Name: Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dellossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri la sintesi di nanoparticelle di ossido di cerio per lo scavenging catalitico delle specie reattive dell'ossigeno in vivo in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di segnalazione e tolleranza allo stress nelle piante.

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Questo lavoro è stato supportato dalla University of California, Riverside e USDA National Institute of Food e agricoltura, progetto portello 1009710 a J.P.G. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant n. 1817363 per J.P.G.

1. coltivazione di piante di a. thaliana
<ol><li>Seminare i semi di a. thaliana in vasi monouso 5 cm x 5 cm, riempito con miscela di suolo standard. Mettere 32 di questi vasi in un vassoio di plastica riempito con acqua (~ 0,5 cm di profondità) e trasferire il vassoio di plastica con le piante in una camera di crescita della pianta.<ol>
<li>Impostare la crescita camera impostazioni come segue: 200 µmol/ms radiazione fotosintetica attiva (PAR), 24 ± 1 ° C giorno e notte di ± 1 ° C 21, 60% di umidità e regime di luce giorno/notte 14/10 h, rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sottile ogni pentola per lasciare solo un singolo impianto dopo una settimana di germinazione. Prendere nota per mantenere le piantine con dimensioni simili in ogni pentola.</li>
	<li>Acqua i vasi versando dell'acqua di rubinetto direttamente sul vassoio di plastica una volta ogni due giorni. Coltivare le piante per quattro settimane. A. thaliana piante sono pronte per un ulteriore uso.</li>
</ol>2. sintesi e caratterizzazione di PNC
<ol><li>Pesare 1,08 g di nitrato di cerio (III) e dissolverlo in 2,5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Pesare 4,5 g di acido poli (acrilico) e scioglierla in 5 mL di acqua di grado di biologia molecolare in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Mescolare le due soluzioni accuratamente a 2.000 rpm per 15 min usando un miscelatore vortex digital.</li>
	<li>Trasferimento di 15 mL di soluzione di idrossido di ammonio (7,2 M) in un becher di vetro di 50 mL.</li>
	<li>Mescolando a 500 giri/min, aggiungere la miscela da Step 2.3 goccia a goccia la soluzione di idrossido di ammonio e mescolare a 500 giri/min a temperatura ambiente per 24 ore in una cappa aspirante.</li>
	<li>Coprire il becher con un pezzo di carta per evitare la perdita sostanziale di soluzione durante la reazione durante la notte.</li>
	<li>Dopo 24 h, trasferire la soluzione risultante in una provetta conica da 50 mL e centrifugare esso a 3.900 x g per 1 h rimuovere eventuali residui possibili e grandi agglomerati.</li>
	<li>Trasferire questo 22,5 mL della soluzione surnatante in tre filtri di kDa 15 mL 10 e riempire il resto del filtro con acqua grado molecolare per fare una diluizione totale di 45 mL.</li>
	<li>Purificare il supernatante da polimeri gratis e altri reagenti con una centrifuga da banco aggiungendo il surnatante di un filtro di 15ml 10 kDa e centrifugare a 3.900 x g per 15 min. Ripetere questo passaggio almeno sei volte.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di eluente in ogni ciclo con uno spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm per non garantire polimeri gratis e altri reagenti sono presenti nella soluzione finale PNC.</li>
	<li>Prelevare la soluzione PNC raccolta nella siringa da 5 mL e filtrarlo contro un 20 nm siringa filtrante di porosità. Raccogliere la soluzione filtrata PNC in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Prendere una soluzione diluita di PNC finale in una cuvetta di plastica e misurare l'assorbanza con lo spettrofotometro UV-VIS da 220-700 nm. Picco di assorbanza PNC è a 271 nm.</li>
	<li>Calcolare la sua concentrazione utilizzando la legge di Lambert-Beer: A = εCL. A è l'assorbanza del valore di picco per un dato campione, ɛ è il coefficiente di assorbimento molare di PNC (cm-1 M-1), L è la lunghezza del cammino ottico (larghezza cuvette, 1cm in questo metodo), e C è la concentrazione molare di nanoparticelle misurate.</li>
	<li>Misurare il diametro idrodinamico e potenziale zeta del PNC sintetizzato utilizzando una particella dimensione e zeta potenziale analyzer (Figura 1).</li>
	<li>Conservare la soluzione finale di PNC in frigorifero (4 ° C) fino al successivo utilizzo. Nota: Fare riferimento a Wu et al. 8 per ulteriori dettagli di protocollo sulla caratterizzazione di PNC.</li>
</ol>3. etichettatura PNC con colorante fluorescente DiI
<ol><li>Mescolare 0,4 mL di 5 mM (58 mg/L) PNC con 3,6 mL di biologia molecolare acqua di grado in un flaconcino di vetro da 20 mL e mescolare a 500 giri/min.</li>
	<li>Aggiungere 24 µ l 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine soluzione di perclorato colorante (DiI, 2,5 mg/mL; diluito in DMSO) in 176 µ l di DMSO (dimetilsolfossido) per rendere la soluzione di colorante DiI.</li>
	<li>Aggiungere il colorante DiI goccia a goccia la soluzione PNC, mescolando a 1.000 giri/min per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la miscela risultante in un filtro di kDa 15 mL 10 e riempire il tubo verso l'alto con acqua di grado di biologia molecolare per rendere la diluizione totale 15 mL.</li>
	<li>Purificare i DiI etichettati soluzione PNC (DiI-PNC) da DMSO e qualsiasi possibile libero DiI tintura da una centrifugazione di benchtop con il filtro di kDa 15 mL 10 a 3.900 x g per 5 min.<ol>
<li>Ripetere passo 3.5 almeno cinque volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrare le soluzioni DiI-PNC finale attraverso una siringa filtro dimensione di poro 20 nm.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di finale DiI-PNC mediante spettrofotometria UV-VIS e calcolare la sua concentrazione secondo la legge di Lambert-Beer (Figura 2). Per ulteriori informazioni, vedere passaggio 2.13.</li>
	<li>Conservare in frigorifero a 4 ° C per un ulteriore uso.</li>
</ol>4. infiltrazione di pianta lascia con PNC
<ol><li>Aggiungere 0,1 mL di infiltrazione (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl) del buffer in 0,9 mL di soluzione PNC o DiI-PNC di 0,5 mM e vortice si. Utilizzare una soluzione di tampone 10 mM TES infiltrazione come controllo negativo.</li>
	<li>Trasferire 0,2 mL di soluzione di infiltrazione PNC o DiI-PNC a una siringa senza ago sterile da 1 mL. Toccare per rimuovere eventuali bolle d'aria possibile.</li>
	<li>Recuperare la pianta dalla camera di crescita poco prima di infiltrazione con nanoparticelle per evitare possibili stomi chiusura in condizioni di luce di camera.</li>
	<li>Prima di infiltrazione, è possibile misurare il contenuto di clorofilla da foglie di a. thaliana con dimensioni simili utilizzando un misuratore di clorofilla. Misurare ogni foglia con tre repliche (ogni replica che consiste di almeno tre misurazioni)14. Scegliere che fogli di a. thaliana con simile contenuto di clorofilla per l'esperimento di infiltrazione.</li>
	<li>Si infiltrano le foglie lentamente con la soluzione preparata di PNC o DiI-PNC premendo delicatamente la punta della siringa senza ago contro il fondo della lamina foglia (abbagliai lato) e premere il pistone (Figura 3A).</li>
	<li>Delicatamente pulire fuori la soluzione in eccesso che rimane sulla superficie della lamina foglia (Figura 3B) utilizzando un pulitore delicato compito (Figura 3C) e l'etichetta della pianta. Utilizzare nuovo delicato compito salviette per ogni gruppo di foglie.</li>
	<li>Tenere l' infiltrato a. thaliana piante in panchina per l'adattamento di foglia e incubazione con PNC o DiI-PNC per 3 h. Nota: Infiltrati a. thaliana piante sono quindi pronti per un ulteriore uso (Figura 3D).</li>
</ol>5. preparazione dei campioni di foglia per microscopia confocale
<ol><li>Rotolo è un pisello di dimensioni quantità di osservazione del gel per circa un raggio di 1 cm (Figura 4A) e poi stenderlo fino a 1 mm sottile su un vetrino (Figura 4B).</li>
	<li>Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,3 cm) per tagliare una sezione circolare al centro del gel osservazione su vetrino (Figura 4C).</li>
	<li>Riempire il taglio ben interamente con perfluorodecalina (PFD) per la risoluzione di imaging più profonda e meglio confocale nei tessuti fogliari.</li>
	<li>Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dall'adattato DiI-PNC infiltrato a. thaliana pianteD(Figura 4).</li>
	<li>Montare il disco di foglia in PFD riempito bene; affrontare l'infiltrato (abbagliai) lato della foglia.</li>
	<li>Mettere un coprioggetto quadrato sopra il disco di foglia e premere delicatamente il vetrino coprioggetti diapositiva in modo uniforme a sigillare con il pozzo del gel di osservazione e garantire che bolle d'aria non rimangano intrappolati (Figura 4E).</li>
</ol>6. imaging DiI-PNC nei tessuti fogliari di microscopia confocale
<ol><li>Utilizzare un obiettivo obiettivo 40 X in un laser invertito microscopio confocale a scansione.</li>
	<li>Goccia di due a tre gocce di ddH2O nella parte superiore della lente dell'obiettivo X 40.</li>
	<li>Posizionare il vetrino preparato di DiI-PNC infiltrato foglia campione in cima l'invertito 40x lente obiettiva.<ol>
<li>Assicurarsi che il lato del vetrino coprioggetto ma non il vetro in contatto direttamente con il ddH2O di scivolare sulla lente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trovare un'area di interesse nel campione al microscopio con luce laser o campo luminoso.</li>
	<li>Avviare il software di microscopio e accendere il laser di Argon (fissato al 20%).</li>
	<li>Impostare il foro stenopeico per raccogliere una fetta ottico a meno di 2 µm e una media di linea di 4.</li>
	<li>Immagine per il campione con le impostazioni al microscopio confocale: eccitazione di 514 nm laser (30%); Spessore della sezione Z-Stack: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (per l'imaging di DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (per l'imaging del cloroplasto).</li>
	<li>Prendere immagini confocal rappresentativi di campioni di foglia da individui differenti, un minimo di tre replicati biologici.</li>
</ol>7. imaging PNC in vivo ROS Scavenging mediante microscopia confocale
<ol><li>Preparare 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, un colorante per indicare un generale ROS) e 10 µM diidroetidio (DHE, un colorante per indicare l'anione superossido) coloranti nel buffer di infiltrazione di TES (pH 7,5) in provette microcentrifuga da 1,5 mL, separatamente.</li>
	<li>Utilizzare un trivellatore di sughero (diametro 0,2 cm) per raccogliere foglia dischi dal PNC adattato infiltrato piante di a. thaliana .<ol>
<li>Utilizzare la punta tagliente delle pinze per fare tre o quattro fori sui dischi foglia per accelerare il processo di caricamento di tintura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferimento la foglia dischi per microcentrifuga con H2DCFDA e DHE separatamente ed incubare per 30 min sotto buio.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, sciacquare la foglia dischi con ddH2O tre volte e Monte nel bicchiere scivolare con osservazione gel (Vedi protocollo sezione 5).</li>
	<li>Mettere il vetrino sul microscopio confocale e mettere a fuoco manualmente a un'area di celle mesofillo foglia. Per dettagli, vedere la sezione protocollo 6.</li>
	<li>Esporre i dischi di foglia per i raggi UV-A (405 nm) laser per 3 min generare ROS e registrare il cambiamento di intensità del segnale ROS in serie temporali ("xyt") per disco foglia.</li>
	<li>Il disco di foglia con impostazioni di microscopio confocale immagine: 40 X acqua obiettivo; eccitazione di laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (per DHE e DCFDA tintura rilevamento); PMT2: 700-800 nm (per il rilevamento di cloroplasti). Utilizzare un impianto infiltrato con solo soluzione tampone di infiltrazione come controllo negativo.</li>
</ol>8. PNC Scavenging di H2O2in vitro
<ol><li>Condurre le attività mimetica CAT (catalasi) sintetizzato PNC in vitro di seguendo i metodi in precedenti pubblicazioni3,8,15
</li>
	<li>Aggiungere 45,4 µ l di 1 x TES infiltrazione tampone (10 mM TES, 10mm MgCl2, pH 7.5, regolata da HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) in un pozzo (piastra di fondo tondo bianco 96 bene) e mescolare delicatamente pipettando.</li>
	<li>Aggiungere 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine (lavoro concentrazione 100 µM, 0,5 µ l) e perossidasi di rafano (HRP; concentrazione di lavoro 0.2 U/mL, 0,1 µ l) nel pozzo, delicatamente mescolare pipettando e incubare per 30 min. 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagisce con H2O2 e viene convertito in Resorufina in presenza di HRP.<ol>
<li>Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce durante l'incubazione.</li>
		<li>Preparare un controllo negativo con tampone di reazione o acqua per sostituire H2O2.</li>
		<li>Fatta eccezione per la soluzione di riserva, preparare tutte le altre soluzioni a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'incubazione, con un lettore di piastra, monitorare l'assorbanza a 560 nm a utilizzare Resorufina per indicare il livello di H2O2. Regime di tempo impostato a 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.</li>
</ol>

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<li>Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis+under+drought+and+salt+stress%3A+regulation+mechanisms+from+whole+plant+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell.</a> Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo protocollo, descriviamo PNC sintesi, caratterizzazione, colorante fluorescente etichettatura e la formazione immagine confocal delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo di pianta per esibire la loro attività lavaggio in vivo ROS. PNC sono sintetizzati da una miscela di nitrato di cerio e PAA soluzione in idrossido di ammonio. PNC sono caratterizzati da spectrophotomery di assorbimento e la concentrazione determinata usando la legge di Lambert-Beer. Misure di potenziale Zeta ha confer...

Nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) sono ampiamente usate negli organismi viventi, dalla ricerca di base alla bioingegneria, dovuto la loro specie distinte catalitica reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging capacità1,2,3. Nanoceria avere ROS scavenging capacità a causa di un gran numero di posti vacanti di superficie ossigeno che si alternano tra due ossidazione stati (Ce3 + e Ce4 +) 4,5,6. I legami pendenti Ce3 + puliscono efficacemente ROS mentre i ceppi della grata su nanoscala promuovono la rigenerazione di questi siti difetto via redox che ciclano reazioni7. Nanoceria sono stati recentemente utilizzati anche per lo studio e ingegneria impianto funzione8,9. Piante sotto stress abiotici verificano accumulo di ROS, causando il danno ossidativo dei lipidi, proteine e DNA10. In impianti di a. thaliana , nanoceria catalitica scavenging dei ROS in vivo conduce alla fotosintesi delle piante migliorate sotto alta luce, calore e agghiacciante sottolinea8. Nanoceria l'applicazione al suolo anche aumenti sparare resa biomassa e grano di frumento (Triticum aestivum)11; piante di colza (Brassica napus) trattate con nanoceria hanno maggiore biomassa vegetale sotto stress sale12.
Nanoceria offrire bioingegneri e pianta biologi uno strumento basato su nanotecnologie per comprendere le risposte di stress abiotici e migliorare la tolleranza di pianta stress abiotici. In vivo ROS scavenging funzionalità di Nanoceria sono indipendenti di specie vegetali, e la consegna facile nei tessuti vegetali ha il potenziale per consentire ampia applicazione all'esterno di organismi modello. A differenza di altri metodi basati su geneticamente, nanoceria non richiedono generatrici che pianta con la sovraespressione di enzimi antiossidanti per maggiore ROS scavenging capacità13. Infiltrazione della lamina foglia di nanoceria alle piante è un approccio pratico per ricerche di laboratorio.
L'obiettivo generale del presente protocollo è per descrivere 1) la sintesi e caratterizzazione di carica negativa poli (acrilico) acido nanoceria (PNC), 2) la consegna e il rilevamento di PNC in tutto cellule di foglia e 3) il monitoraggio del PNC-attivata ROS scavenging in vivo. In questo protocollo, caricate negativamente poli (acrilico) acido nanoceria (PNC) vengono sintetizzati e caratterizzati da loro spettro di assorbimento, diametro idrodinamico e potenziale zeta. Descriviamo un metodo di infiltrazione della lamina semplice foglia per consegnare PNC in pianta tessuti fogliari. Per l'imaging in vivo della distribuzione delle nanoparticelle all'interno delle cellule del mesofillo, un colorante fluorescente (DiI) è stato utilizzato per etichettare PNC (DiI-PNC) e osservare le nanoparticelle tramite microscopia a fluorescenza confocale. Infine, spieghiamo come monitorare in vivo PNC ROS scavenging attraverso microscopia confocale.

Acqua di grado <table><tbody>di biologia molecolare <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>238538-100G</td><td></td> <td>nitrato di cerio (III</td></tr><tr><td>), Corning</td><td>VWR</td><td>45001-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Provette Centrifughe Coniche</td><td>VWR</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Poly (acido acrilico) 1.800 Mw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore Vortex Digitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore Vortex Digitale Accessorio, Fermo</td><td>Inserto Fisher Scientific</td><td>02-215-391</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore digitale a vortice Accessori: Set di inserti in schiuma</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-395</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05002-1L</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Bicchieri di grifone, graduati, Corning</td><td>VWR</td><td>13912-149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic</td><td>IKA</td><td>3810001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge 5424</td><td>VWR</td><td>80094-126</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifughe</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Allegra serie X-30 Centrifuga da banco</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06314</td><td></td></tr><tr><td>UV-2600 Sptecrofotometro</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2600 120V</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Whatman Anotop 10</td><td>Siringhe monouso Sigma-Aldrich</td><td>WHA68091102</td><td></td></tr><tr><td>BD con punte Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano S</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zen 1600</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42364-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1 LC1 Green</td><td>Island Distributors, Inc</td><td>5212601.CFL080P</td><td></td></tr><tr><td>Adaptis 1000</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td></td></tr><tr><td>TES, >99% (titolazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Siringa Norm-Ject interamente in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per compiti delicati</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Carolina Observation Gel</td><td>Carolina</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Corning, smerigliati su un lato, un'estremità</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer Set con manici</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50166A</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorodecalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900-25G</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, quadrato, n. 1</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscopio confocale a scansione laser TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>2&prime;,7&prime;-diclorofluorescina diacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Diidroetidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette per microcentrifuga premium: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette Eppendorf Uvette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z605050-80EA</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di clorofilla&nbsp;</td><td>Konica Minolta</td><td>SPAD-502</td><td></td></tr></tbody></table>

lo scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie in vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

L'accumulo di ossigeno reattivo specie (ROS) è un marchio di garanzia di risposta piante a stress abiotici. ROS giocano un duplice ruolo nelle piante agendo come molecole a bassi livelli di segnalazione e molecole ad alti livelli dannosi. Accumulo di ROS in piante stressati può danneggiare metaboliti, enzimi, lipidi e DNA, causando una riduzione della crescita delle piante e la resa. La capacità di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) di pulire cataliticamente ROS in vivo fornisce un unico strumento per comprendere e bioingegnere pianta stress abiotici tolleranza. Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare e caratterizzare poli (acrilico) acido nanoceria rivestito (PNC), le nanoparticelle con piante tramite infiltrazione della lamina foglia di interfaccia e monitorare la loro distribuzione e ROS lo scavenging in vivo mediante confocale microscopia. Corrente strumenti molecolari per la manipolazione di accumulo di ROS nelle piante sono limitati a specie modello e richiedono metodi di trasformazione laboriosa. Questo protocollo per in vivo lo scavenging ROS ha il potenziale per essere applicato a tipo selvaggio piante con foglie larghe e struttura foglia come Arabidopsis thaliana.

Caratterizzazione e sintesi PNC . PNC sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati seguendo il metodo descritto nel protocollo sezione 2. Figura 1 A Mostra la colorazione delle soluzioni di nitrato di cerio, PAA, la miscela di nitrato di cerio e PAA e PNC. Un cambiamento di colore da bianco a giallo chiaro è visto dopo PNC è sintetizzato. Dopo la purificazione con un filtro 10 kDa, PNC son...

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) dei ROS (specie reattive dell'ossigeno) lo scavenging in vivo, nanoceria imaging nei tessuti vegetali e microscopia confocale in vivo monitoraggio di nanoceria ROS scavenging mediante microscopia confocale.

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

La capacità delle nanoparticelle di ossido di cerio di eliminare cataliticamente le specie reattive dell'ossigeno in vivo fornisce uno strumento unico per comprendere e ingegnerizzare i meccanismi di segnalazione e tolleranza delle piante allo stress. Le specie reattive dell'ossigeno svolgono un ruolo chiave nelle piante agendo come molecole segnale a bassi livelli e molecole dannose ad alti livelli. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di essere applicata a diverse specie di piante di tipo selvatico con foglie larghe e struttura fogliare, come l'Arabidopsis thaliana.Dopo aver coltivato le piante di Arabidopsis thaliana, pesare 1,08 grammi di nitrato di cerio e scioglierlo in 2,5 millilitri di acqua di grado biologico in un tubo conico da 50 millilitri. Pesare 4,5 grammi di poliacido e scioglierlo in cinque millilitri di acqua biologica in un diverso tubo conico da 50 millilitri. Combina queste due soluzioni e poi usa un miscelatore a vortice digitale per mescolarle accuratamente a 2.000 giri/min per 15 minuti.In una cappa aspirante, trasferire 15 millilitri di una soluzione di idrossido di ammonio da 7,2 molari in un becher di vetro da 50 millilitri. Iniziare a mescolare a 500 giri/min e a temperatura ambiente. Aggiungere il nitrato di cerio e la miscela di poliacido goccia a goccia.Coprite il bicchiere con un foglio di carta per evitare perdite sostanziali della soluzione e lasciate agitare per 24 ore. Successivamente, trasferire la soluzione risultante in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare a 3, 900 volte g per un'ora per rimuovere eventuali detriti o agglomerati di grandi dimensioni.Quindi, trasferire il surnatante in tre filtri da 50 millilitri e 10 kilodalton. Riempire il resto di ciascun filtro con acqua di grado molecolare, ottenendo una diluizione totale di 45 millilitri. Centrifugare a 3, 900 volte g per 15 minuti.Ripeti questo processo almeno sei volte. Utilizzando uno spettrofotometro UV-vis, misurare l'assorbanza di ciascun eluente da 220 nanometri a 700 nanometri per garantire che non siano presenti polimeri liberi o altri reagenti nella soluzione PNC finale. Utilizzare una siringa da cinque millilitri per prelevare la soluzione PNC raccolta.Successivamente, filtrare la soluzione contro un filtro per siringa delle dimensioni di una siringa di 20 nanometri e raccogliere la soluzione filtrata in un tubo conico da 50 millilitri. Trasferire una soluzione finale di PNC diluita in una cuvetta di plastica e misurarne l'assorbanza da 220 nanometri a 700 nanometri. Utilizzando un misuratore di particelle, misurare il diametro idrodinamico del PNC sintetizzato, quindi conservare la soluzione finale di PNC in frigorifero a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Dopo aver etichettato il PNC con il colorante fluorescente DiI, trasferire 0,9 millilitri di una soluzione contenente 0,5 millimolari della soluzione PNC o della soluzione DiI-PNC in una provetta. Aggiungere 0,1 millilitri di tampone di infiltrazione e mescolare a vortici. Preparare un tampone di infiltrazione TES da 10 millimolari come controllo negativo.Quindi, trasferire 0,2 millilitri di campione e miscela tampone in una siringa sterile senza ago da un millilitro. Toccare per rimuovere eventuali bolle d'aria. Poco prima dell'infiltrazione, recupera la pianta dalla camera di crescita.Utilizzando un misuratore di clorofilla, misurare il contenuto di clorofilla nelle foglie di A. thaliana. Misurare ogni foglia con tre repliche come indicato nel protocollo di testo. Scegli foglie con un contenuto di clorofilla simile.Premere delicatamente la punta della siringa senza ago contro la parte inferiore della lamina fogliare e premere lo stantuffo per infiltrarsi nelle foglie. Usando un tergicristallo delicato, rimuovi delicatamente la soluzione in eccesso che rimane sulla superficie della lamina fogliare, quindi etichetta la pianta. Tenere le piante infiltrate sul banco a incubare per tre ore.Per prima cosa, posiziona una quantità di gel di osservazione delle dimensioni di un pisello su un vetrino, arrotola il gel e stendilo fino a raggiungere un diametro di circa due centimetri e uno spessore di un millimetro. Usando una trivella per sughero con un diametro di 0,3 centimetri, ritaglia una sezione circolare al centro del gel per creare un pozzo. Riempi completamente il pozzetto con PFD, che fornirà una risoluzione di imaging confocale più profonda e migliore.Quindi, usa una piralide da sughero con un diametro di 0,2 centimetri per raccogliere i dischi fogliari dalle piante di A.thaliana precedentemente infiltrate. Montare ogni disco fogliare in un pozzetto pieno di PFD con il lato infiltrato rivolto verso l'alto. Successivamente, posizionare un vetrino coprioggetti quadrato sopra il disco fogliare.Premere delicatamente e uniformemente sul vetrino coprioggetto per sigillare con il pozzetto del gel di osservazione e assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle d'aria. Per iniziare, preparare 25 micromolari di colorante H2DCFDA e 10 micromolari di colorante DHE in tampone di infiltrazione TES in provette per microcentrifuga separate da 1,5 millilitri. Utilizzando una piralide da sughero con un diametro di 0,2 centimetri, raccogliere i dischi fogliari dalle piante di A.thaliana adattate infiltrate da PNC.Usa la punta affilata della pinza per fare tre o quattro fori su ciascun disco fogliare per accelerare il processo di caricamento del colorante. Quindi, caricare una quantità uguale di dischi fogliari in ciascun tubo di colorante. Incubare al buio per 30 minuti.Successivamente, sciacquare tre volte i dischi fogliari con acqua distillata doppia. Utilizzare il gel di osservazione per montare ogni foglia su un vetrino come descritto in precedenza. Caricare il vetrino su un microscopio confocale e mettere a fuoco manualmente una regione di cellule del mesofillo fogliare come indicato nel protocollo di testo, quindi esporre i dischi fogliari a un laser UVA a 405 nanometri per tre minuti per generare ROS.Registra la variazione di intensità del segnale ROS in serie temporali per disco foglia. Immagine del disco fogliare utilizzando un obiettivo ad acqua 40X e le impostazioni del microscopio confocale mostrate qui. Utilizzare un impianto infiltrato con solo soluzione tampone di infiltrazione come controllo negativo.Dopo la purificazione, il PNC sintetizzato viene caratterizzato utilizzando uno spettrofotometro UV-vis e si vede avere un picco di assorbanza a 271 nanometri. Il processo di purificazione è confermato dalla misurazione dell'eluente finale. I campioni di PNC vengono quindi etichettati con un colorante fluorescente DiI per determinare la distribuzione delle nanoparticelle in vivo.Si osservano tre picchi per il PNC marcato con DiI, mentre una misurazione dell'eluente finale conferma che le sostanze chimiche non reagite vengono lavate via durante la purificazione. La distribuzione di DiI-PNC nelle cellule del mesofillo fogliare è determinata tramite imaging confocale. Sebbene non siano stati rilevati segnali di colorante DiI nei campioni di controllo, si osserva che il DiI-PNC è co-localizzato con cloroplasti nelle foglie infiltrate.Lo scavenging dei ROS in vivo abilitato dalla PNC viene monitorato nel disco fogliare misurando le variazioni di intensità della fluorescenza nei coloranti DHE e DCF. Dopo tre minuti di stress UV, le foglie infiltrate con PNC mostrano un'intensità significativamente inferiore per entrambi i tipi di colorante rispetto al controllo del tampone senza nanoparticelle. Un test dell'attività mimetica della CAT rivela una diminuzione del livello di resorufina nella miscela contenente PNC.Questo livello è indicativo del livello di perossido di idrogeno, che quindi è anch'esso in diminuzione, e conferma l'attività mimetica CAT del PNC sintetizzato. Questo protocollo per la sintesi di nanoceria è una procedura semplice e graduale che genera nanoparticelle di ossido di cerio con dimensioni, carica e capacità di evacuazione dei ROS controllate. I metodi di modificazione genetica delle piante per la manipolazione dei ROS in vivo sono attualmente limitati alle specie modello di piante.Al contrario, lo scavenging dei ROS di nanoceria ha il potenziale per essere applicato a diverse specie di piante di tipo selvatico sia in laboratorio che sul campo.

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