacoidi intatto di crescita-luce acclimatati piante è in genere intorno alle 3, mentre il chl un / valore b di thylakoid frazioni arricchite in grana o stroma tilacoidi scende di sotto (~ 2,5) o superiore (~ 4,5) al valore del totale tilacoidi, rispettivamente.
Per fornire la carica negativa per i complessi di proteine, colorante (CBB) azzurro brillante di Coomassie è aggiunto al campione solubilizzato. A causa dello spostamento di carica, complessi proteici migrano verso l'anodo e sono separati su una pendenza di acrilamide (AA) secondo la loro forma e la massa molecolare. Separazione efficace e ad alta risoluzione si ottiene utilizzando un gradiente di concentrazione di acrilammide lineare. Durante l'elettroforesi, i complessi di proteine migrano verso l'anodo fino a quando essi raggiungono il loro limite di dimensione dei pori dipendente dalla dimensione. Il formato del poro del gel di poliacrilammide dipende da (i) il totale acrilammide /bis- acrilammide concentrazione (T) e (ii) il cross-linker bis- acrilammide monomero concentrazione (C) riguardante i monomeri totale4. Dopo la separazione con BN-PAGE, i complessi di proteine possono essere ulteriormente suddivisi in loro subunità proteiche individuali di seconda dimensione (2D) - SDS - PAGE. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di complessi di proteine di membrana tilacoide da BN-pagina/2D-SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Acido 6-aminocaproico (ACA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide (AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>Attenzione: Neurotossico!</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio (NaF)</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sale disodico</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>Attenzione:Tossico!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (Persolfato di ammonio)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetrametiletilendiammina)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-Metilene)-Bis-acrilammide</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore di proteine predefinite, ampia gamma (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, provette da centrifuga coniche 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Doppia ruota in gel con piastre da 10 x 8 cm</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Creatore di gradienti SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori a T da 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>Pettine per gel per campioni, 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi verticale Mighty Small SE250</td> Pompa IPC <td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Centrifuga PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Rocker-Shaker</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><<tr><td>br/> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Catena di trasporto fotosintetiche dell'elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell'energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall'acqua a NADP+ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e dell'atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall'integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l'analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l'analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.

Un sistema rappresentativo di 2D-BN/SDS-PAGE nella Figura 1 viene illustrato la separazione della digitonina e complessi della proteina β-DM-solubilizzato thylakoid e loro composizione in subunità della proteina dettagliate. Il modello complesso della proteina di digitonina solubilizzata tilacoidi (gel orizzontale in alto a sinistra sulla cima di Figura 1A) contiene PSII-LHCII-PSI megacomplex, due grandi supercomplessi di PSII-LH...

Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione e l'organizzazione dinamica dei complessi proteici fotosintetici nella membrana tilacoide delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi delle interazioni funzionali tra complessi proteici nativi e chiarisce la plasticità dell'organizzazione complessa proteica in diverse condizioni ambientali. Impostare la seghettatrice in gel di otto centimetri per piastre di 10 centimetri secondo le istruzioni del produttore utilizzando distanziale da 0,75 millimetri.Posizionare un miscelatore sfumato su una piastra di agitazione e collegarlo alla pompa peristaltica mediante tubi. Attaccare un ago della siringa all'altra estremità del tubo e posizionare l'ago tra il vetro e la piastra di alluminio. Posizionare un agitatore magnetico nella camera pesante.Preparare soluzioni di acrilammide al 3,5% e al 12,5% in tubi di centrifuga conica da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo da utilizzare per il gradiente del gel di separazione. Per evitare una polimerizzazione inteme mantenere i tubi di centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni. Aggiungere 5%APS e TEMED subito prima di pippetting le soluzioni al mixer sfumato.Pipettare le soluzioni al 12,5% alla camera pesante. Rimuovere le bolle d'aria dal canale che collega la camera leggera e pesante aprendo la valvola che collega le due camere consentendo alla soluzione di entrare nella camera luminosa. Chiudere la valvola e pipettare le tracce di soluzione alla camera pesante.Infine, pipettare la soluzione al 3,5% alla camera luminosa. Accendere l'agitatore magnetico. Aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica.Consentire alle soluzioni in gel di fluire tra il vetro e la piastra di alluminio a una portata di circa 0,5 millilitri al minuto. L'ago deve essere sempre sopra il liquido. Quando le camere pesanti e leggere si sono svuotate riempirle di acqua ultrapura.E lasciare che l'acqua sovrapponga delicatamente la superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa una o due ore a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di acrilammide al 3% per il gel impilabile a temperatura ambiente.Pipettare il gel impilamento sopra il gel di separazione polimerizzato e posizionare un pettine di gel campione tra il vetro e la piastra di alluminio evitando bolle d'aria. Dopo aver permesso al gel di polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il pettine sotto acqua ultrapura. A questo punto il gel può essere conservato a quattro gradi Celsius positivi in condizioni umidi per alcuni giorni.Diluire i thylakoidi isolati con tampone ghiacciato 25BTH20G a una concentrazione finale di clorofilla di un milligrammo per millilitro. Preparare due tubi per ogni campione di tilacoide per eseguire la solubilizzazione sia beta-DM che digitonina. Ora aggiungi un volume uguale di tampone detergente.Mescolare delicatamente il detersivo e il campione di thylakoid con una pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. Solubilizzare i thylakoids per due minuti sul ghiaccio per la solubilizzazione in beta-DM. Oppure 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione delicata continua su un rocker o uno shaker per la solubilizzazione della digitonina.Dopo l'incubazione, rimuovere il materiale insolubilizzato mediante centrifugazione a 18.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius positivi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 1/10 di volume di tampone blu brillante Coomassie al campione. Impostare il gel in un sistema di elettroforesi verticale.Riempire la camera tampone superiore con tampone catodico blu e versare il tampone anodo nella camera tampone inferiore. Caricare i campioni di tilacoide nei pozzi. Avviare l'elettroforesi e aumentare gradualmente la tensione elencata nel protocollo di testo.Eseguire il gel a quattro gradi Celsius positivi utilizzando una stanza fredda o regolando la temperatura del gel con un sistema di raffreddamento. Cambiare il buffer del catodo blu in un tampone catodo chiaro quando il fronte del campione è migrato circa 1/3 del gel. Dopo l'esecuzione elettroforetica eseguire la scansione del gel con uno scanner fotografico per l'archiviazione delle immagini.Per eseguire 2-SDS PAGE assemblare il sistema di elettroforesi verticale utilizzando distanziali di un millimetro. Preparare un gel SDS standard con un pettine 2D come descritto nel protocollo di testo. Tagliare la corsia dal gel BN e posizionarla in un tubo da cinque millilitri.Quindi aggiungere due millilitri di tampone Laemmli e incubare la striscia per 45 minuti con tremori delicati a temperatura ambiente. Posizionare la corsia con l'aiuto di un distanziale sopra il gel evitando bolle d'aria. Pipettare cinque microlitri di marcatore di peso molecolare su uno stretto pezzo di carta da filtro e posizionare la carta nel pozzo standard.Per sigillare la striscia di gel BN e la carta marcatore versare uno 0,5% di agarosio nel tampone di corsa sopra la striscia di gel e consentirgli di solidificarsi. Eseguire l'elettroforesi secondo i protocolli standard. Dopo la corsa elettroforetica visualizzare le proteine con colorazione SUPRO Ruby o colorazione argento.Qui sono riportati i risultati rappresentativi dei modelli complessi di proteine tilacoidi di campioni beta-DM e solubilizzati con digitonina. I piccoli complessi migrano più velocemente durante la corsa elettroforetica e si trovano quindi nella parte inferiore del gel. Mentre i grandi complessi si trovano nella parte superiore del gel.La digitonina generalmente conserva i complessi proteici in gruppi più grandi, mentre il beta DM interferisce con le interazioni proteina-proteina labile tra i complessi. Qui viene presentata la composizione subunità dei complessi proteici dei tilakoidi beta-DM e solubilizzati in digitonina. Le sottounità di ogni complesso si trovano dalla linea verticale sotto il complesso allineato.In linea di principio, ogni punto nel gel 2D rappresenta una singola proteina. Ma in pratica, diverse proteine della stessa massa molecolare possono essere presenti in un singolo punto. L'identificazione delle macchie si basa sull'analisi della spettrometria di massa.Dopo aver applicato questa procedura si può continuare con altri metodi come la microscopia elettronica e l'analisi di singole particelle dei complessi proteici eluitati dal gel nativo blu al fine di ottenere intuizioni strutturali sui complessi proteici. Per identificare subunità proteiche sconosciute le singole macchie proteiche da SDS PAGE bidimensionali possono essere analizzate con specifiche di massa. Non dimenticare che lavorare con acrilammide e digitonina può essere estremamente dannoso e precauzioni come indossare guanti protettivi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

In questo video, dimostriamo una tecnica elettroforetica, chiamata blue native PAGE, per l'analisi di complessi proteici respiratori mitocondriali nel loro stato nativamente ripiegato e funzionalmente attivo. Il colorante blu anionico Coomassie fa sì che i complessi proteici si carichino negativamente, consentendo la separazione in base alle dimensioni e alla struttura.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu: una tecnica di separazione non denaturante per l'analisi di complessi di catene respiratorie mitocondriali intatti

Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l'analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

Questo protocollo descrive come preparare ed eseguire l'elettroforesi di intrappolamento della frazione liquida eluita in gel nativo chiaro (CN-GELFrEE), una tecnica di separazione nativa per assemblaggi biomolecolari non covalenti e proteine da campioni eterogenei compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine a valle.

CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

Qui presentiamo un protocollo per separare solubilizzate thylakoid complessi mediante elettroforesi in Gel verde nativo. Gel verde bande successivamente sono caratterizzati da tempo correlato Single Photon Counting (TCSPC) e vengono forniti i passaggi base per l'analisi dei dati.

Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

Questo protocollo dimostra l'analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide nativo blu. Qui è descritto il metodo applicato alle cellule umane coltivate.

Analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in cellule umane coltivate mediante elettroforesi in Gel di poliacrilammide nativo blu e Immunoblotting

Qui presentiamo un protocollo per estrarre, risolvere e identificare i supercomplessi mitocondriali che minimizzano l'esposizione ai detergenti e a Coomassie Blue. Questo protocollo offre un equilibrio ottimale tra la risoluzione e la conservazione delle attività enzimatiche, riducendo al minimo il rischio di perdere le interazioni proteina-proteina labile.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Le proteinasi sono vitali per la patogenesi batterica, consentendo l'invasione e l'evasione immunitaria. L'estrazione in un'unica fase delle proteine citoplasmatiche e di membrana dei batteri nella loro forma attiva è straziante. Questo articolo video mostra l'estrazione di intere proteine cellulari di Leptospira per l'analisi zimografica per rilevare e caratterizzare le gelatinasi.

Estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche

Impara ad analizzare i complessi proteici dei tilacoidi vegetali mediante elettroforesi nativa blu (BN-PAGE) e SDS-PAGE bidimensionale. Questo metodo ottimizzato per Arabidopsis thaliana rivela l'organizzazione dinamica dei complessi fotosintetici.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Esplora altri video